通过Paul Brousse和Institut Curie护理中心的患者手术获得新鲜肿瘤样品。所有患者均提供了使用肿瘤样本的书面知情同意书 。该研究得到了机构监管委员会的批准（第587号和Data190160）
。所有clip-1体内实验均符合《德国动物福利法》
，并得到了动物实验机构委员会和上巴伐利亚政府的批准（no。ROB-55.2-2532.VET_02-18-13） 。所有枪内注射小鼠实验均符合所有相关的道德法规，并根据哈佛大学T. H. Chan公共卫生学院的机构动物护理和使用委员会批准的方案进行（协议IS0000003460）
。对于小鼠淋巴和血液的收集 ，根据《动物的护理和使用指南》进行了动物实验。与法国动物处理指南一致
，并由地方伦理委员会批准（协议16487-2018082108541206 V3）进行动物实验 。 　　除非另有说明，否则以最高的商业质量购买了起始材料 ，并没有进一步净化
。通过通过分子筛和活化的氧化铝柱将脱水的溶剂传递到无水溶剂中。使用涂有硅胶或中性氧化铝制的铝板通过薄层色谱（TLC）监测反应（60 F254） 。通过紫外线或用二氢蛋白
，牛糖铵铵或高锰酸钾溶液和加热来观察TLC板
。通过硅胶60（230–400颗粒，内加尔）或氧化铝（激活的中性 ，Sigma-Aldrich）在硅胶60（230–400颗粒
，固定物）上纯化反应产物，并使用梳子升级的NextGen系统和制备性HPLC hplc Quaternary grapentient 2545配备了与光电量298（Waters 298（waters）f的Reverse 2545OBD准备列5μm ，30×150毫米）。使用Bruker 400或500 MHz仪器进行NMR光谱法 。如图所示
，光谱在298 K或310 K时在甲醇-D4，二甲基硫氧化物-D6 ，甲基氯-D2或氯仿-D中运行。1H化学位移δ在PPM中使用残余非溶剂作为内标表示，耦合常数J在Hz中指定
。使用以下缩写：BS
，宽阔的单曲；s，辛格；D ，Doublet；DD
，双重双线；DDD，双打双重双重峰；DT ，三胞胎双打；DQ
，四倍的双重;Q，四曲线；t ，三重态；TD
，Doublet。，Quint 。 ，五重奏；和m
，多重
。13c化学位移δ在PPM中使用残留的非溶剂作为内标表示。最终化合物的纯度被UPLC – MS确定为98％ 。使用配备有光电二极管阵列检测器的水的生科H级记录低分辨率的质谱
。高分辨率的MS光谱记录在Thermo Scientific Q-extrative以及配备有机器人Triversa纳米酸盐趋势上的热量。补充信息中详细介绍了合成小分子的程序 。 　　使用Bruker Topspin（v.4.1.4）软件在310 K的Bruker 500 MHz光谱仪上记录1H NMR光谱，并使用Mestrenova（v.5.0.0.1-35756）或Bruker Topspin（v.4.1.4）软件和化学移动Δ在PPM中进行了分析 ，并在使用PPM的情况下进行了分析
。所有溶液均在甲醇-D4中制备。对于在添加TFA或甲基氧化钠之前用FECL3滴定LIP-1的1H NMR光谱的记录，0.1-1等级 。将FECL3（Alfa Aesar
，12357，2 µL ，145 mm）的溶液添加到Lip-1溶液中（Sigma-Aldrich
，SML1414，600 µL中的1 mg）
。然后 ，添加了TFA（Sigma-Aldrich
，T6508，Lot STBG1988V ，20 µL
，3式438毫米）的溶液或添加了甲基氧化钠（Eurisotop，D076Y ，Lot R2621
，1 µL）的溶液。对于用FECL3滴定的LIP-1和萘的1H NMR光谱的记录，0-1等级 。在LIP-1（500 µL中的1 mg）和萘（Sigma-Aldrich ，147141，1 eq。
，100 µL，28.9 mm）上添加FECL3（3 µL ，97 mm）的溶液（3 µL
，97 mm）
。每次添加后，将溶液搅拌几秒钟 ，并记录NMR光谱。 　　用三电极细胞进行循环伏安26实验 。使用饱和的钙甲洛尔电极作为参考
，将直径3 mm的稳定玻璃碳电极作为工作电极和铂金属丝作为反电极
。使用NOVA软件（v.2.1），在室温下以μ-autolab III的形式记录所有环状伏安图 ，扫描速率为0.1 V s – 1。HPLC级乙腈和甲醇用于记录 。对于所有实验
，均使用乙腈中的NBU4NBF4（0.1 m，32.9 mg ML – 1库存溶液）
。用500 µL的20 mm FECL3溶液在Milliq水和9.5 mL乙腈中制备10 mL的1 mM Fecl3储备溶液。然后 ，将40 mM的DFO
，LIP-1，MetClip-1（内部）或ALCLIP-1（内部 ，内部，在乙腈或甲醇中溶液）的5 µL（0.2等式）添加到1 mm的1 mm Fecl3溶液中
，直到1 mm，直到1.0 eq 。达到了
。每次添加后 ，将溶液搅拌几秒钟
，并记录伏安图。 　　使用Gaussian 16（参考文献50）在BHLYP/SVP水平的所有原子（铁（III）配合物的六旋转状态）（高斯16，修订版C.01）上优化所有结构 。对Gibbs自由能的热校正在310.15 K下计算
。使用SMD溶剂化模型（甲醇）进行UMP2/SVP水平的单点。列出的结果是Kcal mol – 1中的ΔG310 。 　　用乙腈 - 乙酸盐缓冲液（10 mm ，pH 5
，2：1，v/v）稀释RPE（内部 ，10 mm）在DMSO中的溶液
，以达到10 µm的浓度。在96孔板中，三种RPE（100 µL ，10毫米）和10、20或50等式的溶液
。制备了LIP-1（内部1 、2或5 µL 10 mm储备溶液）
，并将溶液混合几次。然后，10式 。将FECL3（1.0 µl乙腈 - 乙酸盐缓冲液（10 mm ，pH 5，2：1
，v/v））添加到每个溶液中并再次混合
。使用SoftMax Pro 7.1 GXP软件，使用荧光计（Tecan Spark 10 m）（λEX= 510 nm ，λem= 540-700 nm）记录光谱。使用了UPLC级乙腈
，甲醇以及Milliq水 。 　　A conical centrifuge tube (15 ml) was charged with unilamellar liposomes of egg phosphatidylcholine (0.4 ml of a 20 mM suspension in PBS, 100 nm average diameter), 134 ml of a 12 mM solution of (E)-1,2-bis((2-methyldecan-2-yl)oxy)diazene (Cayman, 32742) in ethanol andPBS（pH 7.4时7.46毫升12毫米）并涡旋
。然后添加型 - 博迪比（在DMSO中的1.74 mm溶液），然后悬浮涡流一次。将脂质体 - 燃烧器 - dye混合物转移到储层中 ，并使用300μl多通道移液器
，将96孔板（黑色，NUNC）带动混合物（每孔为295μl） 。添加测试化合物（5μl在乙腈中的0.24 mM溶液）以使最终体积达到300μl
。使用多通道移液器手动混合井的含量 ，然后在37°C中混合在微孔板读取器中1分钟
，然后通过荧光（λex/λem= 488/518 nm）监测型 - 前生的氧化。使用Agilent Biotek Gen5软件（V.3.08.01）收集数据 。 　　抗体注释如下：WB，Western印迹；FCY ，流式细胞仪；FI
，荧光成像；胡，用于人类样品；MS ，用于鼠标样品
。指示稀释。制造商的任何抗体验证均可在制造商的网站上找到 。指出了有关相关抗体的抗体验证敲低（KD）和/或基因敲除（KO）策略。使用了以下主要抗体：AIFM2/FSP1（默克，MABC1638
，克隆6D8-11，Lot Q3745998 ，WB
，1：500，HU ，KD验证了内部验证）；过氧化氢酶（细胞信号传导
，12980T，克隆D4P7B ，批次3
，FI，1：200 ，HU）;CD3-BV510（Biolegend
，317332，Clone Okt3 ，Lot B263750，FCY
，1：100，HU）;CD31-PE-CY7（Biolegend ，303118
，克隆WM59，Lot B276836 ，FCY
，1：100，HU）;CD31-BV605（Biolegend ，303122
，克隆WM59，Lot 331683 ，FCY
，1：100，HU）;CD31-BV605（Biolegend ，102427，克隆390
，Lot B375532，FCY ，1：100
，MS）;CD44（ABCAM，AB189524 ，Clone EPR18668
，Lot 1014086-32，WB ，1：30,000
，Hu，Ko和KD验证了内部验证）；CD44-AF647（Novus生物学 ，NB500-481AF488
，Clone Mem-263，Lot P158343 ，FCY，1：100
，HU）;CD44-AF647（Novus生物学，NB500-481AF647 ，Clone Mem-263
，Lot D145771，FCY ，1：100
，HU）;CD44-AF647（Biolegend，103018 ，克隆IM7
，Lot B317762，FCY ，1：100
，MS）;CD45-BV785（Biolegend，304048 ，克隆HI30，Lot B339809
，FCY，1：100 ，HU）;CD45-BV510（Biolegend
，368526，克隆2D1 ，批次B373428
，FCY，1：100 ，HU）;CD45-BV510（Biolegend
，103138，克隆30-F11 ，Lot B386738
，FCY，1：100 ，MS）;CD163-PERCP/CYANINE5.5（Biolegend，326512
，克隆RM3/1，Lot B291202 ，FCY
，1：100，HU）;Coxiv（Abcam ，AB16056
，Lot GR3206555-1，WB ，1：1,000
，HU）;细胞色素c（细胞信号，12963s ，克隆6H2.b4
，批次2，fi ，1：200，hu）;EEA1（ABCAM
，AB70521，克隆1G11 ，批次GR315680-1
，FI，1：200 ，HU
，通过制造商的免疫细胞化学/免疫荧光验证）；FAP-AF700（R＆D Systems，Fab3715N ，克隆427819
，Lot AEVI020011，FCY ，1：100
，HU）;FAP-AF750（Bio-Techne，Fab3715S-100UG ，克隆427819，Lot 1718688
，FCY，1：100 ，HU）; 铁蛋白（ABCAM
，AB75973，克隆EPR300AY ，批次10136442-29
，WB，1：1,000 ，HU
，由WB由制造商验证）；纤连蛋白（ABCAM，AB45688 ，克隆F14
，批次1016266-35，WB ，1：1,000，HU）;FTH1（Santa Cruz Biotechnology
，SC-376594，克隆B-12 ，Lot G2622
，WB，1：200 ，Hu）;GPX4（ABCAM
，AB125066，Clone Epncir144 ，Lot GR3369574-4
，WB，1：2,000 ，HU
，KO，由制造商验证的KD验证 ，内部验证）；4-HNE（ABCAM，AB48506
，克隆HNEJ-2，批次1062274-2 ，FI
，1：200，HU）;IRP2（Novus Biologicals ，NB100-1798
，Lot D-4，WB ，1：1,000
，Hu）;lamin a/c（细胞信号，2032S ，Lot 6
，wb，1：1,000 ，hu）;LAMP1（细胞信号传导，9091
，克隆D2D11，Lot 7 ，fi
，1：200，hu）;LAMP1（Santa Cruz Biotechnology ，SC-20011
，克隆H4A3，FI ，1：100
，MS）;LAMP1（ABCAM，AB24170 ，LOT GR3235630-1
，WB，1：1,000 ，HU）;LAMP2（ABCAM，AB25631
，克隆H4B4，批次1011336-1 ，FI
，1：200，HU）;LAMP2（Thermo Fisher Scientific ，MA1-205
，克隆H4B4，Lot YG377512 ，WB
，1：1,000，Hu）;Limpii（ProteIntech ，27102-1-AP
，WB，1：1,000 ，Hu）;NCOA4（ABCAM，AB86707
，LOT GR3244520-13，WB ，1：10,000
，HU，KD在内部验证）；NDUFS1（ABCAM ，AB157221
，克隆EPR11522（b），Lot YJ110907DS ，WB
，1：1,000，HU）;PDIA3（Sigma-Aldrich ，Amab90988
，Clone CL2444，Lot 02879 ，FI，1：200
，Hu; WB，WB ，1：1,000
，Hu）;MHCII-APC/Cyanine7（Biolegend，107628 ，克隆M5/114.12.2
，Lot B370049，FCY ，1：100
，MS）;RCAS1（细胞信号，12290S ，克隆D2B6N
，Lot 1，FI ，1：200，Hu
，WB，1：1,000 ，Hu）;SLC7A11/XCT（Cell Signaling
，12691，克隆D2M7A ，Lot 5
，WB，1：1,000 ，HU
，KD验证的内部验证）；Sox4（Santa Cruz Biotechnology，SC-518016 ，克隆B-7
，Lot G2023，WB ，1：200，Hu）;TFR1（Life Technologies
，13-6800，Clone H68.4 ，Lot VJ313549
，WB，1：1,000 ，Hu
，Ko和KD验证了内部验证）；TFR1-APC-AF750（Beckman Coulter，A89313 ，克隆YDJ1.2.2
，Lot 200060，FCY ，1：100
，HU）;TFR1-PE（Biolegend，334106 ，克隆CY1G4，批次B364886
，FCY，1：100 ，HU）;γ-微管蛋白（Sigma-Aldrich
，T5326，Clone GTU-88 ，Lot 0000140390
，WB，1：1,000 ，HU
，由制造商验证）；和波形蛋白（细胞信号，5741s ， 克隆D21H3
，Lot 8，WB ，1：1,000，Hu）
。使用了以下二级抗体：Alexa Fluor 647抗小鼠（ABCAM
，AB150115，组织标签 ，1：500
，MS）；Alexa Fluor 647抗小鼠（Invitrogen，A21237 ，Lot 1485202
，FI，1：1,000 ，Hu）;Alexa Fluor 647抗兔（Invitrogen
，A21246，Lot 2714437 ，FI
，1：1,000，HU）;驴抗兔IgG-H+L HRP偶联（Bethyl Laboratories ，A120-108p，Lot 13
，WB，1：10,000 ，HU）;山羊抗小鼠IgG-H+L HRP偶联（Bethyl Laboratories
，A90-116p，Lot 39 ，WB
，1：10,000，HU）;和山羊抗大鼠IgG-H+L HRP偶联（Invitrogen ，31470
，WB，1：10,000 ，HU）。 　　从ATCC获得HT-1080细胞
，MDA-MB-231和4T1细胞 。在补充谷氨酸（Gibco，61870010）和10％FBS（Eurobio Scientific ，CVFSVF00-01）的RPMI 1640中培养解离的人和小鼠肿瘤细胞和4T1细胞
。将HT-1080细胞培养在Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM） - Glutamax（Gibco，61965059）中
，并补充了10％FBS（Gibco，10270-106）和Peniciclin-Stroptomycin（Biowhittaker/Lonza ，biowhittaker/lonza
，de17-602e）。将MDA-MB-231细胞培养在补充丙酮酸（Thermo Fisher Scientific，31966021）的DMEM – Glutamax中 ，并补充10％FBS和青霉素 - 链霉素（Gibco
，15140148） 。FC1242和FC1245小鼠胰腺癌细胞，4A细胞和人类胰腺HMIA-2D细胞是Tuveson实验室（冷泉港实验室）的礼物 ，并在DMEM-GLUTAMAX中培养
，补充了10％FBS和青霉素 - 链霉菌素
。原发性人类胰腺PDAC024T，PDAC030T ，PDAC053T
，PDAC054T，PDAC084T ，PDAC090T和PDAC211T细胞生长在无血清辅导性辅导型中培养基dmem/f12中（Gibco，105565018）
，带有0.65018）GITAM（Sigma-Aldrich，3376） ，500毫升葡萄糖（Sigma-Aldrich
，g6152），1：200 ITS+（Corning ，354352）
，1：20 nu-serum IV（Corning，355104） ，100 ng ml – 1 Cholera toxin
，1 µm drrane-1 µmetha，1：20D4902） ，50 nm 3,3'
，5-Triiiodo-硫代氨酸（Sigma-Aldrich，T6397）和青霉素 - 链霉素）。新鲜的牛垂体提取物（Gibco ，13028-014，22.7 ng ML – 1）和50 ng ML – 1无动物的无动物重组人EGF（Thermo Fisher Scientific
，AF-100-15-15-1MG）在细胞分开或铺路时将其添加到新培养基中 。SUM159 cells were cultured in Ham F12, GlutaMAX (Gibco, 31765035), NEAA (Gibco, 11140050), antibiotic–antimycotic (Thermo Fisher Scientific, 15240062), insulin (Humalog, Cip: 3400934142680), hydrocortisone (Sigma-Aldrich,H0888-10G）和5％FBS（Thermo Fisher Scientific，A5256701）
。原发性肺循环肿瘤细胞（Celprogen ，36107-34CTC
，地段219411，性别：女性） 和原代结肠循环肿瘤细胞（Celprogen ，36112-39CTC
，Lot 20188，性别：女性）是使用干细胞完整培养基（Celprogen ，M36102-29PS）生长的
，直到第三次通过。在干细胞ECM T75-Flasks（Celprogen，E77002-07-T75）中生长循环癌细胞 。使用DMEM高葡萄糖和10％FBS ，2 mM-谷氨酰胺和1％青霉素 - 链霉素培养PFA1细胞
。 　　手术后从患者那里收集肿瘤样品。肿瘤样品来自PDAC
，UPS，脂肪肉瘤 ，造型性肉瘤，上皮肉瘤或PDAC肝转移的患者 。根据制造商的规程
，使用人类肿瘤解离试剂盒（Miltenyi，130-095-929）解离肿瘤。简而言之 ，将肿瘤切成小块（1-5毫米）
，将rpmi的酶混合物放入酶混合物中，并使用适当的GentleMacs程序（37C_H_TDK）的加热器（Miltenyi）使用GentleMacs Octo octocociator分离
。根据肿瘤样品 ，根据制造商的方案
，将9.4 mL RPMI培养基与相应的酶浓度一起使用。根据制造商的协议，使用小鼠肿瘤解离试剂盒（Miltenyi ，130-096-730）分离小鼠肿瘤样品 。将肿瘤切成小块（1-5毫米）
，将rpmi的酶混合物放入酶混合物中，并使用适当的GentleMacs程序（37C_M_TDK）使用GentleMacs Octo octo cococotiator分离
。随后 ，将解离的肿瘤悬浮液应用于MACS SmartStrainer（30 µM）（Miltenyi）。将样品用1×PBS稀释
，并以300克离心 。将细胞颗粒重悬于RPMI（含10％FBS和青霉素 - 链霉素）中，并使用自动细胞计数器（Entek）计数细胞
。解离细胞的总群体表示为解离的肿瘤细胞 ，而通过阴性选择对应于肿瘤的癌细胞对应的亚群（请参见“流式细胞术”部分）表示为解离肿瘤癌细胞。 　　这些模型最初来自患者衍生的异种移植（PDX）模型 。在生物安全室中处理了指定用于细胞培养的PDX片段
。切成小块后，用胶原酶V型（Sigma-Aldrich
，C9263）和胰蛋白酶-EDTA（Gibco，25200-056）处理 ，并悬浮在DMEM中
，补充了1％W/W青霉素 - 链霉菌素 - 链霉菌素和10％FBS。离心后，将细胞重悬于无血清导管培养基中 ，该导管培养基在37°C下于5％CO2孵化器中的先前方案51改编 。放大细胞存储在液氮中
。测试前
，将细胞从抗生素中断奶超过48小时。该协议用于建立指定为PDAC024T，PDAC030T ，PDAC053T
，PDAC054T，PDAC084T ，PDAC090T和PDAC211T的单元 。 　　异种移植的胰腺器官（XDPO）模型最初源自PDX模型。异种移植物分为几个小块
，并在生物安全室中加工
。切成小块后，使用人类肿瘤解离试剂盒（Miltenyi ，130-095-929）对其进行处理。用Accutase（Thermo Fisher Scientific，A1110501）在37°C消化未消除的颗粒30分钟 。将胰组织浆液转移到100μm组织滤网中
，然后将其放入涂有150μlGFRMatrigel（Corning，354230）的12孔板中
。The samples were cultured in pancreatic organoid feeding medium, which consisted of advanced DMEM/F12 supplemented with 10 mM HEPES (Thermo Fisher Scientific, 15630056), 1× GlutaMAX (Thermo Fisher Scientific, 35050087), penicillin–streptomycin, 100 ng ml–1 animal-free recombinant human FGF10 (Thermo Fisher Scientific,500-P151G-50UG） ，50 ng ML – 1无动物重组人EGF（Thermo Fisher Scientific
，AF-100-15-1MG），100 ng ML – 1重组人Noggin（Bio-Techne ，6057-ng）
，WNT3A介质（30％v/v），介质（30％v/v）胃蛋白1（Sigma-Aldrich ，SCP0152）
，10 mm烟酰胺（Sigma-Aldrich，N0636） ，1.25 mm N-乙酰基半胱氨酸（Sigma-Aldrich
，A9165），1×B27（Thermo Fisher Scientific ，17504001），5000101（1×B27）和10.5μmY27632（Tocris
，1254/1）。将板在37°C的5％CO2孵化器中孵育，并每3-4天更换培养基 。此过程用于生成XDPOS PDAC009T ，PDAC003T
，PDAC117T和PDAC372T
。 　　为了进行化学敏感性分析，将XDPO铺成96孔板 ，然后逐渐增加药物浓度。使用CellTiter-Glo 3D（Promega
，G9683）处理后72小时测量细胞活力 。在第0天和第3天计算了XDPO生存能力的XDPO生存能力的两倍时间
。第3天比第0天的比率对应于72小时时细胞的复制率（RR）。使用公式72×2/RR计算加倍时间 。使用Tristar LB941读取器（Berthold Technologies）对荧光和发光值进行定量
。每个实验至少进行了至少三次重复进行三次。 　　将PDAC053T细胞以每个孔的2×105细胞密度为6孔板中 。将RSL3（Sigma-Aldrich，SML2234
、0.5、2和10μM与Lip-1（1 µM） ，Clip-1（1 µM）
，ALCLIP-1（10 µM）或MetClip-1（10 µm）或MetClip-1（10 µm）一起添加在一起。24小时后，回收培养基并将细胞胰蛋白酶素化
。收集细胞 ，与回收的培养基一起沉淀
，并用1×PBS洗涤。接下来，根据制造商的协议（Annexin-V流式细胞仪套件 ，Thermo Fisher Scientific，v13242）
，添加了100μl的1倍膜联蛋白-V结合缓冲液，其中含有膜联蛋白-V和碘化丙啶 。为流式细胞仪添加了含有10％FBS和EDTA（0.1％V/V）的1×PBS缓冲液（0.1％V/V）
。使用Attunetm NXT流式细胞仪进行流式细胞仪 ，并使用FlowJo分析数据。 　　将PDAC053T细胞以每个孔的2×105细胞密度为6孔板中 。第二天
，将细胞用siRNA转染，如“ RNA干扰 ”部分所述
。转染后6小时更换培养基。转染后三天 ，用指定浓度的芬托-1处理细胞6小时 。使用Annexin-V AF488（Thermo Fisher Scientific
，A13201）和Sytox Blue（Thermo Fisher Scientific，S34857）分析细胞死亡
。使用Attunetm NXT流式细胞仪进行流式细胞仪 ，并使用FlowJo分析数据。 　　使用细胞毒性检测试剂盒（Sigma-Aldrich
，11644793001）根据制造商的协议在96孔板中测量LDH释放 。使用CellTiterGlo 2.0（Promega，G9241）或CellTiter Blue（Promega ，G8081）试剂盒根据制造商的规程在96孔板中评估细胞活力
。简而言之
，在实验前24小时24小时，将4,000个细胞（HT-1080 ，PDAC053T或4T1）在透明底部播种，并在透明底部播种并变暗96孔板（Greiner
，655090，Lot E23063EG）。然后 ，用Lip-1（10 µm）
，Clip-1（10 µm），Ferrostatin-1（Sml0583 ，10 µm）
，DFO（Sigma-Aldrich，D9533 ，100 µm）
，Deferasirox（Cayman Chemical，16753 ，16753
，1019，DECRONE）（SIGMAN ，DECRONE）（SIGMAN，DECRONE）（SIGMAN
，DECRONE（SIGMAN），100 µm） ，α-生育酚（100 µm）
，维生素K3（Sigma-Aldrich，M5625-25G ，10 µM）
，Z-VAD-FMK（Enzo Life Sciences，ALX-260-020-260-020-M005 ，50 µm）或Necrostatin-1（Necrostatin-1（Sigma-Aldrich
，N9037） 。随后，加入Fento-1（10 µm ，6 h）。对于剂量反应测量
，在指示的时间内用各自的分子用不同量的细胞处理细胞
。按照制造商协议中的详细说明处理样品，并在Spectramax ID3板读取器（分子设备）上记录数据。对于护理标准的细胞可容纳性测量 ，在实验前24小时将细胞以2,000个细胞的形式铺板 。将细胞与Fento-1，Irinotecan（Sigma-Aldrich
，i1406），5-氟尿嘧啶（5-Fu; alfa; alfa aesar ，a13456-06）或oxaliptin（Bio-Techne
，2623）孵育72小时
。 　　将细胞铺在96孔板中，将其孵育24小时 ，然后用Lip-1（1 µM）预处理10分钟
，然后用媒介物对照或Fento-1处理24小时。24小时后，仔细去除去培养基 ，无血清培养基和50μLMTT溶液（Cayman Chemical
，21795）的每孔添加 。将板在37°C下孵育3小时
。孵育后，除去溶液 ，并添加每孔100μLDMSO。在读取板读取器上的吸光度之前
，将板盖住并在轨道振动筛上摇动15分钟（OD = 590） 。对于RSL3处理，将PFA1细胞接种在96孔板中（每个孔2,000个细胞） ，并培养过夜
。第二天，将细胞用RSL3（500 nm）处理
，并在连续稀释中指定的小分子。对于4-OH-TAM治疗，将PFA1细胞用4-OH-TAM（1μM）（1μM）和指定化合物的稀释系列播种在96孔板（每孔500个细胞）中 。24 h（对于RSL3）或72 h（对于4-OH TAM）孵育后 ，使用芦祖津作为细胞可转化指标评估细胞活力
。使用Spectramax ID5微板读取器
，在含有0.004％reasazurin的标准细胞培养基中孵育4小时后，使用Spectramax ID5微板读取器在λEX/λEM= 540/590 nm处测量荧光强度。 　　使用Alamar Blue Assay评估了全剂量的Fento-1以及RSL3或ML210对细胞活力的影响 。为了确定细胞活力 ，将3,000个HT-1080或MDA-MB-231细胞在治疗前20小时左右的96孔板中播种在带有标准培养基（10％FBS和1％青霉素 - 链霉素）的96孔板中。用0.5 µM Fento-1和/或0.5 µM Lip-1预处理细胞1小时
。在48小时的RSL3或ML210（Sigma-Aldrich
，SML0521-5MG）处理后，进行了细胞可为性测定。通过溶解0.5 g硫唑嗪钠盐（Sigma-Aldrich ，263-718-5）中的Alamar Blue溶液在100毫升无菌PBS中制成
，并通过0.22 µM滤波器过滤无菌 。孵育2小时后，通过使用540±20 nm激发滤光片测量荧光和在火花微孔读取器（TECAN）上测量590±20 nm发射滤波器来评估生存能力
。 　　使用incucyte生物成像平台（ESSEN）收集细胞死亡的动力学。在治疗前1天 ，将细胞在96孔板（每孔3,000个细胞）中播种 。将细胞与Fento-1与LIP-1（0.5 µM）在氟橄榄石DMEM培养基（Thermo Fisher Scientific A1896701）中的结合处理
。每小时每小时捕获四个图像
，分析并平均数据。基于掺入DRAQ7（0.1 µM，细胞信号 ，7406s）测量细胞死亡 。在每种情况下，每个细胞总数收集数据作为DRAQ7阳性细胞的计数
。 　　在添加阿霉素之前
，将约2×106 HT-1080细胞铺在T75烧瓶中（Clinisciences，HY-15142 ，25 nm）。用1×PBS缓冲液洗涤烧瓶
，每3-4天更换含有阿霉素（25 nm）的培养基 。在用阿霉素治疗30天后，将4,000个细胞铺在每个孔中的96孔板中 ，以评估用芬托-1处理后的细胞活力
。 　　将约1×106的SUM159细胞铺在10 cm的培养皿中
，以完全生长培养基。在最大抑制浓度（IC50）浓度（150 nm）的一半抑制浓度（150 nm）下，用阿霉素处理种子细胞 。72小时后 ，将细胞洗涤并用Fento-1（5 µM
，72 h）或0.2％DMS​​O处理，而无需药物。72小时后 ，洗涤细胞
，并用完全生长培养基代替处理
。10–15天后，将细胞洗涤 ，固定并用乙酸和甲醇（1：7）和1％Coomassie Blue在室温下进行染色。使用SCAN1200菌落计数器（Interscience）计数具有> 100个细胞的菌落数量 。 　　将细胞铺在96孔板中（每孔5,000个细胞）
。12小时后，将细胞用5-FU（SelleckChem
，S1209，5 µm） ，吉西他滨（Selleckchem
，S SelleckChem，S1714 ，1 µM）
，Oxaliptin（SelleckChem，S1224 ，20 µm）
，Paclitaxel（Paclitaxel，SelleckChem ，SelkeckChem
，S1150，0.150 ，0.1 µm）或SNECK-38（SEARECKCHEM）（SELLECKCHEM）（SELLECKCHEM）（SELLECKchem）单独使用0.1 µm）或与Fento-1（1.5 µm）组合72 h。按照制造商的说明，在添加Prestoblue（Life Technologies
，A13261）的2小时后估计细胞活力 。为了确定对标准药物和Fento-1之间细胞增殖或细胞活力的协同作用，我们使用了软件协同作用
。为了分析此效果 ，将ZIP评分用作计算协同作用52的模型。 　　在标准条件下与水和食物相关的标准条件和受控环境保持小鼠（22±2°C
，55±5％湿度，12小时的光周期循环） 。对于动物研究 ，将C57BL6/J小鼠随机分为单独的笼子
。年龄12-24周的小鼠使用性别匹配的小鼠进行所有实验。为了进行生存队列研究
，Rosa26-Creert2; GPX4F/F小鼠用他莫昔芬（Sigma-Aldrich，T2859 ，T2859
，MyGlyol 812中溶解在MyGlyol 812中）在0和1中腹膜内治疗，以在0和1中溶于GPX4 ，以在Brain2中删除GPX4 。从第2天开始
，CLIP-1（内部，每公斤10 mg每公斤10 mg溶解在含有20％PEG400的1×PBS中 ，每天将5％的溶质醇HS15和5％溶剂酚HS15）或车辆腹膜内腹膜内每天用于小鼠施用，直到完成生存研究
。对于组织化学分析
，使用了腹膜内他莫昔芬注射治疗的Rosa26-Creert2； GPX4F/F小鼠（在第0天和第1天每天2 mg）。在第7天，将CLIP-1（内部 ，10和100 mg kg – 1）或车辆腹膜内注射到小鼠中 。注射后1小时
，将小鼠安乐死，并按照“使用点击化学
”的“小分子标记”部分处理肾脏和肝样品。 　　BALB/C小鼠（25周龄的女性）购自查尔斯河（Charles River） ，并安置在CRCM动物核心设施中
，并将其随机分为单独的笼子
。年龄12-24周的小鼠使用性别匹配的小鼠进行所有实验。在无菌条件下用灭菌食品和水提供了小鼠，并随意提供水 ，并保持在12小时的浅色周期和22±2°C
，湿度为55±5％ 。在收集淋巴，血液和血清之前 ，没有对小鼠进行任何程序
。 　　对于淋巴样品收集
，在实验开始前30分钟，丁丙诺啡（buprecare）（一种镇痛）是通过腹膜内注射（0.5 mg kg – 1）进行的。通过腹膜内注射氯胺酮 - 氧基氮组合（氯胺酮100 mg kg – 1（imalgène）和甲苯嗪10 mg kg – 1（rompum）； 20 µl g – 1） ，对小鼠安乐死 。皮肤和腹膜切口后，使用玻璃毛细管收集肠道淋巴结中的淋巴
。将淋巴样品放入冷冻管中
，在-20°C下冷冻，并在-80°C下储存。 　　对于血液和血清样品收集 ，淋巴收集后
，我们通过胸腔切开术进行了末端心脏穿刺（用1-2 mL注射器）进行终末心脏穿刺（23 g针），以收集大量的没有抗凝剂的血液 。接下来 ，将100-200 µL的血液样品放在小瓶中
，在-20°C冷冻，并储存在-80°C下
。将其余的血液样品保持在室温下30分钟 ，然后以2,000克离心15分钟。将上清液（血清）收集在小瓶中
，在-20°C下冷冻，并在-80°C下储存 。 　　HT-1080细胞在148 cm2圆形盘中生长在70％汇合处 ，并用芬托-1（1 µM
，48 h）处理
。收集全细胞提取物，然后在4°C下以500克离心5分钟 ，用冰冷的1×PBS洗涤3×，并使用裂解缓冲液（8 M尿素
，200 mM碳酸氢盐和完整的蛋白酶抑制剂鸡尾酒（Roche，Roche ，roche
，000000011116974988001））。通过在25 R.P.M.在4°C下45分钟 。将裂解物在4°C下以20,000g的速度离心20分钟，并且含有总蛋白的上清液用于定量全球蛋白质组学分析。简而言之 ，通过在57°C下与5 mm二硫苏糖醇在57°C孵育30分钟
，然后在室温下用碘乙酰胺（10 mm，30分钟）在黑暗的黑暗中用烷基化30 µg总蛋白质细胞裂解物
。将胰蛋白酶/LYSC（Promega）在1：100（w/w）酶中添加到底物中。消化在37°C过夜 。然后将样品加载到定制的C18 Stagetips（lavteSpe disk bio c18-100.47.20 ，affinisep）上进行脱毛
。使用40:60乙腈和H2O+0.1％甲酸的比率洗脱肽
，并用Speedvac浓缩到干燥度。在液相色谱 - 变速器质谱法（LC -MS/MS）之前，将肽在0.3％TFA中重构 。 　　LC使用征服的NEO LC系统（Thermo Scientific）与Orbitrap星体质谱仪耦合 ，该系统由纳米喷雾flex ION源（Thermo Scientific）连接
。将肽注射到C18色谱柱（内径为75 µm×50 cm双纳米植物pepmap Neo
，2μm，100Å ，100Å，Thermo Scientific）在50°C下进行调节
，并用线性梯度分离，并用线性梯度从100％H2O和0.1％Formic Aid Acit Acet -Buberiat AcetIr（100％酸）（100％酸）（100％酸）（100％actIN）（100％actin）（100％酸）（100％actin）（在104分钟内的300 nl最小值– 1。该仪器以数据无关的采集（DIA）模式运行 。MS全扫描记录在质心模式下的Orbitrap质量分析仪上 ，范围为380-980 m/z
，分辨率为240,000，是标准化的自动增益控制（AGC）目标 ，设置为500％
，最大注射时间为5 ms
。星体分析仪中的直径在质心模式下进行380-980 m/z的质量范围为2 dA（无重叠），最大注射时间为3 ms ，使用更高能量的碰撞碰撞能量（25％的归一化碰撞能量）片段后的归一化AGC目标为500％。 　　为了识别
，使用默认搜索设置，使用Spectronaut（V.18.7或V.19; Biogognosys）对Homo Sapiens（UP000005640）Uniprot数据库进行了搜索 。将酶的特异性设置为胰蛋白酶 ，并最多允许两次丢失的裂解
。氨基甲基甲基设置为固定修饰
，氨基末端乙酰化和蛋氨酸的氧化设置为可变修饰。使用myproms（v.3.10; https：//github.com/bioinfo-pf-curie/myproms)54进一步处理所得文件 。对于蛋白质定量，允许在比较的条件（TOPN匹配）之间具有质量型肽的XIC ，并允许裂解和氨基甲基甲基化。将肽水平的中值和比例归一化应用于总信号上，以纠正每个生物独立复制的XIC（n = 5）
。为了评估蛋白质丰度变化的重要性
，进行了线性模型（对肽和生物学重复进行调整），并对该模型估计的折叠变化进行了两侧t检验。然后 ，使用Benjamini-Hochberg错误分辨率程序调整P值 。MS蛋白质组学的原始数据已通过Pride Partner Repository55沉积到ProteOmeXchange联盟中
。 　　将小鼠乳腺癌细胞（4T1）移植到6-8周龄的雌性BALB/C小鼠中（带有4T1模型的同步性）。小鼠被安置在哈佛医学院动物核心设施中
，并随机分为单独的笼子 。在无菌条件下用灭菌食品和水提供了小鼠，并随意提供水 ，并保持在12小时的浅色周期和22±2°C
，湿度为55±5％
。为了对淋巴结进行注射，首先通过注射2％Evans蓝色染料（Sigma-Aldrich ，E2129）将淋巴结液追溯到脚踏板5分钟之前
，然后进行肌内注射。注射埃文斯蓝色染料后，使用异氟烷对小鼠进行麻醉 ，并在右Popliteal淋巴结区域进行小（5-10 mm）切口 。淋巴结位于Evans蓝色染色的基础上
，用镊子固定，并使用27 G Hamilton注射器将悬浮在1×PBS中的1-2×104个细胞注射到Popliteal淋巴结中
。通过可见的淋巴结肿胀证实注入淋巴结。使用手术胶（3M Vetbond Tissue粘合剂 ，1469SB）闭合切口，并密切监测小鼠的疼痛或困扰迹象 。一旦在至少75％的小鼠（注射后大约1周）中可以触及肿瘤
，每隔一天，每隔一天将10μLFento-1（每只动物0.003 mg）或车辆内形输送到耐肿瘤淋巴结中 ，直到实验终点
。每周使用卡尺进行3次测量
，直到小鼠队列中的任何肿瘤达到其最大直径为2.0 cm，这是这些实验的预定实验终点。对于所有实验 ，最大允许的肿瘤直径均不超过 。那时
，根据批准的方案，对队列中的所有小鼠均被安乐死 ，以分析诺第座性肿瘤直径
，肿瘤质量和其他参数。在实验端点， 以对样本身份或治疗盲目的方式收集了肿瘤形成的数据
。为了确定生存曲线 ，应用了基于肿瘤大小的生存率方法
，每项在伦理上可接受的截止值中，以1.5 cm为建议的预定生存率 ，以确定小鼠研究中的治疗效率56。肿瘤大小以二维的长度（x轴）和宽度（y轴）测量，X轴通常定义为肿瘤的最长轴 。肿瘤大小表示为肿瘤直径（CM）或肿瘤体积（CM3）
，如每个体内实验所示
。将肿瘤样品在FBS中的10％DMSO中冷冻（1°C min – 1 – 1 – 80°C），以进行随后的细胞分析。未使用正式的随机技术 。但是 ，将动物随机分配给治疗组
，并按任意顺序处理标本
。对于所有实验，将小鼠保持在正常的食物饮食上并随意喂食。 　　将细胞铺在盖玻片上 ，并如图所示 。Bodipy 665/676（Thermo Fisher Scientific
，B3932，10 µm ，45分钟）
，Lysotracker深红色（Thermo Fisher Scientific，L12492 ，100 nm
，45 min，45 min ，45 min），DND-189 Lysossensor（Thero Fisher Scientific
，Thero Fisher Scientific，L7535 ，L7535
，L7535，100 n Nm ，1 H）
，LIPERO，1 H）在固定之前 ，将1 µm
，1 h）和SQSS（内部，50 nm ，1 h）添加到活细胞中
。为了进行共定位研究
，在转导后16小时的指示温度下，用Fento-1（1 µM ，1小时）或Marmycin（内部，1 µM
，1 h）处理细胞。转导后16小时，将BACMAM转移的细胞用RSL3（1 µM）处理15分钟或3小时15分钟 ，然后用Bodipy 665/676处理45分钟
，以得到1小时和4小时的最后时间 。为了将脂质过氧化物与溶酶体共定位，将细胞用RSL3（1 µM）和Bodipy 665/676和DND-189 Lysosensor或Liperfluo和Lysotracker深红色处理1小时
。为了在存在α-生育酚的存在下评估Fento-1的荧光强度 ，用α-生育酚（Sigma-Aldrich
，Phr1031，100 µM ，2 H）和Fento-1（1 µM）预处理细胞。然后将细胞用1×PBS洗涤3次
，用2％多聚甲醛在1×PBS中固定12分钟，然后用1×PBS洗涤3次 。对于抗体染色 ，将细胞用0.1％Triton X-100在1×PBS中透化5分钟
，并用1×PBS洗涤3次。随后，将细胞在2％BSA（Euromedex ，04-100-812-E），0.2％Tween-20和1×PBS（阻止缓冲液）中阻塞20分钟
。将细胞与相关抗体在室温下阻止缓冲液中孵育1小时
，用1×PBS洗涤3次，并与二抗孵育1小时。最后 ，用1×PBS将盖玻片洗涤3次
，并使用含有DAPI的Vectashield安装（Vector Laboratories，H-1200-10） 。Bodipy 665/676和通过冰冷的试剂固定经过脂肪氟处理的细胞 ，并在安装在盖玻片上并成像后立即将其放在4°C
。使用Deltavision实时显微镜（Applied Precision）
，雷声显微镜（Leica）或带有Deltavision成像软件，Thunder Leica Image采集软件或Apotome Zeiss Zeiss Imaging软件的APOTOME WEISS显微镜获取荧光图像。A×40/1.4NA ，×60/1.4NA或×100/1.4NA物镜用于采集
，所有图像均作为Z堆栈获取 。使用SoftWorx（比率保守，15个迭代 ，应用精度）对图像进行反价文
，并使用FIJI 2.0.0.0.0.0.0.0.0.0.0.0.0.52n进行处理
。图像以黑色和白色拍摄，并使用斐济涂色。荧光强度显示为任意单位 ，不同面板之间不可比拟 。使用斐济2.0.0-RC-69/1.52N计算共定量定量
。如所示，使用DAPI或HOECHST荧光检测到核。 　　使用CKX41显微镜（Olympus）和Cellens进入成像软件（Olympus）获取明亮场图像 。 　　Cells on coverslips were treated as indicated with cDFO (in-house, 100 µM, 15 min), cLip-1 (in-house, 1 µM, 1 h or 2 h), metcLip-1 (in-house, 10 µM, 1 h), alcLip-1 (in-house, 10 µM, 1 h) or cCW (1 µM, 1 h), then fixed and permeabilized as indicated in the section ‘Fluorescence成像’
。在固定之前
，将lysotracker深红添加到活细胞中45分钟。根据制造商的协议，使用Click-IT EDU成像套件（Invitrogen ，C10337）制备了点击反应鸡尾酒 。在典型的实验中
，我们将50μl的10×单击反应缓冲液与20μLCUSO4溶液，1μlAlexa-Fluor-氮杂 ，50μl反应缓冲液（抗坏血酸钠）和379 µL超耐水以达到500μl的最终体积。将盖玻片与点击反应鸡尾酒在室温下孵育30分钟
，然后用1×PBS洗涤3次
。然后如“荧光成像 ”部分中所述进行免疫荧光成像。 　　从夹子1处理的小鼠中收集的肾脏和肝组织样品被固定在4％多聚甲醛中的1×PBS中，在4°C下过夜 。将固定的组织在10％蔗糖中在1×PBS中孵育30分钟 ，然后在4°C的1×PBS中在20％的蔗糖中孵育4小时
，然后在干冰上嵌入OCT安装化合物（Tissuetek，Sakura）中 ，并储存在-80°C下
。使用低温恒温器Microm HM 560（Thermo Fisher Scientific）在-30°C下将冷冻组织切成5 µm厚的切片。将组织切片用1％多聚甲醛在1×PBS固定10分钟
，然后在-20°C下与100％丙酮一起孵育10分钟 。将切片在阻断溶液（1×PBS含3％BSA和0.2％Triton X-100）中孵育30分钟
。如上所述，使用点击反应标记样品。为了用溶酶体标记的成本成本 ，将单点标记的标本与抗LAMP1或抗体在1×PBS中稀释的抗体一起孵育，该抗体在4°C下含有10％正常山羊血清过夜 。第二天
，将切片与含有1％BSA和0.3％Triton X-100的1×PBS中的二抗在室温下孵育2小时
。用Hoechst 33342染色可视化细胞核，并将载玻片安装在Aqua/Polymount（Polysciences）中。使用荧光显微镜（DS-QI2 ，Nikon）或共聚焦显微镜（LSM880
，Carl Zeiss）获取图像，并为荧光团带有相应的适当过滤器集 。 　　将细胞按照指示处理 ，然后用1×PBS洗涤
。将蛋白质溶解在含有苯并酶的2x Laemmli缓冲液中（VWR
，70664-3，1：100）。将提取物在37°C下孵育1小时 ，在94°C加热10分钟
，并使用Nanodrop 2000分光光度计（Thermo Fisher Scientific）进行定量 。通过SDS-PAGE电泳（Invitrogen Sure-Lock System和NU-PAGE 4-12％BIS-Tris预制凝胶）解决蛋白质裂解物。在典型的实验中，将10–20 µg的总蛋白质提取物在含有溴酚蓝的2×Laemmli缓冲液中加载
。在每种凝胶上 ，都会运行一个尺寸标记：3 µL Pageruler（Thermo Fisher Scientific
，26616）或3 µL Pageruler Plus（Thermo Fisher Scientific，26620）和17 µL 2×Laemmli缓冲液。然后 ，使用1×Nupage转移缓冲液（Invitrogen，NP00061）
，使用Trans-blbot SD半干电池（Biio-Rad）将蛋白质转移到硝酸纤维素膜（Amersham Protran0.45μm）上，使用10％甲醇 。用5％的非脂肪脱脂奶粉（Régilait）在0.1％Tween-20和1×PBS中封闭膜
。以适当的标记尺寸切开膜 ，以使同一膜上的几种抗体进行探测。然后
，用相关的原代抗体在5％BSA，0.1％Tween-20和1×PBS中探测印迹 ，或在4°C下在0.1％Tween-20和1×PBS中的5％非脂肪脱脂奶粉中探测
，在手工密封的透明塑料袋中轻柔运动，在4°C下过夜 。将膜用0.1％Tween-20和1×PBS洗涤3次 ，并在5％非脂肪脱脂奶粉（Régilait）中与辣根 - 过氧酶偶联的二抗（Jackson Laboratories）一起孵育
，在0.1％Tween-20和1×PBS中，在室温下为0.1％tween-20和1％的Tween ，并在0.1％Tween-20和1％的Tween中均为0.1％tween和1％
。使用SuperSignal West Pico Plus（Thermo Fisher Scientific
，34580）和SuperSignal West Femto（Thermo Fisher Scientific，34096）化学发光检测套件检测到抗原。使用Fusion Solo的成像系统（Vilber）记录信号 使用FusionCapt Advance软件 。使用FIJI 2.0.0-RC-69/1.52N软件处理图像
。补充信息中提供了全面的印迹扫描。 　　PDAC053T细胞在实验中以1 ml细胞培养基中的24小时的孔内为2×105细胞的4孔板中的PDAC053T细胞 。然后用Celllight Lysosomes-GFP ，BACMAM 2.0（Thermo Fisher Scientific，C10596）
，Celllight ER-GFP，BACMAM 2.0（Thermo Fisher Scientific ，C10590）或Celllight Mitochondria-GFP
，Bacmam 2.0（Thermo Fisher Scientific，C10600）根据制造商的指令来转导细胞
。简而言之 ，将70 µL BACMAM试剂添加到培养基中并混合。将细胞孵育16小时 。 　　实验前24小时将细胞铺板。根据制造商的协议
，使用JETPRIME（Polyplus，114-15）用指定的siRNA转染细胞 ，并用100 nm siRNA转染
。简而言之
，将PDAC053T细胞以每个孔的2×105细胞的密度为6孔板，并在24小时后转染。6小时后更换培养基 。转染后72小时进行分析
。合适的siRNA是由佛法设计设计的 ，用于特异性下调靶基因。补充信息中提供了siRNA序列 。 　　用冰冷的1×PBS洗涤细胞
。对于抗体染色
，将细胞与FC块（人信任FCX，Biolegend ，422302，1：20）孵育15分钟
，然后在冰冷的10％FBS中与抗体在4°C下2 mm EDTA在4°C中孵育2 mm EDTA，然后用1×PBS和1×PBS PRETERSENETION在1×PBS中洗涤 ，并在10％PBS中洗涤。BD LSR Fortessa X-20流式细胞仪
，带有FACS Diva软件（v.9.0.1） 。 　　将PDAC053T和HT-1080细胞以每个孔的2×105细胞密度为6孔板
。第二天，将LIP-1（10 µM） ，羟基氯喹（Sigma-Aldrich
，H0915，100 µM）或Bafilymycin A1（Sigma-Aldrich ，B1793
，75 nm）添加到PDAC053T细胞中1 H和至HT-10分钟30分钟。对于PDAC053T细胞，加入30分钟后 ，将RPE27（内部
，40 µM）或HMRHONOX-M28（内部，1μm）探针加入30分钟 。对于HT-1080细胞 ，加入RPE27（内部，40 µM）或HMRHONOX-M28（内部
，1μm）探针后15分钟后，添加了15分钟
。与铁探针孵育后 ，去除去培养基
，并在胰蛋白酶吸引前用1×PBS洗涤细胞一次。收集细胞，颗粒 ，用1×PBS洗涤
，最后添加含有10％FBS的1×PBS缓冲液，并加入EDTA（0.1％V/V） 。数据记录在BD LSR Fortessa X-20上。 　　将PDAC053T细胞播种在每孔1×105细胞的密度的6孔板中
。第二天 ，将细胞用LIP-1（1 µM）
，Clip-1（内部，1 µm） ，MetClip-1（内部
，10 µM），ALCLIP-1（内部 ，10 µm）和Bodipy-C11 581/591（200 µM）（200 Nm）处理。1小时后，除去培养基
，并在胰蛋白酶加工前用1×PBS洗涤细胞两次 。收集细胞，沉淀 ，用1×PBS洗涤
，最后250 µL含有10％FBS的1×PBS缓冲液，并添加EDTA（0.1％V/V）以进行流式细胞仪
。将PDAC053T ，HT-1080和4T1细胞以每个孔的2×105细胞密度为6孔板。第二天
，在添加RSL3之前，将细胞用Bafilycin A1（75 nm）和羟基氯喹（10 µM）处理2小时（PDAC053T和HT-1080 ，HT-1080
，500 nm的200 nm，为4T1） 。1小时后 ，将细胞用Bodipy-C11 581/591（4 µM）处理1小时
。去除培养基
，并用1×PBS洗涤细胞两次，然后两次胰蛋白酶吸引。将细胞收集 ，沉淀，用1×PBS洗涤
，最后250 µL含有10％FBS和EDTA（0.1％V/V）的1×PBS缓冲液以流式细胞仪的形式添加 。使用Attune NXT（v.4.2.0），将数据记录在Attunetm NXT流式细胞仪（Thermo Fisher Scientific）上
。 　　将细胞与SQSS（内部 ，100 nm
，1 h）或1-RED（内部，100 nm ，24 h）孵育。将HT-1080细胞与RSL3（1 µM）
，ML210（10 µM，Sigma-Aldrich ，SML0521）
，FIN56（5 µM，Sigma-Aldrich ，SML1740）
，Buthionine Sulfoximine（10 µm，10 µm ，Sigma-Arast，sigma-aldrich
，b2515）孵育Sigma-Aldrich，329600）对于指定的时间点 。数据记录在Attunetm NXT流式细胞仪（Thermo Fisher Scientific）上
。 　　通常 ，将2×105分解的人体组织细胞与HMRHONOX-M28（内部
，1μm，1 h）一起在培养基中（RPMI 1610 ，10％FBS和青霉素 - 链霉素）孵育。用以下抗体和染色面板分析人类肿瘤样品和健康邻近组织的溶酶体铁含量：DAPI（0.1 µg ML – 1）
，CD3-BV510（Biolegend，317332） ，CD31-PE-CY7（Biolegend
，303118），CD43118） ，CD444-AQUINGIC64-FAF647（NOVUS）
，NB500-481AF647），CD45-BV785（Biolegend ，304048），CD163-PERCP/CYANINE5.5（BIOLEGEND
，326512），FAP-AF-700（R＆D Systems ，Fab3715N）和TFR1-PAPC-APC-F750（Bef3715N）（Be＆D Systems）活肿瘤癌细胞对应于DAPI – CD45 – CD31 – FAP-细胞 。数据记录在BD LSRFORTESSA X-20或ATTUNETM NXT流式细胞仪（Thermo Fisher Scientific）上。 　　通常
，将2×105分解的肿瘤细胞与Fento-1（内部，1 µM ，24 h）一起在培养基（RPMI 1610
，10％FBS和青霉素 - 链霉素）中孵育
。用LIP-1（1 µM），Clip-1（内部 ，1 µM）
，α-生育酚（100 µM）或脱佛酮（100 µM）预处理细胞2小时。α-生育酚在惰性气氛下保持纯净，并在每个实验之前在整个研究中制备新鲜的储备溶液 。以下抗体和染色面板用于随后的流式细胞仪分析：Sytox Blue（Thermo Fisher Scientific ，S34857
，1 µM），CD31-BV605（Biolegend ，303122），CD45-BV510（Biolegend
，Biolegend，368526 ，Lot B373428）
，CD45-BV510（NB500-481AF647），TFR1-PE（Biolegend ，334106）和FAP-AF-750（Novus Biologicals
，Fab3715S-100UG）
。活肿瘤细胞对应于Sytox Blue -CD45 – CD31 – FAP-细胞。数据记录在Attunetm NXT流式细胞仪（Thermo Fisher Scientific）上 。对于小鼠4T1肿瘤中CD44水平的流式细胞术分析，通常使用2×105分解的肿瘤细胞
。使用以下抗体和染色面板对新鲜分离的细胞进行染色：Sytox Blue（Thermo Fisher Scientific ，S34857
，1 µM），CD31-BV605（Biolegend ，102427）
，CD44-AF647，CD44-AF647（Biolegend ，103018），CD45-BV510（Biolegend
，103018）（CD45-BV510，1031388888888）MHCII-APC/Cyanine7（Biolegend ，107628）。活肿瘤癌细胞对应于Sytox Blue -CD45 – CD31 -MCHII+细胞 。数据记录在Attunetm NXT流式细胞仪（Thermo Fisher Scientific）上
。使用FlowJo（V.10.10.0）分析所有数据。 　　使用以下抗体进行人类细胞的分选：CD31-PE-CY7（Biolegend
，303118），CD44-AF647（Novus Biologicals ，NB500-481AF647）和CD45-BV785（Biolegend
，304048） 。排序的细胞对应于CD45 – CD31 – CD44+细胞和CD45 – CD31 – CD44 –细胞，这些细胞使用FACS Diva（v.9.0.1）在FACSARIA融合（BD）上分离出来
。如“ ICP-MS
”部分所述 ，使用CD44高和CD44LOW肿瘤细胞进行ICP-MS实验。使用以下抗体进行小鼠细胞的分选：CD44-AF647（Biolegend
，103018）和MHCII-APC/Cyanine7（Biolegend，107628） 。分类的细胞对应于MHCII+CD44高细胞和MHCII+CD44LOW细胞。在300G处离心分选的细胞 ，并处理细胞颗粒以进行后续应用
。 　　用硝酸65％（VWR
，Suprapur，1.00441.0250）清洁配备有Teflon Septa的玻璃小瓶 ，并用超纯水（Sigma-Aldrich，1012620500）洗涤并干燥。收集细胞并用1×PBS洗涤两次 。然后使用自动细胞计数器（ENTEK）对细胞进行计数
，并在200 µL 1×PBS或超纯水中转移到清洁的玻璃小瓶中
。将相同体积的1×PBS或超纯水转移到单独的小瓶中以进行背景减法，至少每次实验重复。对于纸巾样品 ，将一小部分约1 mm3转移到干净的预级小瓶中 。使用冷冻干燥机（基督
，2-4 ldplus）冻干样品
。随后称重带有组织样品的小瓶以确定组织干重。然后将样品与硝酸65％混合，并在80°C的同一玻璃小瓶中加热过夜 ，封闭带有teflon隔膜的盖子 。然后将样品冷却至室温
，并用超纯水稀释至最终浓度为0.475 N硝酸，并转移到无金属离心机小瓶（VWR ，89049-172）中进行随后的MS分析
。考虑到天然同位素分布
，使用高分辨率模式下的Agilent 7900 ICP-QM测量金属量。通过Scott喷雾室通过微型欺诈器（Micromist，0.2 mL min – 1）实现样品引入 。使用与氦气（5 mL min – 1）的碰撞 - 反应界面测量同位素以去除多原子干扰
。在与样品混合后 ，注入了丑闻和内部标准标准
，以控制信号漂移和基质效应的缺失。以涉及样品的浓度来测量认证标准，以将计数测量值转换为溶液中的浓度 。对细胞数或组织干重的值归一化。 　　使用传统的脂质膜水合方法制备脂质体结构
。简而言之 ，将100μl的储备溶液（1 mg mL – 1氯仿）为18：1（Δ9-CIS）PC（DOPC，Avanti Polar Lipids）溶解在400μl氯仿中
，并转移到圆瓶中。在200 r.p.m.中，在旋转蒸发剂中减压15分钟以减小压力下除去有机溶剂 。在37°C的水浴中
。之后 ，将脂质膜用真空泵干燥过夜。将样品用1 mL的0.1 mM乙酸钠缓冲液（pH 4.5）水合
，并每5分钟涡流20分钟 。通过将悬浮液通过2次聚碳酸酯膜（孔径为0.2 mm）的悬浮液挤出20次，从而挤出了脂质体
。对于对照实验 ，将200μl的脂质体溶液加入Eppendorf管中
，并在37°C下以800 r.p.m的搅拌加热。然后，加入了5μl铁（II）三裂水溶液（1.4 mg In 1.5 mL）和13μl乙酸盐缓冲液（pH 4.5） 。在T = 0分钟时 ，加入H2O2的水溶液（10μLH2O2（30％）1 ml）
。对于Fento-1实验
，将200μl的脂质体溶液添加到Eppendorf管中，并在800 r.p.m. 37°C下加热。然后 ，加入了13μl的1 mM芬托-1溶液在DMSO中
，并加入5μl铁（II）三裂水溶液（1.4 mg in 1.5 mL） 。在t = 0分钟时，加入了13μlH2O2的水溶液（10μLH2O2（30％）1 ml）
。用配备有Triversa纳米酸盐离子源（Advion Biosciences）的QECACTIVE质谱仪（Thermo Fisher Scientific）记录了DOPC氧化。在0.5 h ，1 h，2 h
，3 h，4 h ，7 h
，7 h和24 h反应时间注射样品 。 　　HT-1080细胞用Fento-1（10 µM）处理1小时，并根据制造商的方案 ，使用溶酶体分离试剂盒（ABCAM
，AB234047）分离溶酶体富集的馏分。简而言之，将2×107的细胞洗涤并在600g下离心10分钟 ，然后去除上清液
。将细胞重悬于溶酶体分离缓冲液中
，涡旋并在冰上孵育2分钟。使用Dounce均质器获得了完全的细胞破坏 。添加溶酶体富集缓冲液后，将匀浆在4°C下以500克离心10分钟
。将上清液添加到不连续的梯度密度的顶部 ，并在4°C下在145,000g下以145,000g的超速离心进行2 h。富含溶酶体的分数存在于梯度体积的前10％中 。对于基于MS的脂质组学
，将溶酶体级分与2卷为1×PBS，在4°C下以18,000克离心30分钟
。接下来 ，将200 µL的150 mM碳酸氢钠添加到颗粒中，并在液氮中闪烁样品。对这些闪烁的样品进行了脂质组分析 。对于蛋白质印迹分析
，使用QBIT 1荧光计（Thermo Fisher Scientific）和蛋白质定量试剂盒（Thermo Fisher Scientific，Q33212）对溶酶体增强梯度上清液的蛋白质含量进行定量
。将相等的总细胞提取物和富含溶酶体富集提取物的总蛋白质量加载 ，以进行比较的蛋白质印迹分析。 　　为了比较铁凋亡诱导剂
，将HT-1080细胞用Fento-1（内部，1 µm） ，Erastin（10 µM）
，RSL3（100 nm）或IFSP1（10 µM，Sigma-Aldrich ，SML2749）处理24小时 。为了与铁毒性抑制剂进行合作
，将HT-1080细胞用α-生育酚（100 µM），去feriprone（100 µM）或LIP-1（10 µM）预处理2 h ，然后用Fento-1（1 µm）进行24小时
。用100 µMα-生育酚
，然后用1 µM Fento-1预处理分解的人类肿瘤样品24小时。PDAC053T细胞用1 µM Fento-1处理6小时或24小时 。分解后分解的小鼠肿瘤样品在解离后直接处理并处理α-生育酚（100 µM）2小时，然后用Fento-1（1 µM ，24 h）预处理。随后用1×PBS洗涤细胞，然后用150 mM碳酸氢铵洗涤
。然后将细胞重悬于150 mM碳酸氢铵中
，并以300克离心5分钟。除去上清液，并将细胞重悬于1 ml的150 mM碳酸氢铵中 。解决方案以12,000 r.p.m.持续10分钟 ，去除上清液
。接下来
，将200 µL碳酸氢钠含有200 µL添加到颗粒中，并在液氮中闪烁样品。同一天 ，针对给定数据集的所有技术和生物学重复进行了脂质组分析 。对于脂质分析
，将200 µl细胞裂解物用1.64μl内标准脂质混合物升高，其中含有300 pmol磷脂酰胆碱（PC）17：0-17：0 ，50 PMOL磷脂酰乙醇胺（PP）磷脂酰丝氨酸（PS）17：0-17：0
，30 pmol磷脂酸（PA）17：0-17：0，30 pmol磷脂酰甘油（PG） ，30 PMOL溶血磷脂酰胆碱（LPC）12：0
，30 pmol溶剂磷酸磷脂磷脂磷脂（Lpc）（LPS）17：1和30 PMOL溶血磷脂酸（LPA）17：0，在4°C下进行脂质提取 ，如前所述57
。简而言 用1 mL氯仿和甲醇（10：1）在4°C下以剧烈摇动（1,000 R.P.M.）提取样品。收集较低的有机相并在Speedvac真空浓缩器中干燥 。在相同温度和摇动条件下，用1 mL氯仿和甲醇（2：1）重新提取其余水相
。收集较低的有机相并在Speedvac真空浓缩器中蒸发。将脂质提取物溶于100μL输注混合物中
，这些输注混合物由溶解在丙醇，氯仿和甲醇中的7.5 mM乙酸铵组成（4：1：2（V/V/V）） 。对于体外脂质体实验 ，将每种反应混合物的1 µL添加到100μl输液混合物中
，由溶解在丙醇，氯仿和甲醇（4：1：1：2（v/v））中的7.5 mm乙酸铵组成 ，其中包含300 pmol PC 17：0-17：0-17：0
。通过在配备有Triversa纳米酸盐离子源（Advion Biosciences）中直接输注（Thermo Fisher Scientific）中直接输注样品。简而言之
，将5 µL样品注入气体压力和电压分别为1.25 psi和0.95 kV 。在10：1提取物中，通过阳性成分FTM在10：1提取物中检测到PC和氧化的PC（PCOX） ，作为质子化加合物
，通过扫描m/z = 580-1,000 da，rm/z = 200 = 200 = 280,000在共同背景（m/z = 680.48022）中激活的锁定量为30 s ，为30 s。每次扫描都是2个显微镜的平均值
，AGC设置为106，最大离子注入时间（IT）设置为50 ms
。PE检测到氧化的PE（PEOX）和LPE作为去质子加合物和LPC在10：1中被视为乙酸加合物在10：1提取物中通过负值mode ftms提取 ，通过扫描M/z = 420–1,050 da，在rm/z = 200 = 200 = 280,000的lock = 280,000
，在常见的背景上激活了锁定质量（m/z = 522262.462262）。每次扫描都是2个显微镜的平均值，将AGC设置为106 ，最大离子设置为50 ms 。PI
，氧化的PI（PIOX），PS ，氧化PS（PSOX）
，溶血磷脂酰肌醇 （LPI）和溶血磷脂酰丝氨酸（LPS）在2：1提取物中通过负离子模式FTMS作为去质子化离子（通过扫描m/z = 400-1,100 dA），在rm/z = 200 = 200 = 200 = 280,000的锁定背景（m/z = 529.46262）
。每次扫描都是2个显微镜的平均值 ，将AGC设置为106
，最大离子设置为50 ms。氧化磷脂的注释仅详细介绍了给定质量中存在的其他氧原子和双键的数量，它可以可能指的是具有相同单异位素质量的几种不同的结构 。所有数据均以质心模式获取
。使用脂质识别软件LipidXplorer（V.1.2.8; http://genomebiology.com/2011/11/12/1/r8）分析所有脂科学数据。MS的公差和识别设置为2 ppm 。根据内部标准标准将数据归一化 ，并对各自脂质物种的总输入进行了归一化
。使用相关距离和病房链接聚类脂肪组数据
，并表示为归一化值的热图。 　　HT-1080细胞用Fento-1（内部，1或2 µM ，24小时）处理 。根据制造商的协议，使用甘油-GLO分析（Promega
，J3150）对甘油进行定量
。简而言之，该测定在96孔板中进行 ，并在实验前24小时将4,000个细胞铺板。为每个生物学实验制备了标准曲线
，并为每种情况和每个生物学重复进行三个技术复制 。使用Spectramax ID3读取器（分子设备）记录发光信号。使用Excel（Microsoft）和Prism软件对数据进行导出和分析
。 　　使用Fiji 2.0.0-RC-69/1.52N，Prism 10.0.3和Adobe Illustrator 26.0.2创建了插图。图2中的插图 。使用Biorender（https://biorender.com）创建2B和4
。 　　结果表示为平均值±S.E.M.或S.D.如所示。对于盒子图 ，盒子表示四分位间范围和中位数
，晶须表示最小和最大值 。使用双面Mann – Whitney测试，双面未配对的T检验 ，Kruskal-Wallis测试
，使用Dunn的后测试，单向ANOVA ，双向ANOVA
，双向ANOVA或MANTEL-COX LOG-RANK测试来计算P值
。除非另有说明，否则使用PRISM（V.10.0.3）软件来生成定量的图形表示。样本量（n）在图传奇中指示 ，未预定 。至少进行n = 3个独立的实验作为标准，并在更复杂的实验中增加了样本量
，以确保可重复性
。精确的p值在图中指示。 　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得 。