试剂是从Sigma-Aldrich购买的，没有进一步纯化 。寡核苷酸 ，DNA和RNA购自综合DNA技术（补充表7-10）
。通过使用纳米体ND-1000分光光度计测量测量来确定DNA和RNA的浓度。使用储存磷光筛选（GE Healthcare）和Typhoon 9400 Imager（GE Healthcare）可观察到放射性标记的蛋白质和核酸 。提供了无编工的凝胶和印迹图像（补充图1）
。 　　QβRNA（100-核苷酸RNA）和大肠杆菌RNAI的DNA模板通过PCR扩增（补充表9中列出了引物序列）
，并通过2％琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物，并使用Qiaquick PCR Purification Kit（Qiagen）纯化。在存在1×转录缓冲液（40 mM Tris ，pH 8.1
，1 mm杀虫剂，10 mM MGCL2 ，0.01％Triton X-100）的情况下，通过体外转录合成5'-三磷酸（PPP）QβRNA和RNAI
，通过体外转录合成 。（2 mg ml -1，在我们的实验室中纯化）和200 nm DNA模板。使用2 mM ATP和4 mM NAD在类似条件下进行NAD – RNAi
。除了使用2 mM ATP ，80μCI32P-α-ATP和4 mM NAD而不是4 mM ATP的混合物
，同样的条件被用于合成α-32p标记的5'-NAD和PPPQβRNA的混合物。将体外转录反应在37°C下孵育4小时，并用DNase I（Roche）消化 。通过变性页纯化RNA ，异丙醇的沉淀并重悬于Millipore水中
。RNA序列在补充表7中列出。 　　为了将5'PPP – RNA转化为5'-单磷酸– RNA（5'P-RNA）
，在1×多磷酸酶反应缓冲液中以37°C的1×多磷酸酶反应缓冲液在37°C中用60 U RNA 5'-磷酸酶（Epicenter）处理250 pmolQβRNA 。通过苯酚 - 氯仿提取从5'P -RNA中除去蛋白质，并通过三轮二乙基醚提取去除残留的苯酚 - 氯仿
。将5'p -rNA沉淀出异丙醇并重悬于Millipore水中。 　　我们在1倍反应缓冲液B中 ，用50 U T4聚核苷酸激酶和1,250μCI32P-γ-ATP处理了120 pmol 5'p-QβRNA或6.25 Nmol 5'p-RNA 8-MER（补充表7） 。将反应在37°C下孵育2小时
。通过苯酚 - 氯仿提取
，将所得的5'-32P-RNA 8-mer和5'-32p-QβRNA与残留蛋白分离。通过用三柱体积的Millipore水清洗剩余的32P-γ-ATP，并在4°C下以14,000 rpm的14,000 rpm洗涤10 kDa（用于QβRNA）或3 kDa（用于8-mer）的Amicon过滤器（Merck Millipore） 。RNA序列在补充表7中列出
。将纯化的5'-32P-RNA转换为5'-32P-NAD限制的RNA ，800 PMOL 5'-32P-RNA 8-MER或30 PMOL 5'-32P-QβRNA在50 mm MGCL2中孵育50 mM MGCL2
，在烟碱尖端的存在下，将其孵化。如所述52 ，在50°C下持续2小时 。通过用Millipore水洗涤RNA，在10 kDa（QβRNA）或3 kDa（8-mer）Amicon滤波器中以14,000 rpm的速度在4°C下纯化RNA。使用纳米体ND-1000分光光度计测量5'-32P-RNA的浓度
，并用于计算屈服的5'-NAD限制的32p-RNA的近似浓度，假设50％的咪唑啉反应的近似产率（参考
。52）。通过将8 µM 5'-32P-NAD – RNA 8-MER和0.08 µM ADP-ribosyl Cyclase CD38（R＆D Systems）在1×降解的37°C下孵育4 h 。通过P/C/I-二乙基醚提取和过滤通过3 kDa过滤器纯化反应 ，并用四柱体积的毫匹生水洗涤
。 　　To amplify bacteriophage T4 genes modA (GeneID: 1258568; Uniprot: P39421), modB (GeneID: 1258688; Uniprot: P39423) and alt (GeneID: 1258760; Uniprot: P12726), a single plaque from bacteriophage T4 revitalization was resuspended in Millipore水并用于“斑块 ” PCR
，类似于细菌颜色PCR。编码ADP-核糖基水解酶ARH1（GeneID：141; Uniprot：p54922）的基因是从IDT购买的，并被PCR放大 。大肠杆菌基因编码为RS1（GeneID：75205313; Uniprot：p0ag67） ，RL2（GeneID：947820; Uniprot：p60422）和pNPase（p60422）和pNPase（Geneid：geneid：947672; 947672; 947672; uniprot; uniprot; uniprot：p05055）colied colied colied a col-col-col-col-amplied at genompplied a genomic dna s ryomic dna sy col-demic k.基因细菌基因组DNA试剂盒（Sigma-Aldrich）
。补充表8列出了核苷酸序列。在使用适当的引物放大过程中引入了XHOI和NCOI限制位点（补充表9） 。将所得的PCR产物用Xhoi和NCOI（Thermo Fisher Scientific）消化
，并克隆到PET – 28C载体（Merck Millipore）中
。Sanger测序后，将所得的质粒转化为大肠杆菌一部分BL21（DE3）（Life Technologies）。ARH1 D55,56A ，MODB（R73A）和RS1突变体是使用基于陷阱站点定向的诱变试剂盒（Thermo Scientific）的方法通过定点诱变产生的 。将所得的质粒测序并转化为大肠杆菌一射击BL21（DE3）
。补充表10总结了这项工作中使用和生成的所有菌株。 　　异丙基β-硫代乳乳糖苷（IPTG）诱导的大肠杆菌一射击BL21（DE3）
，其中包含相应的质粒（补充表10）在37°C的LB培养基中培养 。在600 nm（OD600）的光密度下诱导蛋白质表达，在37°C下离心3 h ，在Histrap Buffer A（50％功率
，5次）在Histrap Buffer A（50％的功率为50％，5次）（50 mm tris-HCl ，pH 7.8，10 mm tris-Hcl
，pH 7.8，1M nacl ，1 m m-nacl
，1 mm urea，1 mms ，5mmmso
，5次5％甘油，5毫米咪唑 ，每500毫升完整的无EDTA蛋白酶抑制剂鸡尾酒（Roche））。通过离心（在4°C下37,500克）清除裂解液
，并将上清液应用于1 mL Ni-NTA Histrap柱（GE Healthcare）
。使用Histrap缓冲液B（添加了500 mM咪唑的Histrap Buffer A）的类似梯度将蛋白质用咪唑梯度洗脱，并通过SDS -PAGE进行分析。 　　通过尺寸排斥色谱（SEC） ，通过超级dex 200 10/300 GL色谱柱（GE Healthcare）使用含有0.5 m NaCl和25 mM Tris-HCl的SEC缓冲液来实现进一步的蛋白质纯化
，pH 8，通过SDS-PAGE ，通过Amicon-ultra-4 Centra Cutter（Molecular-4 Centry filters）（Molecular-4中心（Molecult）（Molecult）（Molecult）分析了感兴趣的分数 。在2,000 rpm和4°C下离心
。用Nanodrop ND-1000分光光度计测量蛋白质浓度。最后，将蛋白质储存在-20°C下添加了50％甘油的SEC缓冲液中 。 　　大肠杆菌BL21 DE3 PET28-ARH1和BL21-PET28-ARH1 D55A
，D56A（补充表10）在37°C和175 rpm时生长至OD600 = 0.6
。之后，将细菌冷却至室温30分钟。用1 mM IPTG诱导表达 ，并在175 rpm摇动时在室温下终于在室温下生长过夜 。通过离心收集细菌
，并以与RS1变体类似的方式纯化蛋白质
。 　　大肠杆菌BL21 DE3 PET28-MODA（补充表10）在37°C下生长至OD600 = 1，在175 rpm时摇动。用0.5 mM IPTG诱导蛋白质表达 ，并在37°C下3小时后通过离心收集细菌 。将沉淀的细菌重悬于50 mM NAH2PO4
，pH 8，300 mm NaCl ，1 mm DTT中
，每500毫升每500毫升无EDTA无EDTA蛋白酶抑制剂鸡尾酒（ROCHE），并通过超声处理（3×1分钟）以5％的功率溶解
。将裂解物在4°C下以3,000克离心20分钟。通过在30 mL 50 mM Tris-HCl ，pH 7.5 、2 mM EDTA
，100 mM NaCl，1 M尿素 ，1 mM DTT和一个片剂EDTA无EDTA无EDTA蛋白酶抑制剂（ROCHE）中重悬于30 mL 50 mM Tris-HCl，pH 7.5
、2 mM EDTA
，100 mM EDTA，100 mM EDTA ，100毫米EDTA
，100 mM EDTA，100 mM EDTA ，100毫米EDTA
，100 mM EDTA（ROCHE）中洗涤沉积物，并在4°C的10,000g中心20分钟 。将含有包含物体的小球重悬于40 mL 100 mM Tris ，pH 11.6
，8 m尿素中，转移至12-14 kDa MWCO透析袋（ROTH） ，并在50 mM NAH2PO4中透析过夜
，300毫米NACL。将蛋白质溶液在4°C下以20,000克离心30分钟
。使用一次性的10 ml柱（Thermo Fisher Scientific）对上清液进行纯化，并用2 ml Ni-Nta琼脂糖（Jena Bioscience）填充 ，并用10柱体积为50 mM NAH2PO4（pH 8），300 mM NaCl平衡。通过用30柱体积为50 mm NAH2PO4、300 mM NaCl
，15 mm咪唑，用5 ml 50 mM NAH2PO4 ，300 mm NaH2PO4
，300 mm NaCl，300 mM咪唑促进 ，在Amicon（Merck Millipore）fileters（Merck Millipore）Attriffiffiffififfiffififfififififfiffififififfifififfififfififfiffiffififfiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffif
，纯化了蛋白质 。4°C）
。最后，如RS1所述 ，通过SEC纯化蛋白质。 　　E. Coli BL21 DE3 PET28 – MODB和大肠杆菌BL21 DE3 PET28 – MODB（R73A
，G74A）（补充表10）在37°C下在37°C下以185 rpm摇动，在185 rpm上摇晃 ，并在4°C下冷却至160 rpm
，以适合于4°C，以供至4°C摇动 。通过添加1 mM IPTG诱导蛋白质表达
。然后将培养物在4°C下孵育120分钟 ，并在160 rpm摇动，并通过离心收集细菌（4,000 rpm在4°C下持续25分钟）。如RS1变体所述
，从上清液中纯化了MODB蛋白 。 　　使用alphafold2.ipynb（v.1.3.0，https：//colab.research.google.com/github/github/github/sokrypton/colabfold/colab/blob/main/main/alphafold2.ipynb）使用alphafold预测（V.1.3.0 ，https：//colab.research.google.com/github/sokrypton/colabfold/colabfold/colabfold/colabfolbfold = defeault参数）（联合国+环境）
，model_type =“ alphafold2-ptm
”，max_msa = null ，pair_mode =不成对+配对
，自动高级设置）
。MODB蛋白序列是从Uniprot检索的（主要登录：P39423）。使用Pymol进一步评估了Rank_1的MODB结构预测模型 。 　　在存在0.25μciμl-1 32p-NAD的情况下，RS1（0.3 µm）在存在的情况下或在存在0.6 µm 32p-NAD – 8-MER中的一种中 ，为0.6 µm
，0.03 µm 32p-NAD-QβRNA或0.8 µm NAD-10-10-MER ENCENTARY（1.4）（1.4）（1.4），在0.6 µm 32p-NAD – 8-mer中 ，并在1.6 µm 32p-NAD-8-mer中
，rnAdy（1.4 µM）（1.4）乘以1.4（1.41×转移酶缓冲液（10 mm mg（OAC）2，22 mM NH4CL ，50 mM Tris-乙酸盐pH 7.5，1 mm EDTA
，10 mMβ-羟基苯二醇和1％甘油）在15°C下至少120分钟
。在添加MODB之前和1 、2
、5、10 、30、60和120分钟之前采集样品（5μl），并与5μl2×Laemmli缓冲液混合以停止反应。通过12％SDS-PAGE评估反应 ，并将凝胶在瞬时蓝色溶液（Sigma-Aldrich）中染色10分钟 。使用存储磷光屏幕和台风9400成像仪可视化放射性信号。使用ImageQuant 5.2（GE Healthcare）定量放射性带的强度
。用Chemidoc（Bio-Rad）CY5通道可视化使用NAD封型CY5标记的RNA的Rnaylation。然后通过Coomassie溶液染色凝胶
，并使用相同的系统成像 。在某些情况下，SDS凝胶中蛋白质的无染色成像是由凝胶中的2,2,2-三氯乙醇（TCE）进行的
。TCE与蛋白质的色氨酸残基结合 ，从而在紫外线下增强其荧光
，从而使其检测53。 　　使用6.4 µM NAD或6.4 µM NAD-8-MER作为底物在相同的设置下进行ADP-核糖基化或RNAYLED，作为底物 ，在LC – MS/MS测量值4 h的情况下
，在1.57 µm MODB的情况下修改4.6 µM RL2 。对于换档测定，在6 µm NAD-8-MER存在下 ，将538 nm RL2用2.61 µm modb rnayl
。用40％乙醇和10％乙酸的溶液固定12％SDS-PA凝胶过夜
，并使用火烈鸟荧光蛋白染料（Bio-Rad）染色长达6小时，并用Chemidoc（Bio-Rad）成像。信号强度在图像映射（Bio-Rad）中定量 。如有指示 ，使用在GGPUBR软件包（V.0.6.0）中实现的R（v.4.2.2）中的双面t检验进行统计检验，使用显着性水平为0.05
。 　　我们将0.8 µM NAD-10-MER – CY5（补充表7）与0.5 µM蛋白质大肠杆菌RNA聚合酶（新英格兰Biolabs）和3 µM Alt或MODA孵育
，在15°C下在15°C下孵育30分钟。在添加ALT或MODA之前和60分钟孵育后采集样品 。通过添加1体积的2×Laemmli缓冲液来停止反应
。通过MODB将NAD-10-MER – CY5作为参考蛋白的10％SDS-PAGE分析了10％SDS-PAGE的反应。使用Chemidoc（Bio-Rad）CY5通道可视化rnaylated蛋白 。之后，将凝胶染色在Coomassie溶液中 ，并使用相同的系统成像。 　　在20μl反应中
，将3.6 µm 32p-ADPR – 8-MER（补充表7）与2.6 µm rs1
、3.9 µM MODB或2.59 µm Rs1和2.59 µm Rs1和3.9 µm ModB一起在1×转移酶的缓冲液中孵育
。作为阳性对照，将相等量的蛋白质RS1和MODB与0.6 µm 32p-NAD-8-Mer孵育。将所有反应在15°C下孵育60分钟 。在添加MODB之前或60分钟后采集样品 ，并通过添加2×Laemmli缓冲液来停止反应
。通过12％SDS -PAGE和放射自显影成像分析了反应。 　　0.05 µM 32p-NAD-QβRNA
，0.15 µM 5'-32P-QβRNA或0.15 µM 5'-32PPP-QβRNA（补充表7）在15°°C的15°°C下在1××转移酶的情况下与2.3 µm Rs1和1.4 µm ModB一起孵育2.3 µm Rs1和1.4 µm ModB 。在添加MODB之前和60分钟后采集样品，并通过添加1卷2×Laemmli缓冲液来停止反应
。通过10％SDS-PAGE分析反应 ，在1×Laemmli缓冲液中应用Rs1–32p-ADPR作为参考
，并随后进行放射自显影成像。 　　用无线电标记的底物进行ADP-核糖基化或rnaylation反应，在1倍转移酶或1×降解缓冲液中洗涤并平衡以进行进一步的酶处理 。通过在10 kDa amicon（Merck Millipore）过滤器的4°C下在4°C下以10,000g离心在10,000g的10,000g下 ，用相应缓冲液的四柱体积洗涤反应
。根据制造商的说明
，使用Zeba旋转脱盐柱（7 kDa MWCO，0.5 ml）（Thermo Fisher Scientific）在相同的缓冲液中平衡了用Cy5标记RNA的蛋白质在相同的缓冲液中平衡。 　　将Rs1-100-核苷酸-RNA（32p）混合物（19μl）在1倍转移酶缓冲液中平衡 ，并在37°C下与1μl核酸酶P1或1μlMillipore水孵育60分钟 。在开始时和60分钟后采集样品，并通过添加2×Laemmli缓冲液的体积来停止反应
。通过10％SDS-PAGE分析反应
，在1×Laemmli缓冲液中应用Rs1–32p-ADPR作为参考，并随后进行放射自显影成像。 　　将Rs1和Rs1-8-Mer（32p）和Rs1和Rs1 – ADPR（32p）的混合物（19μL）与1倍降解缓冲液中的混合物与0.2 µg胰蛋白酶（Sigma（Sigma）（Sigma ，SIGMA
，EMS0004，EMS0004 ，质谱级）
，质谱级级）或千摩利水中的水孵育 。在添加胰蛋白酶/小米水之前和120分钟后添加样品。通过在样品中添加2×Laemmli缓冲液的卷来停止反应，并通过12％SDS -PAGE和放射自显影成像进行分析
。 　　用10 mM HGCL2或500 mM NH2OH（参考文献54,55）在37°C下用洗涤和平衡的ADP-核糖基化（1μL）和Rnaylated（2μL）RS1的等分试样（2μL）（32p）RS1处理。通过添加2×Laemmli缓冲液并通过12％SDS -PAGE进行分析来停止反应 。 　　用0.5 u内核酸酶P1（Sigma-Aldrich）56或0.95 µM ARH1或Arhh1或Arhant reseco concecation reseco ，从洗涤和平衡的（以1×降解缓冲液为1×降解缓冲液）ADP-核糖基（1μL）（1μL）RS1（32p）的等分试样（SIGMA-ALDRICH）56或0.95 µM ARH1或ARHH1或ARHH3（EENZ SCACIAN
，SCACICO）Mg（OAC）2，22 mM NH4CL ，50 mM HEPES
，1 mM EDTA，10 mMβ-羟基乙醇和1％（v/v）甘油在37°C的总体积为20μL ，持续1小时
。通过添加2×Laemmli缓冲液并通过12％SDS -PAGE分析来停止酶促反应。 　　与1 µm 32p-NAD – 8-Mer或3 µm 5'-32p – 8-Mer（补充表7）的反应（20μL）为1.4 µm ModB和2.3 µm蛋白RS1，在2 mm 3-mb的情况下（DMSO中的50 mm库存）或不含Inbibetor（DM）（58）（dmso）（DM）（DM）（DM）（DM）（DM）（DM）（dmso）（补充表7）（补充表7）在添加MODB之前和60分钟后取样 。通过添加1卷2×Laemmli缓冲液来停止反应
，并通过12％SDS -PAGE进行分析
。 　　我们将1.1 µM NAD -RNA – CY5（线性，5'悬垂 ，3'悬垂和钝端；补充表7）与0.9 µM Rs1和0.4 µm ModB中的1倍转移酶缓冲液中的0.4 µM。在添加MODB蛋白和2、5 、10
、30、60和120分钟之前
，取5 µL的样品是在反应开始后的 。将样品直接与2×Laemmli缓冲液一起混合以停止反应
。在CY5通道中的Chemidoc（Bio-Rad）可视化后，通过12％SDS-PAGE分析了底物的转化。使用RNAY的RS1蛋白的最大观察到的信号强度用于确定在不同时间点上分析的底物的相对转化率 。 　　将大肠杆菌B菌株PTAC-RS1（补充表10）的先例在37°C时在LB培养基中孵育100 µg ml-1氨苄青霉素过夜
。对于主要培养物 ，将100 µg ml -1氨苄西林的150 mL Lb培养基用前培养接种至OD600 = 0.1。在OD600 = 0.4时
，通过添加1 mM IPTG诱导蛋白质表达 。在OD600 = 0.8时，培养物要么以10（20 mL噬菌体溶液）（DSM 4505 ，Leibniz Institute DSMZ）的多种感染（MOI）感染T4
，要么通过添加20 mL LB培养基而不是感染（负LB培养基）。将培养物在37°C下以240 rpm的速度孵育20分钟
。通过在室温下以4,000克离心15分钟来收集细菌。颗粒存储在-80°C 。 　　将细菌颗粒重悬于10 mL缓冲液中，并通过超声处理（1×5分钟 ，在50％功率下的周期2）
。将裂解物在4°C下以37,500克离心30分钟。将上清液通过0.45μm滤波器（SARSTEDT）过滤 。通过重力Ni-NTA亲和色谱法从上清液中纯化了噬菌体T4感染或未感染的大肠杆菌B菌株的RS1
。将Ni-NTA琼脂糖浆液（1 mL
，Thermo Fisher Scientific）添加到10 mL丙烯柱中，并在缓冲液A中平衡。将上清液加载到柱上两次 。用95％缓冲液A和含有29.75 mM咪唑的5％缓冲液B洗涤该色谱柱
。用10 mL缓冲液从色谱柱洗脱蛋白。 　　来自T4感染或未感染的大肠杆菌B菌株PTAC-RS1的His标记蛋白RS1用两个1×降解缓冲液（12.5 mm TRIS-HCl ，pH 7.5，25 mm naCl
，NaCl，25 mm NaCl ，25 mm KCl
，5 mm MgCl2）的滤清器通过10-及以上的fimertrifugation in 10-kcl at at at 10-amicon amicon and，最终体积为120μl 。通过12％SDS -PAGE分析分析了馏分 ，并将凝胶在瞬时蓝色溶液中染色10分钟
，然后立即成像
。 　　用内源性的His标签RS1和大肠杆菌B菌株表达His标记的RS1 WT，R139A或R139K的大肠杆菌B菌株被T4感染至5.0的MOI ，如上所述8分钟。100 ml culture was collected and the pellet resuspended in 1.5 ml Ni-NTA buffer A with 15 mM imidazole (50 mM Tris-HCl, pH 7.8, 1 M NaCl, 1 M urea, 5 mM MgSO4, 5 mM β-mercaptoethanol, 5% glycerol, 15 mM imidazole, one tablet per 500 ml complete EDTA-free protease inhibitor鸡尾酒（罗氏）） 。通过超声处理裂解细胞（在80％的功率下进行3次裂解2分钟）
，并在4°C下以17,000g离心30分钟来清除上清液。将上清液与75 µL Ni-NTA磁珠（Jena Bioscience）一起在Ni-NTA缓冲液中平衡的15毫米咪唑在4°C下孵育1小时
。将磁珠用1 ml Ni-NTA缓冲液A七次用15 mM咪唑A和3次用无咪唑的Ni-NTA缓冲液洗涤，但具有4 m尿素。最后 ，通过添加Ni-NTA洗脱缓冲液（50 mM Tris-HCl
，pH 7.8，1 M NaCl ，1 M尿素，5 mM MGSO4
，5mmβ-羟基乙醇，5％甘油 ，300 mM imidazole
，300 mm imidazole，每500 mL每500 mL完整的Edta-Freepe protease Inbibit）（ROCH） 。根据制造商的说明 ，将蛋白质与Zeba柱（7 kDa MWCO
，0.5 ml）中的1倍转移酶缓冲液平衡，并在37°C下用1:20的比例（W/W）用胰蛋白酶在3 H中消化蛋白质
。使用50 mM三乙胺 - 乙酸盐（pH 7.0）缓冲液与0–90％乙腈和Chromabond C18 WP旋转柱（20 mg ，Macherey Nagel）结合使用C18纯化肽。将纯化的肽溶解在HPLC级H2O中
，并进行LC-MS/MS分析（见下文） 。 　　In vitro RNAylated rS1 (D2) reactions in 1× transferase buffer were directly digested (without further purification) with 1 µg RNase A (Thermo Fisher Scientific) and 100 U RNase T1 (Thermo Fisher Scientific) at 37 °C for 1 h, following tryptic digest at 37 °C for 3 h in the same buffer with trypsin (Promega) in a 1:30 ratio（w/w）相对于每个样品的总蛋白质含量
。如上所述，用Chromabond C18 WP自旋柱纯化肽 ，用于LC -MS/MS分析（见下文）。 　　RL2与NAD-8-MER和ADP-核糖基化反应的体外Rnaylation反应在与T4噬菌体感染的大肠杆菌的蛋白质相似的情况下纯化 。在这里
，将反应（200 µL）与100 µL Ni-NTA珠一起在800 µL Ni-NTA缓冲液中平衡的Ni-NTA珠，其用10 mM咪唑和40 U鼠RNase抑制剂（新英格兰Biolabs）在4°C下孵育1 h
。用1 ml链霉亲和素洗涤缓冲液（50 mM Tris-HCl ，pH 7.4，8 m尿素）在室温下洗涤珠子八次
，并用130 µL Ni-NTA洗脱缓冲液洗脱蛋白质。根据制造商的说明，使用Zeba旋转脱盐柱（7 kDa MWCO ，0.5 mL）将纯化的蛋白质重新覆盖在100 mM NH4OAC中 。将RL2样品溶解在4M尿素中
，在50 mM Tris-HCl（pH 7.5）中溶解在室温下30分钟，然后用50 mM Tris-HCl稀释至1 M尿素（pH 7.5）
。在37°C下孵育4小时后 ，加入了10μgRNaseA（Thermo Fisher Scientific）和1 KU RNase T1（Thermo Fisher Scientific）。对于蛋白质消化
，将0.5 µg胰蛋白酶（Promega）添加到每个样品中，并在37°C下过夜进行消化 。使用甲酸将样品调节至1％乙腈（ACN）和pH 3。根据制造商的说明 ，使用C18列（哈佛设备）清理样品
。 　　将清洁的RS1和RL2肽样品溶解在2％ACN
，0.05％三氟乙酸中，并使用Orbitrap Exploris 480质谱仪（Thermo Fisher Scientific）进行LC – MS/MS分析 ，并与dionex Ultimate 3000 RSLCNANO系统相结合。将肽在缓冲液A（0.1％（v/v）甲酸）中的PEPMAP 300 C18陷阱柱（Thermo Fisher Scientific）（流速为10 µl min-1）中加载
，并用缓冲液A洗涤3分钟 。肽分离在内置的C18内部c18 cm; reposil-pur; reposil 120 c1;直径为75 µm；流速300 nl min -1）通过施加线性梯度B（80％（v/v）ACN，0.08％（v/v）甲酸）
。用5％缓冲液B对主柱进行平衡 ，为18 s，应用样品
，并用5％缓冲液B洗涤3分钟。 　　将10–45％缓冲液B的线性梯度在44分钟内应用于洗脱肽，然后在90％缓冲液B下进行4.8分钟的洗涤 ，在5％缓冲液B中洗涤6分钟 。消除RS1和RL2肽在正面模式下使用数据依赖于TOP-20的TOP-20采集方法分析了58分钟
。MS1和MS2的分辨率分别设置为120,000和30,000个全宽度
，分别以最大最大的最大宽度，并且将自动增益控制（AGC）目标设置为106（MS1）和105（MS2）。MS1扫描范围设置为M/Z = 350–1,600 。使用28％归一化的 ，高能碰撞诱导的解离片段化对前体进行破碎
。其他分析参数如下设置：隔离宽度
，1.6 m/z；动态排除，9 s；MS1和MS2的最大注射时间 ，60 ms和120 ms。 　　对于所有测量值
，使用锁定质量选项（M/z 445.120025）进行内部校准 。 　　使用OpenMS Pipeline RNPXL和OpenMS TopPasViewer30对MS数据进行分析并手动验证
。前体质量公差设置为6 ppm。MS/MS质量公差设置为20 ppm 。定义了ARG残基的中性损失42.021798 DA（C1H2N2），以及核糖负H2O（78.010565 DA ，C5H2O）
，ADP-ribose，ADP-核糖（541.06.06111 DA ，C15H21N5O13P2）和无adnenine（4899999999999999999.9999999999.9992）的中性损失。C10H17O163）31
。在肽光谱匹配水平上过滤结果以1％的错误发现率过滤。提取RS1肽的离子色谱图并使用天际线（V.21.2.0.369）59提取并观察 。 　　LC – MS/MS分析蛋白质摘要是在连接到电喷雾离子源（Thermo Fisher Scientific）的Exploris 480质谱仪上进行的
。使用配备有堆积的内部C18树脂柱（Magic C18 AQ 2.4 µm，Maisch博士）的Ultimate 3000 Nanolc-System（Thermo Fisher Scientific）进行肽分离。将肽从前五个模式下从前列中洗脱
，分别从98％溶剂A（0.15％甲酸）和2％溶剂B（99.85％ACN，0.15％甲酸）到35％溶剂B在40分钟和90分钟内分别为35％溶剂B 。流速设置为300 nl min -1
。设置了无标签定量的数据依赖性采集模式 ，以获得一个高分辨率MS扫描
，分辨率为60,000（M/z为200），扫描范围为350至1,650 m/z。获得20个最强大离子（90分钟梯度）的MS/MS扫描 ，以及在2 s（周期1 s
，40分钟梯度）内检测到的最强大离子 。为了提高MS/MS尝试的效率，调整了充电状态筛选模式以排除未分配和单一充电的离子
。对于MS/MS扫描 ，将离子累积时间设置为25 ms
，“自动”设置为“自动 ”。MS调查扫描的AGC设置为300％，MS/MS扫描设置为200％ 。 　　使用Maxquant（V.1.6.17.0和2.0.3.0）分析了原始MS光谱 ，并使用靶标蛋白的FASTA数据库和一组常见的污染物蛋白
。使用以下搜索参数：需要完全胰蛋白酶特异性（Lys或ARG残基后切割）；允许三个错过的分裂；氨基甲基化（C）设置为固定修饰；和氧化（M; +16 DA）
，脱氨酸（N，Q; +1 DA）和ADP-核糖基（K; +541 DA）设置为可变修改。Maxquant在默认设置中执行 。所有最大参数均在补充表1和2中列出。MS蛋白质组学数据已由DATASET标识符PXD041714下的Pride合作伙伴存储库存放在ProteOmeXchange联盟中
。 　　具有内源性His标签的RS1的大肠杆菌B菌株是通过使用大肠杆菌B菌株中的PRET/ET质粒对线性转化DNA（TDNA）的同源重组产生的。线性tDNA是通过融合PCR对齐四个片段而产生的：156个碱基对（BP）的RPSA基因 ，并从PET28 RS1载体（作为左侧侧翼）中放大了一个额外的HIS-TAG，这是70 bp的flp-flp-flp-Flank bp bp bp bp bp bp bp bp bp bp bp bp bp bp bp bp bp bp bp bp bp bp bp bp 。RPSA基因的侧面区域（右侧侧面）
。补充表9中指出了所使用的引物。随后的重组程序基于RET/ET重组（Gene Bridges）的大肠杆菌基因缺失试剂盒的方案 。简而言之
，在30°C下补充了100 µg ml -1氨苄青霉素的LB培养基中生长了含有PRED/ET质粒的大肠杆菌B菌株
。在OD600 = 0.35时，将L-阿拉伯糖添加到0.33％（w/v）中 ，以在37°C下生长1 h期间诱导红色/ET重组系统的表达。接下来
，通过在4°C下以3,000克离心1分钟来收集1.4 mL培养，并用1 ml冷的10％甘油洗涤两次细胞 ，最后重悬于50 µL 10％甘油中 。使用标准设置（EC1）的微孔电氧化器（Bio-Rad）用1 µg TDNA电穿孔
。将电穿孔的细胞立即重悬于1 mL预热的LB培养基中
，并在37°C下以600 rpm的振动孵育3小时。最后，将细胞铺在卡纳米霉素（30 µg mL -1）Lb – agar板上 。细胞花了2天的时间才能恢复和生长
。通过Sanger测序评估成功的重组 ，并通过下拉和蛋白质组学验证正确的蛋白质表达。 　　在LB培养基中
，培养（100 mL）的大肠杆菌B菌株（补充表10）在LB培养基中提供1 mM CaCl2，1 mM MGCL2和30 µg ML-1 Kanamycin在37°C下在250 mL bafffled Erllenmeyer flasks to o o od60中生长在37°C的37°C下生长 。将T4噬菌体WT或T4噬菌体modb（R73A ，G74A）添加到5.0的MOI中。对于未感染的阴性对照
，将相同体积的LB培养基添加到培养物中
。然后将培养物在37°C下孵育8分钟，并通过3,000克离心13分钟来收集大肠杆菌。干燥的颗粒存储在-80°C下 。 　　Pellets from the 100 ml culture infected with either WT T4 phage, T4 phage ModB(R73A, G74A) or the uninfected control (LB) were resuspended in 2 ml Ni-NTA wash buffer (10 mM imidazole, 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 1 M NaCl, 1 M urea, 5 mM MgSO4, 5 mM β-mercaptoethanol,5％甘油 ，pH 8.0，无EDTA蛋白酶抑制剂（Roche
，每500毫升一片））在冰上进行超声（6分钟，50％功率 ，0.5 s脉冲）
。通过在4°C下以21,000g离心30分钟
，从细胞碎屑中清除裂解液。上清液（1.9 mL），50 µL Ni-NTA琼脂糖珠（Jena Bioscience ，在Ni-NTA洗涤缓冲液中平衡）
，80 U鼠RNase RNase抑制剂（新英格兰Biolabs）和4.72 µg rs1 d2用NAD盖的RNAi组合为30分和Incum conthe in 40 congub rnai conthe in 30 conthe和Incub conthe in in 4 30 。将整个样品转移到Mobicol迷你自旋柱（Mobitec）中
。用200 µL Ni-NTA洗涤缓冲液洗涤珠四次，然后用200 µL链霉亲和素洗涤缓冲液（50 mM Tris-HCl ，pH 7.5
，8 m尿素）洗涤珠。将珠在标准连接缓冲液（10 mM MGCL2，50 mM Tris-HCl ，pH 7.4）中平衡
，并在3'RNA-ADAPTER在4°C下在4°C的3'RNA-ADAPTER连接之前用牛血清中的白蛋白（BSA）阻塞，过夜 ，在标准连接缓冲液的存在下，50mmβ-甲醇
，0.0％bs v）DMSO，5 µM腺苷酸化RNA-3'-ADAPTER ，0.5 U µl-1 T4 RNL1（新英格兰Biolabs）和10 U µL-1 T4 RNL2
，Tr 。K227Q（新英格兰Biolabs）
。通过将NaCl添加到1.5 m并在20°C下孵育，蛋白质反弹 ，并在400 rpm摇动20分钟。随后
，用链霉亲和素洗涤缓冲液将珠洗涤六次，并在第一链缓冲液（50 mm Tris-HCl ，pH 8.3
，3 mm mgcl2，75 mm kCl）中平衡 ，并用BSA阻塞 。使用10 U µL-1上标IV逆转录酶（Invitrogen）在40°C下以30 µl尺度的蛋白结合RNA的逆转录在40°C下进行1 h
，在5 µM RT引物，第一链引物 ，25 mMβ-甲醇，β-甲醇
，第一个Strand Buffer，第一个RT引物 ， 0.05 µg µl -1 BSA和0.5 mM DNTP
。孵育后
，将NaCl添加到1.5 m，并在20°C下孵育溶液 ，并在400 rpm摇动1小时以重现RNA – CDNA杂交。随后用0.25×链霉亲和素洗涤缓冲液（2 m尿素
，50 mm Tris-HCl，pH 7.5）洗涤珠 ，在EXOI缓冲液（10 mM Tris-HCl
，pH 7.9，5 mmβ-磁匹配乙醇 ，10 mMβ-苯酚
，10 mm MGCl2，50 mm MM Nacl）和Bloke中平衡 。通过EXOI Digest在EXOI缓冲液中以37°C的ExOI E. exoI（新英格兰Biolabs）的1 u µl -1大肠杆菌EXOI（新英格兰Biolabs）在37°C下至少30分钟 ，将残留的RT底漆除去。最后，将珠子用200 µl 0.25×链霉亲和素洗涤缓冲液洗涤五次
，然后用200 µl固定缓冲液（10 mM Na-Hepes，pH 7.2 ，1 m NaCl）洗涤3次
。通过在100 µl 150 mm NaOH的55°C中孵育25分钟
，然后用100 µL MQ水洗涤cDNA。通过添加0.05卷为3 m NaOAC，pH 5.5 ，将洗脱pH中和 。通过苯酚 - 氯仿提取从残留蛋白中取出cDNA
，并在0.3 m NaOAC存在下用2.5体积的乙醇沉淀，pH 5.5 5.5过夜
。在1.25 mM CTP存在下 ，使用1 U µL-1 TDT（Thermo Fisher）将沉淀的cDNA在37°C下30分钟
，然后在70°C下灭活10分钟。5 µM cDNA锚（在10 µM ATP和1.5 U µL-1 T4 DNA连接酶（Thermo Fisher Scientific）的存在下，将5 µM cDNA锚定为标准连接缓冲液中的C尾cDNA ，在标准连接缓冲液中连接到C尾cDNA 。在70°C下将连接反应灭活10分钟
，并沉淀乙醇
。 　　For the preparation of the Illumina RNAylomeSeq library, cDNA was amplified by PCR using 2 U Phusion Polymerase (Thermo Fisher Scientific) in the presence of 5% (v/v) DMSO, 200 µM dNTPs and 2,500 nM New England Biolabs Next Universal and Index Primer each (Primer Set 1, New England Biolabs).PCR产品通过本地页面纯化，并进行了乙醇的沉淀。使用量子荧光计（Promega）测定双链DNA（DSDNA）浓度 ，并用生物分析仪（Agilent）确定文库大小 。使用Miniseq高输出套件（150个循环，Illumina）在Miniseq系统（Illumina）上测序每个库的等摩尔量
，并产生2000万151 bp的单端读数
。 　　使用BCL2FASTQ（V.2.20.0，Illumina）对下一代测序（NGS）数据进行了反复。使用FASTQC（v.0.11.9）评估了FASTQ文件 ，并使用CASADAPT（v.1.18）对Illumina测序适配器进行了修剪 。将读取与由大肠杆菌K12（U00096.3）
，噬菌体T4（NC_000866.4）和RNAi（我们的设计）组成的参考基因组对齐
。使用SAMTools（V.1.7）选择了主要比对，并使用TemutureCounts（v.2.0.1中的v.2.0.1）对每个基因组特征的读数进行了读取。在R（v.4.1.2）中 ，对所得计数表进行了进一步的分析和数据可视化 。将读数计算为每个样品的映射读取的总数
，以及RNAi Spike-IN的相应读取计数如下： 　　数据可视化是通过自定义r脚本60进行的，并在集成基因组观看器（IGV V.2.4.9）中手动检查对齐。基于以下标准鉴定了命令：LOG2转化的倍数变化（LFC）≥1.5比较WT T4和T4 R73A ，G74A突变体和WT和R73A之间的Log2均值平均表达
，G74A，G74A ，一个重复≥-0.5的g74a样品
。 　　将来自rnaylomeseq的cDNA用千摩利水稀释1:30。根据制造商的指示
，根据制造商的说明，使用ITAQ通用SYBR Green Supermix（Bio-Rad）在1 µl稀释的cDNA上以10 µl级别的比例进行100-150 bp的区域进行定量PCR 。计算来自相应重复的感染样品 ，并将LFC≥1设置为cDNA富集的阈值
。 　　在15°C的15°C下，在15°C下
，在15°C下，将70S核糖体（4.3 µg µl-1）在1 µM NAD – 10-MER – CY5或1 µM NAD – 40-MER-CY5（补充表7）的情况下在转移酶缓冲液中rNAYLLELELLELLELINLLAS。使用12％SDS-PAGE分析了Rnaypated和非弹性对照样品 。为了鉴定rnaylated蛋白 ，切除了SDS-PAGE分离蛋白带
，如先前所述61所述，在凝胶中消化蛋白质
。LC-MS是在连接到带有proflow升级和纳米喷雾flex ion source（所有Thermo Scientific）的Ultimate 3000 RSLCNANO系统的Exploris 480质谱仪上进行的。然后在上述LC-MS系统上分析肽混合物 ，分离肽分离梯度为30分钟
，从2％至35％缓冲液B进行B 。肽分离在逆相HPLC柱（75μm×42 cm）上，用C18 Resin（2.4μm ，Maisch博士）在内部包装
。在2.3 kV喷雾电压下以275°C的加热毛细血管温度离子将肽电离
，并在40时漏斗RF水平。MS调查扫描以M/z 200的120.000分辨率为MS/z 200，最大MS AGC目标为300％ ，最大值为50毫秒 。质量范围设置为350–1,650
。以数据依赖性的采集模式获取片段光谱
，其四极隔离窗口为m/z = 1.5，AGC目标值为200％和15.000的分辨率 ，并用归一化的高能碰撞诱导的分离率为27％的归一化较高的高能碰撞诱导的分离能诱导片段。使用嵌入蛋白质组发现器2.2（Thermo Scientific）中的隔离的序列搜索MS原始数据，以针对含有含有噬菌体T4蛋白MODB的Uniprot E. Coli蛋白数据库 。从脚手架查看器中导出光谱计数
，每个样品总光谱计数被用来通过Microsoft Excel 2016中的除法来使所有其他蛋白质的光谱计数归一化，然后计算从修改和未修改的频段中计算出归一化光谱计数的比率。 　　将40毫升大肠杆菌B菌株培养的新鲜颗粒重悬于2 ml转移酶缓冲液（10 mM mg（OAC）2 ，22 mM NH4CL
，50 mM Tris-acetate，pH 7.5 ，10 mm EDTA
，1 mm EDTA，10 mm 2- coccaptoetoetholol ，1％glycerol）中
。通过超声处理（50％功率
，0.5 s脉冲）裂解细胞，并通过在4°C下以27,670g离心30分钟从细胞碎屑中清除裂解液。上清液用于Rnaylation分析 。 　　在存在0.93 µm NAD – 10-MER – CY5（参考NAD盖）或0.93 µm P – 10-Mer-Cy5（补充表7）的情况下 ，在0.93 µm NAD-10-MER – CY5（0.47 µm）存在下孵育裂解物（100 µL）（补充表7）
，0.37 U Murine RNase抑制剂（New England biolabs）和0.69 µm AT AT
。在添加MODB之前和2 、5
、10、20 、30和60分钟之前采集10 µL的样品，并立即重悬于2×Laemmli缓冲液中。通过12％SDS-page分析样品 ，并向每种凝胶应用相同的参考文献（用NAD – 10-MER – CY5）进行相同的参考 。使用ChemiDoc成像系统的CY5印迹选项记录CY5信号，并在90 s的手动暴露中记录
。然后将凝胶染色在Coomassie溶液中
，并使用相同的系统成像。 　　如先前所述，对具有不同浓度MODB的大肠杆菌裂解物进行处理并通过蛋白质组学进行分析 。38
。 　　在PBS中制备了大肠杆菌细胞裂解液的稀释系列。从100毫米库存开始 ，将NAD稀释在PBS中
，从而创建了1,000 nm的NAD溶液至3.125 nm 。根据制造商的三份指示，使用NAD/NADH-GLO分析（Promega）评估了NAD溶液 ，裂解物稀释系列和PBS空白的NAD浓度
。在384孔扁平板中的Tecan读取器（火花）上进行发光测量。对400 nm至4 nm之间的NAD浓度进行了线性拟合（R2 = 0.9836）
，并具有与强度的线性相关性 。该方程用于计算大肠杆菌裂解物的NAD浓度作为技术的三份平均值。 　　通过10％SDS -PAGE分离蛋白质，并在转移缓冲液（25 mM Tris ，pH 8.3
，192 mm甘氨酸，20％（V/V）甲醇）中平衡凝胶
。在甲醇中激活孔径为0.2μm（GE Healthcare）的毛孔大小为0.2μm（GE Healthcare）的聚硅酸膜膜 ，并在转移缓冲液中平衡。除非有不同的指示
，否则以300 mA的半齐方式将蛋白质从凝胶中从凝胶中转移到膜上1.5 h 。转移后，通过在甲醇中浸泡并用TBS-TWEEN（TBS-T； 10 mM TRIS-HCL ，pH 7.5，150 mm NaCl
，0.05％，0.05％（V/V）Tween 20）将膜脱水
。之后 ，将10 mL阻止缓冲液（TBS-T中的5％（w/v）奶粉）添加到膜中
，并在室温下孵育1小时。为了检测ADP-核糖基化蛋白，将膜与10 ml洗涤缓冲液（1％（W/V）奶粉中的1：10,000抗PAN-ADPR结合试剂MABE1016（MERCK）在4°C中以4°C隔夜62中孵育 。洗涤膜并与10 ml的辣根过氧化物酶 - goat-anti-rabbit IgG二级抗体（Advansta）在室温下在1小时内在洗涤缓冲液中孵育1：10,000稀释
。之后 ，用PBS洗涤膜。根据制造商的指示
，使用信号激发ECL试剂或SignalFire ELITE ECL试剂（细胞信号技术）通过化学发光可视化ADP-核糖基化蛋白 。 　　如果需要在印迹之前对SDS -PAGE凝胶中的蛋白质进行可视化，则使用TCE染色方法53
。分辨凝胶补充了0.5％（v/v）TCE。为了可视化 ，凝胶通过紫外线透明（波长为300 nm）激活60 s 。然后
，蛋白质在可见光谱中显示出荧光
。 　　RS1蛋白从大肠杆菌菌株B PTAC RS1细菌（补充表10）中分离出未感染或感染噬菌体T4的RS1蛋白。在12.5 mM Tris-HCl，pH 7.5
、25 mm NaCl ，25 mM KCl和5 mM MGCL2的情况下
，用1 µM ARH1处理Rs1（1.5 µm） 。或者，将Rs1（1.5 µm）用0.5 U内切核酸酶P1处理100 mm mg（OAC）2 ，220 mM NH4CL，500 mM HEPES
，pH 7.5，10 mM EDTA ，100 mMβ-cercapoto-mmβ-cercapto-甲醇和10％的甘油。将摘要在37°C下孵育2小时
。之后
，通过添加9含乙醇来沉淀消化，并在4°C下通过离心（14,000 pm）沉淀1小时。将蛋白质颗粒重悬于10μL1×Laemmli缓冲液中 ，并通过蛋白质印迹分析 。如上所述
，原代抗体MABE1016（MERCK）检测到ADPR修饰
。将ADP-核糖基化RS1的PAN-ADPR信号标准化为TCE染色中的相应带强度。然后将未经处理的RS1的归一化强度除以P1处理的RS1的强度，以产生两种修饰的ADP-核糖基化和rnaylated RS1的分数 。 　　通过将MODB间隔序列引入DS-SPCAS质粒（Addgene ，48645）（补充表10）来产生CRISPR-CAS9间隔质粒
。携带MODB载体PET28_MODB用作CRISPR-CAS9介导的诱变的同源重组的供体DNA。PET28_MODB质粒通过位置定向的诱变修饰
，在此期间突变R73A和G74A暴露于MODB 。R73A突变导致ADP-核糖基转移酶活性失活
。G74A突变位于原始拟孔基序中，以防止Cas9核酸酶裂解供体DNA。施加的引物在补充表9中列出 。将所得质粒测序并转化为大肠杆菌BL21（DE3）
。 　　CRISPR-CAS9介导的诱变基于以前的工作33。具有目标间隔序列和供体质粒PET28A_MODB_R73A/G74A的DS_SPCAS_MODB质粒被共转化为大肠杆菌DH5α 。细胞被噬菌体T4进一步感染（1：10,000噬菌体：细胞） ，并进行了斑块测定。将板在37°C下孵育过夜
，并筛选所得的斑块中的突变体
。通过无菌移液尖端挑选单个斑块，并转移到200 µL Pi -mg缓冲液中（26 mM Na2HPO4 ，68 mm NaCl，22 mm Kh2po4
，1 mm MMGSO4，pH 7.5） ，配备了2 µL CCL3H。将样品在室温下孵育1小时 。接下来
，将2 µL样品转移到新的PCR管中，并加热至95°C 10分钟
。样品进一步用于使用PCR进行DNA扩增（补充表9中列出了引物。通过琼脂糖凝胶电泳纯化扩增的DNA ，并提交用于Sanger测序 。 　　大肠杆菌感兴趣的培养物的OD600大约为0.8-1.0
。接下来
，用100 µL WT T4噬菌体或T4 modb（R73A，G74A）（补充表10）感染了300 µL培养物 ，其定义或未知MOI。将细菌 - 含量悬浮液在37°C下孵育7分钟
，然后转移至4 ml lb柔软的琼脂（0.75％），混合并倒入LB-agar板上（1.5％LB琼脂） 。将板在37°C下孵育过夜 ，并在第二天进行验证
。 　　LB培养基（在500 mL损耗的烧瓶中100 mL）与大肠杆菌B培养物接种过夜至OD600 = 0.1
，然后在37°C下以180 rpm的振动孵育，直到达到OD600 = 0.8。将培养物冷却至室温 ，并被WT T4噬菌体或T4 MODB（R73A，G74A）突变体（补充表10）感染至5的MOI 。在室温下以150 rpm的速度在室温下进一步孵育培养物
。通过在不同感染时间测量OD600（感染后0-200分钟）来跟踪细胞裂解。该实验以生物学三份进行 。 　　LB培养基（在500 mL损耗的烧瓶中100 mL）与大肠杆菌B培养物接种过夜至OD600 = 0.1
，然后在37°C下以180 rpm的振动孵育，直到达到OD600 = 0.8 ，如上所述。该培养物被WT T4噬菌体或T4 ModB（R73A
，G74A）突变体（补充表10）感染，为0.01的MOI ，并在37°C下进一步孵育而不会发抖
。 　　为了确定感染性中心的总数T0（包括未吸附和已经吸附的噬菌体）
，在感染后5分钟，使用100 µL感染培养物用随后的斑块分析来恢复300 µL的大肠杆菌B细胞（OD600 = 1.0）。通过将1 ml感染培养物转移到50 µL CCL3H来确定未吸附的噬菌体（U）的数量 。这样 ，大肠杆菌细胞被破坏
，之后未吸附的噬菌体保持完整，并用于牙菌斑测定
。T0 -U表示最初受感染中心的数量。在感染过程中 ，未经吸附的噬菌体（Uxmin）的数量是连续追踪的
，并用于计算T4-Phage子代的数量（T4-Paggage Grogeny = Uxmin/（T0-U5min）（T0-U5min） 。将噬菌体数量的第一次伪装时间和噬菌体视为phage point point and Phage size pots pots point（T0-U5min）的时间点
。尺寸= uburst1/（t0 -u5min））。 　　使用OriginPro 2020b软件绘制数据 。错误条代表S.D.三个生物学重复的手段
。对于选定的时间点，使用显着性水平为0.05 ，在GGPUBR软件包（v.0.6.0）中实现的R（v.4.2.2）中的双面t检验进行了统计测试。 　　LB培养基（在500 mL损耗的烧瓶中100 mL）与大肠杆菌B培养物接种过夜至OD600 = 0.1，并在37°C下以180 rpm的振动孵育
，直到达到OD600 = 0.8，如上所述 。将培养物冷却至室温 ，并被WT T4噬菌体或T4 MODB（R73A
，G74A）突变体（补充表10）感染，为0.1的MOI
。感染后立即通过牙菌斑测定 ，使用100 µL培养物来确定T0的总感染中心数量。然后在不同感染的不同时间点（感染后0-25分钟）服用100 µL培养物
，并添加5 µL CCL3H以破坏大肠杆菌细胞 。随后，该悬浮液用于通过斑块测定法确定未吸附噬菌体（Uxmin）的数量。吸附率的计算如下：吸附率（％）= 100％ - （Uxmin/t×100％）
。 　　使用OriginPro 2020b软件绘制数据。错误条代表S.D.三个生物学重复的手段 。对于选定的时间点 ，使用显着性水平为0.05
，在GGPUBR软件包（v.0.6.0）中实现的R（v.4.2.2）中的双面t检验进行了统计测试
。 　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得。