除非另有说明，否则在37°C的脑心脏输注（BHI）肉汤中常规培养铜绿假单胞菌细胞（250 R.P.M.）。假单胞菌分离琼脂（PIA）用于针对其他微生物选择铜绿假单胞菌 。大肠杆菌细胞在溶酶体肉汤中培养
。为了准备板 ，使用1.5％（w/v）琼脂。必要时将抗生素添加到培养基中：铜绿假单胞菌60 µg ml -1庆大霉素
，75 µg ml -1 TET或300 µg ml -1 carbenicillin；10 µg ml -1庆大霉素，10 µg ml -1 TET或100 µg ml -1甲求甲霉素用于大肠杆菌 。对于铜绿假单胞菌静态或厌氧培养 ，将50 mM KNO3添加到BHI肉汤中
。厌氧条件保持在乙烯基厌氧室（COY LAB产品）中
，具有以下气氛：85％N2、10％CO2和5％H2。 　　补充表3列出了本研究中使用的菌株，质粒和引物 。为创建转录lacz融合（PPC100-102） ，使用PA14基因组DNA作为模板和25个底座（bp）（Q5
，新英格兰biolabs）进行了PCR（Q5，新英格兰Biolabs） ，并将其带入模板中，该区域是25个底座（BP）（约25个底座）（BP）（约25个底座（Mini-CTX-LACZ载体（用ECORI和KPNI线性化）在Gibson Assembly Master Mix（新英格兰Biolabs）中
。为了创建SICX互补质粒（PPC103-106）
，将SICX启动子和SICX等位基因（包含如补充表3所述的突变）连接到Mini-CTX1矢量（用ECORI和KPNI线性化），通过Gibson组装。所有SICX点突变（PPC107-124）均使用Q5位置定向的诱变试剂盒（新英格兰Biolabs）构建 ，使用Mini-CTX1-SICXTRUNCATE（PPC106）作为模板 。为了创建翻译LACZ融合（PPC125-126）
，将UBIU的启动子区域放大，然后在Ecori和Bamhi站点之间连接到PSW205。使用PSW205-PUBI-LACZ（PPC125）作为模板 ，所有使用Q5位置定向的诱变试剂盒（新英格兰Biolabs）构建了所有Ubiuvt 5'UTR点突变（PPC127–145）
。用于构建用于无标记基因缺失（PPC146–147
，149–150）和诱变（PPC148）的质粒，上游和下游区域（约1,000 bp）（约1,000 bp）侧翼的靶基因或区域侧翼 ，将PCR放大（如果需要）
，则在pex和lig的区域中包含sig and lig 2（如果需要），则在pex上进行了lig line（如果需要）。吉布森议会 。通过PCR ，限制酶消化以及必要时进行DNA测序验证所有质粒
。 　　然后将经过验证的质粒转化为大肠杆菌SM10λPIR
，然后将其结合到铜绿假单胞菌PA14，PAO1 ，B1及其衍生物中。PSW205衍生的质粒直接电穿孔到铜绿假单胞菌中 。如补充表3所示，适当的抗生素用于选择
。为创建无标记的框架缺失或诱变
，在靶基因座集成的缺失盒子的结合体在低 - 盐溶解液肉汤中对靶基因座进行了反序列，并补充了5％的氯基。使用侧翼引物通过PCR筛选成功的缺失 ，并在需要时通过DNA测序验证 。 　　在Pseudomonas.com和国家生物技术信息信息网站上进行了BLASTN搜索
，以识别Pseudomonas属和其他生物体的SICX和Ubiuvt的直系同源
。SICX序列（图1C和扩展数据图1），具有其相邻基因的SICX（图1D）和ubiuvt及其上游基因间区域（用于扩展数据图4） ，从铜绿假单胞菌PA14菌株中使用。从具有E值的完整细菌基因组鉴定出的直系同源物 <1 × 10−4, percentage identity >保留了90％和查询覆盖率> 90％以进行进一步分析 。使用Muscle43对齐SICX和UBIUVT直系同源物的序列
。为了分析SICX和UBIUVT直系同源物的序列保守
，我们首先使用肌肉对齐SICX和Ubiuvt直源。接下来，修剪对齐末端并清除了间隙 ，并在R中的每个核苷酸位置计算了与SICX和Ubiuvt查询相同的直系同源序列的百分比 。为创建扩展数据图。图4B
，C，使用默认的核位透明介质配色在Jalview44中可视化对齐
。 　　铜绿假单胞菌细胞在补充了50 mm knO3的BHI肉汤中生长过夜。在新鲜的BHI肉汤中 ，将过夜培养物稀释至600 nm（OD600nm）的光密度（OD600nm）约为0.05（具有50 mm knO3）
，然后生长至对数阶段（OD600Nm左右0.5） 。将对数相细胞稀释至OD600nm 0.2，并转移到厌氧腔中 ，以在37°C下（在100 r.p.mm.下）进行3小时摇动
。使用100μl厌氧培养物进行β-半乳糖苷酶测定（如参考文献45中所述）。有氧对数培养物用作比较 。为了进行静态培养，将对数相培养物稀释至OD600NM 0.05
，并在37°C的96孔板中孵育3 H型（每个1-mL深度井）3小时
。然后将静态培养物用于β-半乳糖苷酶测定。 　　为了制定图3A，B ，发现了带有Ubiuvt-Lacz翻译融合的菌株（3μLOD600NM0.1培养物）上的0.2-μm核孔轨道痕迹的聚碳酸酯膜（Whatman）
，将Bhi Agar Plates含有Bhi Agar Plates含有50 µML-GL MON，它们置于Bhi Agar plate（粗糙的一侧） ，100 µg mL -1碳苯霉素 。然后将板在成像之前在37°C下在37°C下在37°C下孵育20小时
。如先前所述估计β-半乳糖苷酶活性46。简而言之
，将菌落生物膜的图像转换为ImageJ中的8位 。进行阈值以定义菌落对象进行测量
。测量每个菌落的平均像素强度，并用WT PA14菌落的平均像素强度减去。 　　铜绿假单胞菌细胞有氧和厌氧生长 ，以进行总RNA提取 。为了制备有氧培养物
，将对数相细胞在BHI中稀释至OD600NM 0.01（使用50 mM KNO3），并在37°C下孵化3小时。为了制备厌氧培养物 ，将对数相细胞在BHI中稀释至OD600nm 0.1（用50 mM KNO3）
，并在37°C摇动，在厌氧腔中孵育4小时
。对于总RNA提取 ，铜绿假单胞菌培养物首先在4°C的Rnalater中存储过夜。接下来，将细胞沉淀并重悬于含1 mg ML-1溶菌酶的无RNase TE缓冲液中 。将样品在37°C下孵育30分钟
，以酶裂解细胞
。然后加入1 ml体积的RNA-BEE，并通过珠子跳动30 s的珠子进一步机械裂解细胞。将200μl的氯仿添加到样品中 ，并在4°C下以13,000g离心30分钟将水相和有机相分离 。将含有RNA的水相与0.5 mL异丙醇和20μg线性丙烯酰胺混合
。在-80°C下过夜孵育后
，将RNA固定并用75％乙醇洗涤。将气干颗粒重悬于100μL无RNase水中 。用纳米体分光光度计（Thermo Fisher Scientific）确定每个样品的RNA浓度
。将约1μg的总RNA在15％聚丙烯酰胺凝胶电泳-Rea凝胶上分离，并转移到Hybond-N+膜（GE Healthcare）中。然后将膜与紫外线交联（UVP）交联 ，并与指示的DNA寡核苷酸（在补充表3中列出）在杂交溶液（TAKARA）中进行探测
，这些DNA寡核苷酸（在补充表3中列出）由T4 Polynuceletase（Perkin Elmer）（perkin Elmer）radioLAbell radiolage（补充表3） 。将探测的膜暴露于磷光筛网上，并使用台风生物分子成像仪（GE Healthcare）进行可视化
。必要时 ， 通过将膜与沸腾的0.1％SDS孵育3次
，将膜与煮沸的0.1％SDS孵育15分钟。用Riboruler低范围RNA梯（Thermo Fisher Scientific）以及二甲醇（约28 nt）和溴苯酚蓝（约8 nt）迁移，估计了RNA的尺寸 。 　　将BHI中的细菌培养物（具有50 mM KNO3）生长至对数相（OD600Nm左右0.5左右） ，然后用新鲜培养基稀释至OD600Nm 0.02。接下来
，将10μl稀释的培养物发现在0.2μm的核孔痕迹蚀刻的聚碳酸酯膜（Whatman）上，这些膜（Whatman）放置在BHI琼脂板上（带有50 mm KNO3）上的（光滑的一侧向上）
。然后将板在37°C的厌氧腔中孵育16小时。将含有铜绿假单胞菌生物膜的膜转移到含有1 ml磷酸盐缓冲盐水（PBS）的珠虫预灌注的管中 。生物膜通过珠子跳动45 s机械地破坏
。通过在PIA板上扩散稀释的细胞悬浮液来确定CFU。 　　如上所述 ，在静态和厌氧生长条件下收集了铜绿假单胞菌PA14和ΔSICX细胞（在标题为β-半乳糖苷酶测定的部分） 。 　　对于静态生长条件，收集了每个菌株的三个生物学重复
。将细胞颗粒重悬于裂解缓冲液（100 mM Tris-HCl
，50 mM NaCl，10％（v/v）甘油 ，1 mM Tris（2-羧乙基）磷酸）（TCEP）
，pH 7.5）中，并具有完整的Mini蛋白酶抑制剂鸡尾酒（ROCHE）。在冰上进行三轮超声处理（3×10 s）之后 ，通过沉积（21,130克
，15分钟，4°C）阐明上清液 。用TCEP降低每个样品的等分试样（100μg） ，用碘乙酰胺烷基化
，并用串联质量标签（TMTS）标记
。根据制造商（Thermo Fisher）规定的协议进行TMT标记。 　　使用Dionex Ultimate 3000快速分离LC（RSLC）Nano-ultrtrtratrantrance LC系统（Thermo Fisher Scientific）和Lumos Orbitrap质谱仪（Thermo Fisher Scientific）（Thermo Fisher Scientific），使用Dionex Ultimate 3000快速分离LC（RSLC）Nano-ultrtraps LC System（Thermo Fisher Scientific）进行了液相色谱 - 倾向质谱法（LC – MS/MS）实验 。使用Thermo Scientific Sc​​ientific Reversed相相纳米易于涂料柱（Thermo Scientific Pepmap C18; 2mm粒度 ，100-Å孔径
，100-Å孔径，75毫米i.d.d 50 cm） ，使用C18反相色谱分离以300 nl min-1进行流速进行分离
。溶剂A为水/0.1％甲酸，溶剂B为80％（v/v）乙腈/20％水/0.1％甲酸。使用的线性梯度在93分钟内为2％至40％的溶剂B（总LC运行时间为120分钟
，包括高有机洗的步骤和柱重新启动） 。 　　通过易于喷雾的来源（Thermo Fisher Scientific）将洗脱的肽喷涂到质谱仪中。在Orbitrap质量分析仪（以120,000的分辨率设置）中测量代表洗脱肽离子的所有M/Z值，并以M/z 380和1,500 DA进行扫描
。通过碰撞引起的解离（归一化碰撞能量值为35％） ，使用数据依赖性的MS/MS扫描（最高速度）自动隔离和碎片前体离子。单个带电的离子和无分配电荷状态的离子被排除在MS/MS的选择中
，并使用了70 s的动态排除窗口 。然后，使用高能量碰撞分离（标准化的碰撞能量值为65％） ，选择了每个MS/MS事件的前10个最丰富的片段离子
，以通过同步前体的选择和MS/MS/MS47的同步前体选择和MS/MS/MS47选择进一步的片段化
。在Orbitrap分析仪中测量了每个记者离子和所有片段（质量范围，100至500 dA）的M/z值和相对丰度（质量范围 ，100至500 da）
，该分析仪以60,000的分辨率设置为60,000。这是在10个MS3事件的周期中进行的，此后 ，Lumos仪器恢复为扫描完整肽离子的M/Z比
，并且循环继续进行 。 　　Proteome Discoverer v2.1（Thermo Fisher Scientific）和吉祥物（Matrix Science）v2.6用于处理原始数据文件
。数据与铜绿假单胞菌UCBPP-PA14的序列（具有不定蛋白的共同存储库（CRAP）V1.0）。R软件包MSNBase v2.13（参考文献48）用于处理蛋白质组学数据 。使用Limma软件包v3.44.3（参考文献49）评估蛋白质差异丰度
。蛋白质丰度的差异是使用学生的t检验统计确定的，其差异通过使用Limma的经验贝叶斯方法来缓和。通过Benjamini – Hochberg方法50调整P值以进行多次测试 。仅当蛋白的log2 [倍数变化]值分别大于1或小于-1时 ，并且当蛋白的p值<0.01时，才认为蛋白质的丰度增加或减少
。 　　对于厌氧生长条件
，如上所述（在标题为β-半乳糖苷酶测定的部分）收集了PA14的两种生物学重复和ΔSICX的三个生物学重复。简而言之，根据滤清器的样品制备方案51 ，将每个样品中的蛋白质降低
，烷基化并用胰蛋白酶消化 。如前所述52，用TMT标记肽 ，由高ph反相色谱分离。如前所述53
，它们被汇总为12个分数
。通过纳米-LC-MS/MS分析每个馏分，并鉴定为先前描述的54 ，并进行以下修改。使用内部包装柱（40厘米长×75μm内径×内径×360μm外径
，Maisch GmbH reprosil-Pur 120 C18-AQ 1.9-µm珠）和120分钟的梯度进行相反的相色谱 。使用吉祥物算法（v2.5.1）搜索了原始文件，该蛋白数据库通过结合铜绿假单胞菌UCBPP-PA14的序列和污染物数据库（Crap ，2016年11月21日下载
，从http：/http://wwwwwww.popm.org）通过Protee v2.1
。如上所述，仅将期望值小于0.01（“高置信 ”）的肽光谱匹配用于我们的分析。 　　为了准备脂质提取的细胞 ，我们首先将对数相培养物（OD600NM 0.5;有氧）稀释到厌氧的Bhi汤中（补充了50 mm KNO3），以计算出的OD600nm 0.05
，并在6 h厌氧孵育中与shaking一起摄取，并在6小时的厌氧菌孵化后 ，将液体用于priquent priquent priquent priquent priquent priquent priquent priper in Priper in pr flogen 。用OD600Nm估计细胞数
。 　　冷冻样品在冰上解冻。将100 µL冰冷的异丙醇含有10 nm辅酶Q10-D9（胚层UQ10作为内标的； Sigma-Aldrich）
，将其添加到109个细胞中 。随着添加玻璃珠，将样品短暂地涡旋并用薄纸均匀地匀浆5分钟两次 ，然后以21,100g离心5分钟
。离心后
，将上清液稀释十倍并转移至4°C。使用ACCUCORE C30色谱柱（2.1×150 mm，2.6 µm粒径； Thermo Fisher）的Ultimate 3000拟合进行超出性LC-MS ，并耦合到Orbitrap ID-X质谱系统 。 　　用于样品分析的色谱法涉及用乙腈/水（60:40
，v/v）洗脱，其甲酸铵甲酸铵和0.1％甲酸（流动相位）和异丙醇/乙腈（90:10 ，v/v）（90:10
，v/v）使用10毫米甲酸铵和0.1％Formic Adir -folg Ater -nim proff in -1 frow n -1 frow n -1 frow n -1 chast -in -1 frow n -1 cland -1 -1 -1均为1％
。1分钟60％b;5分钟70％b;5.5分钟85％b;8分钟90％b;8.2分钟100％B保持至10.5分钟，然后10.7分钟20％B保持到12分钟。柱温度设置为50°C ，注射体积为5 µL 。 　　靶向分子UQ9和氘化的UQ10在20碰撞能量下以高能碰撞解离，在正模式下。UQ9和申请UQ10的MS/MS转换为812.66/197.08和889.77/206.18
。生成了UQ9和氘化UQ10的标准曲线。根据标准曲线计算了样品中的UQ9和氘化UQ10的量 。 　　为了产生生长曲线
，首先将BHI中的细菌细胞（具有50 mM KNO3）的细菌细胞在对数期生长（OD600NM左右0.5左右），然后用有氧或厌氧BHI（有50 mm KNO3）的家伙将其稀释至OD600NM 0.01
。通过测量OD600Nm ，监测37°C（摇动）铜绿假单胞菌的有氧和厌氧生长。 　　对于长期竞争实验
，将PA14，ΔSICX ，TERT（由Mini-CTX1提供的电阻）PA14和TERTΔSICX在BHI中生长至对数相（OD600nm左右）（OD600Nm左右）（50 mm KNO3）
，然后稀释至OD600nm 0.4，并用新鲜的培养基稀释至OD600Nm 0.4 。将Pa14和TetrΔSICX以1：1的比例混合 ，将100μl的细胞混合物转移到4 mL厌氧BHI（含50 mM KNO3）
，然后在厌氧条件下在37°C下摇动孵育
。24小时后，将20μl的培养物转移到另一个含有4 ml厌氧BHI（50 mM KNO3）的管中。然后 ，每天以类似的方式连续传播该文化 。TetR PA14和ΔSICX之间的竞争与上述相似
。通过在PIA上（每天）以及含有75 µg ML -1 TET的PIA培养培养物（每天）
，估计TET和TET细胞的CFU值。 　　使用具有默认参数的MFOLD26预测RNA二级结构 。Intarna 2.0用于预测具有默认设置的SICX SRNA和UBIUVT mRNA25之间的碱基配对相互作用，并且种子区域中的最小碱基对数为7
。 　　用瑞士韦伯斯特雌性小鼠（8-10周龄）进行小鼠慢性伤口感染 ，实际上如前所述55进行了一些修改。简而言之，进行背面全厚性皮肤切除
，其中通过手术施用一个小的圆形伤口（直径为1.5厘米） 。切除后，伤口立即被半透明的聚氨酯敷料覆盖。总共将104个铜绿假单胞菌细胞注入敷料下方的伤口床 ，以建立感染
。由于需要绷带来减少收缩愈合并最大程度地减少其他细菌的伤口污染
，因此在整个感染过程中，它们在必要时进行了密切监测和更换。 　　为了评估WT和δSICX感染的细菌负担 ，在感染后10天或在早期时间收集了伤口组织和脾脏
，如果发现该动物被发现垂死（未鉴定出未鉴定出的垂死小鼠）被排除在CFU分析中） 。使用Mini-Beadbeater-16（BioSPEC产品），将组织在PBS中在PBS中匀浆45 s
。为了列举CFU ，将均质样品连续稀释并在PIA板上铺板。为了研究WT
，ΔSICX，Δubiuvt和ΔSICX-纤维感染的传播结果（图3E） ，在感染后10天
，收集了包括脾脏，肝脏和Gallbladder的远端器官 ，以评估铜绿假单胞菌细胞的存在或不存在 。为了研究铜绿假单胞菌感染的宏观组织，在感染后4天切除伤口
，并使用直径为10 mm的活检（ACU-PUNCH，THERMO FISHER SCIENTIFIFIFIFIFIFIFICE）将边缘（约0.98 cm2）和核心（约0.77 cm2）区分开
。然后通过表面积将CFU归一化 ，以进行比较。 　　如先前所述31
，对体内生物膜分散（8-10周龄）进行了一些修改 。简而言之，如上所述 ，给予小鼠手术切除伤口
。总共将104个铜绿假单胞菌细胞（PAO1）注射到敷料下方的伤口床上
，以建立感染。感染后48小时（在伤口成熟生物膜形成后），通过局部应用GHS或CIS-DA诱导系统性传播来治疗已建立的伤口感染 。具体而言 ，GHS由细菌α-淀粉酶（来自枯草芽孢杆菌； MP生物医学）和真菌纤维素酶（来自尼日尔曲霉； MP生物医学）组成
。通过将粉末状酶溶解在PBS中
，制备了10％（w/v）α-淀粉酶和纤维素酶（在1：1组合）溶液中。CIS-DA（Cayman Chemical Company）在PBS中稀释至最终浓度为500 nm 。GH和CIS-DA溶液立即在使用前准备。在三个单独的局部输注中，用GH或CIS-DA溶液灌溉伤口床 ，每个局部输注均为30分钟的停留时间
。吸入含有分散细胞的局部输注（每种治疗中的n = 2只动物）
，并立即将其放入Rnalater（Thermo Fisher Scientific）中。在单独的动物中，铜绿假单胞菌感染的伤口组织（n = 3只动物）被仔细从周围的未感染组织中切除 ，并在感染后48小时（未经GH或CIS-DA治疗）从周围的未感染的组织中切除肌肉层下方 。立即将感染的伤口组织放置在Rnalater（Thermo Fisher Scientific）中
。 　　用雌性BALB/C小鼠（6-8周龄）进行小鼠肺炎感染，实际上如前所述56
，并进行了一些修饰。简而言之，通过腹膜内注射0.2 ml氯胺酮（25 mg mL -1）和甲苯嗪（12 mg ml -1）的鸡尾酒来麻醉小鼠 。为了感染PA14衍生的菌株 ，室内灌输了大约107张CFU（一个亚致死剂量）铜绿假单胞菌细胞（25μlPBS）
。感染后48小时
，小鼠安乐死。无菌收集整个肺和脾脏，称重并在1 mL PBS中匀浆 。将组织匀浆串行稀释并在PIA上镀以CFU枚举
。为了感染PAO1衍生的菌株 ，将5×107 CFU（致命的剂量）（致命的铜绿假单胞菌细胞）用作接种物
，并在感染后24小时收集组织。 　　用瑞士韦伯斯特雌性小鼠（8周龄）进行了小鼠皮皮皮肤感染（也称为小鼠脓肿模型），基本上如前所述55进行了一些修改 。简而言之 ，大腿内侧被剃光
，并用脱毛剂（Nair）去除剩余的头发
。将大约1×107 CFU的铜绿假单胞菌细胞（PA14或ΔSICX）皮下注射到大腿内侧。感染后16小时，小鼠安乐死 。在1 mL PBS中采取无菌收集脾脏并匀浆。将组织匀浆串行稀释并在PIA上镀以CFU枚举
。 　　基本上如前所述进行RNA提取14。对于PA14的体外静态培养 ，首先如上所述（在标题为β-半乳糖苷酶测定的部分中）生长细胞
，并立即与五卷rnalater混合 。在4°C储存过夜后，将细胞重固定 ，重悬于含有1 mg ML-1溶菌酶的无核酸酶Te缓冲液（Acros Organics）中，并转移到含珠的管子中
，含有大型和小珠的混合物（分别为2 mm zirconia and kirconia and 0.1 mmmmmmmmmm zirconia/silica）
。对于体内生物膜分散实验（如上所述），从rnalater中去除感染的组织 ，与TE缓冲液混合
，并转移到珠珠管中。TE中的体外以及TE中的组织样品通过使用迷你珠子16的均质化被短暂破坏 。然后将样品在37°C下孵育30分钟，以酶裂解细胞
。接下来 ，将1 mL RNA-BEE添加到300μl样品匀浆中
，并通过珠子跳动3次将样品进一步机械裂解30 s。加入每1 ml RNA-BEE的200μl氯仿，并剧烈摇动管子30 s ，然后在冰上孵育5分钟 。然后将样品在4°C下以13,000克离心30分钟
，以分离水性和有机相
。将水相转移到新的微输出管上，并加入0.5 mL异丙醇（每1 mL RNA-BEE） ，并加入20μg线性丙烯酰胺。在-80°C下过夜孵育后
，将样品在冰上解冻，并在4°C下以13,000g离心30分钟 。用1 ml的75％乙醇洗涤两次颗粒 ，将空气干燥5分钟，然后重悬于100μl无RNase的水中
。用纳米体分光光度计（Thermo Fisher Scientific）确定每个样品的RNA浓度。使用Microbexpress试剂盒（Thermo Fisher Scientific）耗尽rRNA
，用于体外样品和QIASEQ FastSelect Kit（Qiagen）用于小鼠衍生的样品， 其次是乙醇沉淀 。用NEBNEXT镁RNA碎片模块试剂盒将耗尽的RNA碎片碎片2分钟 ，并根据制造商的说明
，使用NEBNEXT多重RNA库Prep Kit（New England Biolabs）制备cDNA库。使用75 bp的单端运行，在Georgia Technology NextSeq500的Georgia Technology Institute的分子演化核心上进行了测序
。 　　除了在本研究中制备的上述RNA-Seq库外 ，还分析了202个公开可用的铜绿假单胞菌RNA-SEQ数据集
，包括28个铜绿假单胞菌转录组，源自人类样品的28个 ，来自感染模型的28个和146个来自一系列良好定义的体外条件（列出了补充体外表1）。首先使用FASTQC V0.11.7（参考文献57）确认了原始测序读取的质量 。接下来
，使用custadapt 3.0（参考文献58），以最小的22个基础的读取长度阈值 ，使用CustAdapt 3.0（参考文献58）
，将RNA-Seq读数修剪在3'末端，以删除Illumina适配器（AGA TCG GAA GAG CAC CAC ACG TCT GAA CAG CAG TCA C）
。然后将修剪读数映射到P. p. eruginosa PA14参考基因组（可从pseudomonas.com下载） ，使用bowtie2 v2.4.2带有默认参数，用于端到端端到端口59。由于PA1414（SICX）最初是作为蛋白质编码基因注释的
，因此我们首先将读取为具有特征recounts的蛋白质编码基因，该蛋白质编码基因tarturecounts acubread v2.0.1（参考文献60；结果；结果如图1A所示） 。对于其余的分析（图1B ，2A和4B-D和扩展数据图2B和10）
，分配给了蛋白质编码基因以及199 SRNAS15的读取
。 　　用DESEQ2确定差异表达（图1a和4b – d;参考文献61）。为了比较不同样品中的SICX表达水平（图1A和扩展数据图5），使用DESEQ2软件包中的variancestabilizingTransformation（）函数对原始读数进行标准化 。为了估计各种特征（蛋白质编码基因 ，SRNA
，SICX和/或RSMYZ）的相对转录本丰度，我们计算了TPM
。首先 ，通过特征（基因）长度将原始计数归一化
，以产生每千碱基（RPK）的读数。接下来，将所有RPK值计数并除以1,000,000 ，以确定缩放系数 。最后
，将每个基因的RPK除以缩放因子
。所得的TPM值用于制作图24号。1b和2a以及扩展数据图 。2b和10。为了检查SICX读取的比对模式，使用Samtools v1.13来测量读取深度 ，包括每个核苷酸位置的SICX基因座62
。然后在绘图之前使用deseq2中的估算量函数（）函数对读取深度进行标准化。 　　使用代表多种假单胞菌分离株的365 16S rRNA序列在PHYML 3.0（参考文献63）中构建了最大可能的系统发育树 。为了更好地可视化树，我们仅包括大约50个来自铜绿假单胞菌菌株的16S序列
。将16S序列与肌肉对齐
，并用作PHYML 3.0的输入。通过校正的Akaike信息标准预测了最合适的进化模型 。在Itol64中对树进行了可视化和注释
。 　　使用Galaxy v2.0.1进行了基因本体论富集分析。使用基因本体论文件（从http://geneontology.org/docs/download-ontology获得）和P. eruginosa pao1 pao1基因本体学术语注释（从https:/pseudomonas.com.com.coms获得差异表达的基因（响应于GH或顺式）处理）（从http://geneontology.org/docs/download-ontology获得） 。进行了p值截止<0.05的本杰米尼– hochberg测试
。 　　所有实验至少进行了至少三次（除非在图传说中另有说明），并具有相似的观察结果。数字和传说中提供了动物研究和体外实验的确切n值 。使用Prism GraphPad 9进行了统计分析 ，并在图传说中指定
。对于Northern印迹
，每个实验至少进行了两次独立（通过使用新鲜提取的RNA样品），并显示了代表性的图像。 　　所有小鼠程序均严格遵守《国家卫生研究院的实验室动物的护理和使用指南》中的建议 。所有动物均以人道治疗 ，并在温度和湿度控制的设施（18-22°C； 40–50％）中进行治疗
，并以12小时的光线循环进行治疗。小鼠慢性伤口感染的方案得到了德克萨斯理工大学健康科学中心的机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准（协议编号为07044）和乔治亚技术研究所IACUC（协议编号A100127）
。小鼠皮下感染模型的方案得到了佐治亚理工学院IACUC的批准（协议编号A100127）。对于小鼠肺炎感染模型，所有实验程序均根据Emory University IACUC的指南进行 ，并根据批准的协议编号DAR-201700441进行 。 　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得
。