F. Elling和A. Pearson提供了N. Maritimus（SCM1）的培养 。如先前在28°C下所描述的固定孵化器中所述的经过修改的合成crenarchaeota培养基上，在经过1 mM NH4CL的经过修改的合成crenarchaeota培养基上生长了连续的SCM1培养物 。使用先前报道的NO2-检测测定法监测SCM1 N. maritimus细胞的生长1。使用相同的测定法以不同的铵浓度遵循SCM1生长。
通过适应先前描述的方案23 ，从猪笼草中纯化了天然细胞包膜 。制备了总共12升海藻猪笼草的培养物 ，并通过离心（10,000g，4°C，30分钟）收集晚期培养细胞 ，并冷冻并在-80°C下储存 ，直到进一步实验 。将来自1 L培养的细胞颗粒仔细悬浮在3 ml裂解缓冲液中（50 mM HEPES/NaOH pH 7.5，500 mM NaCl ，50 mM MGCL2 ，10 mM CaCl2，10 mm CaCl2 ，1％（w/v）Chap ，补充了1倍完整的蛋白酶抑制剂（ROCHE））。将细胞悬浮液在冰上孵育1小时，然后使用超声（10× ，5 s脉冲 ，振幅强度为10％）裂解 。随后将超声的样品离心（80,000g，4°C ，1小时） ，在离心管的底部形成一个很小的白色颗粒 。将沉淀重悬于40 µL相同的缓冲液中，并用于冷冻EM实验。对于富含铵的样品，缓冲液补充了2.5 mM NH4CL 。
对于冷冻EM和冷冻网格制备 ，使用了先前报道的方案18,23,41 。简而言之 ，将2.5 µl的样品应用于新鲜发光的量化量子R2/2 Cu/rh 200网格网格，吸附了60 s ，在Vitrobot Mark IV（Thermo Fisher Scientific）中插入4-5 s ，并在玻璃体标记IV（Thermo Fisher Scientific）中插入液态乙烷中，同时绘制了100％的脉冲 ，同时在100％的脉冲上保持了100％的张力。对于断层扫描 ，还补充了与蛋白A结合的10 nm金的标本 。将网格剪切并存储在液氮下，直到进行冷冻EM数据收集为止 。
对于S层的高分辨率原位结构测定 ，采用了高通量数据收集的管道42。简而言之 ，使用Titan Krios显微镜收集具有剂量对称倾斜方案的倾斜系列数据43 。倾斜系列的像素大小为1.327Å，总剂量为〜121 e -Å2 ，在整个系列中以3°倾斜度增量收集的整个系列 。总共收集了160个倾斜序列 ，其散焦范围为-2至-5 µm目标散焦，并将样品进行每个倾斜视频的0.9 s暴露，每个视频中包含10帧（扩展数据表1）。为了可视化细胞超微结构 ，使用Serialem Software44以像素大小为3.468Å的Serialem Software获得倾斜系列图像 ，散焦范围为-3至-10μm，±60°振荡 ，1°振荡 ，总剂量为〜172 e-Å2的总剂量为〜172 e-Å-Å-Å-Å-Å-Å433333333.333.333.3333.333;μm，±60°振荡 ，2°增量 ，总最终剂量约为160 e -2。
如先前所述，在泰坦Krios G3显微镜（Thermo Fisher Scientific）上收集了单粒子冷冻EM数据 ，该数据以300 kV的速度（Thermo Fisher Scientific）在300 kV上 ，配备了量子能量过滤器（狭缝宽度20 eV）和一个带有0.546Å的Sampling Pixel尺寸的量子尺寸（GATAN） 。对于N. Maritimus纯化的纸张样本，在三个课程中总共收集了12,557个视频 ，剂量速率约为3.5 e-e-e-e摄像机级别的每个超分辨率像素像素 。样本接触4.2 s ，在此期间，应用了约48-51 E -Å -2的总剂量，每个视频记录了40帧（扩展数据表2）。
为了获得初始的晶格图 ，使用了先前描述的策略16 ，其中使用IMOD45进行了使用金基金会的倾斜系列对准，并使用IMOD45进行了断层图生成 ，并使用CTFFIND446估算了初始对比度转移函数（CTF） 。使用在Tomo3D47中实现的同时迭代重建技术（SIRT）生成可视化的断层图 ，并使用Cryo-Care36,37进行了Deno 。使用用MATLAB编写的自定义脚本进行了亚图平均，在其他地方详细描述了42,48。对于初始的冷冻结构确定 ，我们使用了先前发布的方法17 ，主要区别在于使用最近开发的3D-CTF校正方法用于层析成像数据49 。然后将大致比对的子图坐标进口到Relion-4中进行进一步分析19 。我们使用了上面初始分析的视频框架对准倾斜序列，而无需进行其他预处理 ，以及在IMOD中执行的倾斜序列比对 ，CTFFIND446中的CTF参数以及Euler角度分配以及来自原始分析的euler角度分配以及微图的坐标。如最近所述，将导入的参数用于Relion-4中的多个伪图生成和重组的多个循环 。考虑到伪图的改进和重组的其他周期的每粒子运动 ，NMSLP六聚体的分辨率提高到C6对称性中的3.4Å 。对称的50,51的松弛导致了整体分辨率的改善（3.3Å） ，在假果糖轴处有3.2Å，但在己酰胺的外围降低了分辨率（〜4.5Å）（扩展数据表1和扩展数据图1）。为了相对于细胞中心的六聚体和五聚体S层位置的空间分析，每个位置与细胞中心的距离通过层次图中每个细胞中的最大距离六聚体/五聚体进行了标准化 。
对于来自二维纸的S层结构 ，如前所述 ，在我们的实验室中对S层进行了冷冻EM数据处理 。18,23。根据epu_group_afis（https://github.com/github.com/dustinmorado/epu_group_group_group_group_group_group_group_group_fis）实现的数据收集软件EPU（Thermo Fisher Scientific）的XML元数据，将在范围内收集的视频聚类为光学组。进口视频进行了运动校正 ，剂量加权和傅立叶裁剪（2×） ，并在3.153中实现了MotionCor252 。使用CTFFIND446估算了所得运动校正显微照片的CTF 。最初，S层床单的侧视图首先是使用Relion的Helical Picking Tab在晶格边缘手动采摘的 ，同时将螺旋式上升升至60Å。在中央六聚体轴上手动挑选了顶部和倾斜的景色 。将手动挑选的颗粒以4×倒数采样128×128 PX2盒提取 ，并使用Relion-3.1内的无参考2D分类进行分类 。以六聚体轴为中心的类平均值用于自动在Relion-3.1内挑选粒子。将自动采摘的颗粒以4×倒下采样的128×128 PX2框提取，并使用无参考的2D分类进行分类 。使用神经网络体系结构Conv127 ，使用以六聚体轴为中心的类平均值的粒子坐标在5倍下采样的显微照片中训练Topaz54 。对于最终的重建 ，使用TOPAZ和上面训练的神经网络挑选颗粒。此外，使用基于参考的自动启动器Inserion-3.1选择了顶部 ，底部和侧视图 ，Topaz不容易识别 。将颗粒在4×倒下的128 PX×128 PX盒中提取，并使用RELION-3.1内的无参考2D分类进行分类 。将属于以假果糖轴为中心的类平均值的粒子组合在一起， 除去30Å之内的颗粒以防止对齐后重复。然后将所有结果颗粒重新提取 ，以4×倒数采样128×128 PX2盒 。所有侧视图和顶部和底部视图的子集用于Relion-3.1中的初始模型生成 。然后将缩放和低通滤波输出用作512×512 PX2盒中3D自动改进的起始模型。每粒子散焦 ，各向异性放大倍率和高阶差点55在Relion-3.1内进行了完善，然后进行了三轮聚焦的3D自动填充。随后在640 PX×640 PX Box55中进行贝叶斯颗粒抛光 ，然后进行自动填充和对称性弛豫50,51 。最终地图是从354,860个颗粒中获得的 ，并使用着针对中央六聚体的软罩进行后处理，根据两个独立精制的半图在0.143的阈值时值的傅立叶壳相关标准 ，在0.143（ref 。56）和2.5数据的局部分辨率下 ，产生了2.7Å的全球分辨率（3.56）（ref。56）（ref 。图2） 。二维板状排列导致分辨率的各向异性，垂直于平面的分辨率较低 ，如定向FSCS57所估计。扩展数据表2和扩展数据图3提供了更多详细信息 。
对于模型构建 ，使用了先前描述的策略18,23 。对于单粒子冷冻映射，将原始的640×640×640素盒裁剪成320×320×320素盒。在冷冻-ET和冷冻EM图中 ，以及使用COOT58的单个NMSLP亚基 ，手动将NMSLP的蛋白质主链手动作为聚丙氨酸模型 。侧链是在明显可识别的位置分配的，该位置允许扣除蛋白质序列寄存器 。然后将该模型作为六个副本放入六聚体图中，并在CCP-EM软件Suite Suite60和Phenix61内使用REFMAC559进行了几轮细化 ，然后在COOT58中手动重建。在N末端 ，与NMSLPS的C末端的C6地图相比，C2地图更好地解析 。因此 ，在servalcat62中进行了多型原子模型的细化 。模型验证是在苯金和CCP-EM中进行的 ，并在UCSF Chimera63，UCSF Chimerax64和Pymol65中进行了数据可视化。为了分析晶格界面 ，将六聚体结构的多个副本放在具有更大盒子尺寸的冷冻EM图中。使用IMOD和FIJI66制备包含冷冻EM或冷冻图像的图形面板 。在UCSF Chimera63内绘制了用于视觉检查的S层的晶格图 ，并带有PlosObject插件，并在UCSF Chimerax64内部绘制了具有SYMAMERIX PDB PDB文件头的UCSF Chimerax64内部或使用Artiax Plugin68 。使用DeepeMhancer38在后处理水疗中心和STA地图以可视化N-聚糖密度（图2K和扩展数据图4G-H ，K – L）。使用REFMAC559和PHENIX61生成了两倍（C2）和六倍（C6）对称地图的复合图 ，然后使用MTZ2MRC在Phenix61中实现的MTZ2MRC进行了转换 。
先前描述的用于检测和分析SLP的策略18,23 。使用BLAST70和HHPRED71，在MPI生物信息学Toolkit69中进行了所有序列相似性搜索。对NR_ARC数据库进行了爆炸搜索 ，这是NR_ARC数据库 ，该数据库的NCBI非冗余蛋白质序列数据库的专门子集使用默认设置识别Archaea中NMSLP的同源物 。将搜索与Maritimus SLP的蛋白质序列接种 。使用HHPRED搜索和PDB70和ECOD70数据库的默认设置分析了几个获得的匹配项和许多实验表征的SLP（补充表1）的域组织，这些默认设置是PDB和ECOD数据库的版本，该版本是经过70％的最大成对的构建模型的PDB和ECOD数据库的版本。使用信号P（V.6.0）73预测信号肽 。使用窗口长度为7 ，使用浮雕电荷工具74计算蛋白质序列的平均局部电荷 。
ITC测量是使用Malvern Panalytical ITC200仪器在25°C的SCM缓冲液中进行的 ，而无需氯化铵。实验以10 µCAL S -1的参考功率进行，并以300 s的间隔进行注射 ，以捕获大型放热热量和宽峰值轮廓 。ITC电池在600 nm（OD600）的光密度下含有N. maritimus ，在1.0的OD600（OD600），注射器中的SCM缓冲液中含有10 mm氯化铵 。总共进行了10次注射 ，首次注射对应于0.5 µL ，然后进行9次注射1 µL，导致ITC细胞中最终的氯化铵浓度为0.475 mm。用0 、2.5或5 mM EGTA预处理30分钟 ，然后以16,000g离心15分钟 ，然后在缺乏氯化铵恢复的SCM培养基中离心15分钟，然后调整为1.0的OD600。对氯化铵注射到缓冲液中的控制测量值很小 ，并且接近缓冲液对缓冲液控制实验的值 。使用Malvern Panalytical Peaq软件从峰值整合之前 ，从猪笼草实验中减去了这种对照热量 。在SCM培养基中以1 mM氯化铵作为营养源中的细胞中制备的不同批次的野菜，对实验进行了三次实验。将这些培养物离心并重悬于SCM缓冲液中，在调整为1的OD600并加载到ITC细胞中之前 ，缺乏氯化铵 。
使用VMD（V.1.94）67制备了NMSLP六聚体结构进行原子MD模拟 。首先用TIP3P水分子和0.5 m NaCl溶解该系统 ，以模仿海水的盐度。接下来，将312个铵离子（0.1 m NH4+）随机分布在整个溶剂中 ，以及相等数量的氯离子离子以维持电荷中性系统 。NH4+的仿真参数是通过类比与甲基铵的现有CHARMM参数的类比得出的 。请注意 ，为了更好地帮助识别特定的离子结合位点，没有包括NMSLP冷冻EM和冷冻ET结构的结构离子。所得系统包含566,371个原子 ，其中包括136,236个蛋白质原子 ，141,657个水分子，2,246个钠离子 ，1,358个氯离子和312个铵离子 ，在六角形盒子内x = y = y = y = y = 217Å，z = 150Å和轴向= 150Å ，x =217Å和轴承 。γ= 60° 。选择了模拟框的几何形状 ，以便通过NMSLP六聚体与X -Y平面中的周期性图像的相互作用来复制邻近六聚体之间观察到的分子接口。然后，将系统进行一系列偶联梯度能量最小化，然后进行三个500 NS MD模拟 。为了防止由于缺乏结构离子抵消其高负电荷而导致的NMSLP六聚体的潜在变形 ，在模拟过程中 ，蛋白质原子（不包括氢）在模拟过程中受到谐波约束 。除非另有说明，否则在忽略每个模拟的前100 ns以确保平衡采样后进行分析。为了评估观察到的铵结合模式的鲁棒性 ，我们进一步构建了含有0.05 m（156 NH4+离子）浓度的铵的六聚体系统 ，并使用相同的程序（624 NH4+离子），相同的程序 ， 这些系统进行了单个500 NS生产模拟。请注意 ，在每个模拟中，由于盒子中的总铵离子很少 ，因此无法使用较低的铵离子 。所有模拟均使用NAMD（v.2.14）68和CHARMM36力场进行38 。生产模拟分别使用Nosé -Hoover Langevin Piston和Langevin恒温器使用了NPT集合与在1 atm和310 K保持在1 ATM和310 K的条件。R-RESPA集成器方案用于2 fs的集成时间步骤 ，并摇动所有氢原子的约束 。每2 fs计算出短距离的非键相互作用，截止量为12Å；使用粒子网 - 瓦尔德方法对远程静电学进行每6 fs的评估 。补充表3中提供了更多详细信息。
有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得 。
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文章不错《无氨氧化海洋古细菌中的无膜通道筛阳离子》内容很有帮助