除非另有说明 ，否则在25°C的标准玉米面酵母提取物培养基上饲养苍蝇。如下所示
，每项实验指示的是，从布卢明顿果蝇储备中心（BL）和维也纳果蝇资源中心（VDRC）产生了对耗尽PRC1亚基或执行控制实验的飞行线和十字架 。果蝇的转基因菌株的工作是在伦理批准的情况下进行的
。De la Recherche et de l'Ennovation的Ministèredel'Enseignementsupérieur的N6906C2于2020年4月8日发布。 　　对于PRC1亚基的KD实验和EIC的产生 ，GAL80T用于通过将温度从18至29°C切换来控制时间pH或PSC/SU（Z）2下调 。KD是使用EY-FLP系统在幼虫ED中生成的
。可逆KD系统的理由是：pH-RNAi和GFP标记在UAS序列的控制下。表达EY-FLP的细胞（图1A中的粉红色）在EDS中诱导转录停止（位于两个FRT位点之间的FLP）（位于两个FRT位点之间
，在图1a中指示），从而导致Act-Gal4的表达（图1A中的浅蓝色） 。Tub-Gal80ts（图1A中的紫色中）编码一个普遍表达的 ，温度敏感的GAL4阻遏物
。在限制性温度（29°C）下
，GAL80TS被灭活。GAL4激活UAS序列，表达pH-RNAI和GFP（作为pH-KD的读数） 。 　　要执行KD ，将苍蝇饲养并在18°C越过以抑制GAL4活性。每种基因型和实验总共与20名男性杂交了80名处女
。在所有情况下（否，恒定或瞬态KD）
，允许果蝇在18°C下产卵4小时，以同步胚胎和幼虫阶段。由于果蝇发育的时机取决于温度 ，因此我们适应了每个KD条件的时机
，以在可比的发育时间进行表型和分子分析 。下面列出了我们执行不同KD的苍蝇的基因型
。 　　对于ph-kd：ey-flp，act-gal4（frt.cd2 stop）（bl＃64095）;tubgal80ts（BL＃7019）;UAS-PH-RNAI（VDRC＃50028）/UAS-GFP（BL＃64095）。 　　对于PSC-SU（Z）2-kd：ey-flp ，act-gal4（frt.cd2 stop）（bl＃64095）;UAS-PSC-SU（Z）2 RNAi（BL＃38261
，VDRC＃100096）;tubgal80ts（BL＃7018）/UAS-GFP（BL＃64095） 。 　　用于控制白色kd：ey-flp，act-gal4（frt.cd2 stop）（bl＃64095）;tubgal80ts（BL＃7019）;UAS-W-RNAI（BL＃33623）/UAS-GFP（BL＃64095）
。 　　所有解剖​​均在L3阶段对雌性幼虫进行。对于无pH-KD（无耗尽） ，在整个发育过程中将苍蝇保持在18°C
，并解剖了10天的AEL 。对于恒定的pH-KD（恒定耗竭），在整个发育过程中将苍蝇保持在29°C ，并解剖了5天AEL
。对于幼虫的耗竭（从L1到L3）
，将果蝇保持在18°C下48小时，并在29°C下移动直至解剖5天AEL。对于在L1阶段的瞬态pH-KD ，将苍蝇保持在18°C的速度48小时，然后在29°C下移动24小时
，并返回至18°C，直到解剖9或11天AEL 。对于在L2阶段的瞬态pH-KD ，将苍蝇在18°C保持96小时
，在29°C下移动24小时，并返回至18°C ，直到四天ael ael
。对于在L3早期阶段的瞬态pH-KD
，将苍蝇在18°C保持120小时，在29°C下移动24小时 ，并返回至18°C
，直到解剖8天AEL。对于L3晚期的瞬态pH-KD，将苍蝇在18°C保持168小时 ，在29°C下移动24小时
，并返回至18°C，直到解剖8天AEL 。对于在L1阶段的瞬态PSC-SU（Z）2-kd ，将果蝇保持在18°C 48小时，在29°C下移动48小时
，并返回至18°C，直到解剖为8天AEL。对于所有条件 ，至少进行三个生物学重复
。对于每个重复
，在pH耗竭中对150个椎间盘进行了评分，并为PSC耗竭对30多个椎间盘进行了评分。pH（pH-D和pH-P）或PSC-SU（Z）2的恒定和瞬时耗竭在100％的解剖组织中产生肿瘤 。 　　为了评估生存能力 ，我们测量了成人孵化率
。为此
，在卵下卵4小时后，我们应用上述处理物在所需时间产生pH-KD。将小瓶保持在18°C ，并计算每种条件的p pa 。成人孵化率是通过将从pupae孵化的雄性和女性成年人的数量除以p的数量来计算的
。 　　对于在恒定pH-KD
，EY-FLP，ACT5C-GAL4（FRT.CD2 stop）下的ZFH1-RNAI和STAT92E-RNAI救援实验；+;UAS-GFP（BL＃64095）女性与各种基因型的雄性交叉。对于阴性对照实验 ，将女性与UAS-GFP-RNAI（BL＃9331）交叉；UAS-W-RNAI（BL＃33623）男性 。为了确认ZFH1-RNAI和STAT92E-RNAI不会引起眼睛发育的任何重大变化
，我们将女性越过UAS-ZFH1-RNAI（VDRC＃103205）；UAS-W-RNAI（BL＃33623）和UAS-STAT92E-RNAI（VDRC＃43866）;UAS-W-RNAI（BL＃33623）男性
。通过与UAS-GFP-RNAI越过女性（BL＃9331）进行阳性对照实验。UAS-PH-RNAI（VDRC＃50028）男性 。对于救援条件，我们将女性越过UAS-ZFH1-RNAI（VDRC＃103205）；UAS-PH-RNAI（VDRC＃50028）和UAS-STAT92E-RNAI（VDRC＃43866）;UAS-PH-RNAI（VDRC＃50028）男性
。这种系统的育种策略促进了在恒定pH-KD条件下ZFH1和STAT92E基因的特定作用的研究。 　　饲养苍蝇并在18°C越过 ，并在18°C饲养的后代中对肿瘤进行评分 。请注意，在这种遗传背景中没有GAL80T
，因此KDS独立于温度获得。在pH-KD阳性对照的情况下，在后代中观察到具有100％渗透率的肿瘤表型
。 　　ZFH1-RNAI和STAT92E-RNAI救援实验 ，瞬态pH-KD
，EY-FLP，ACT5C-GAL4（frt.cd2 stop）（BL＃64095）;+;Tubgal80ts（BL＃7018）/TM6BTB女性与各种基因型的雄性交叉。对于阴性对照实验 ，将女性与UAS-GFP-RNAI（BL＃9331）交叉；UAS-W-RNAI（BL＃33623）男性 。为了确认ZFH1-RNAI和STAT92E-RNAI不会引起眼睛发育的任何重大变化
，我们将女性越过UAS-ZFH1-RNAI（VDRC＃103205）；UAS-W-RNAI（BL＃33623）和UAS-STAT92E-RNAI（VDRC＃43866）;UAS-W-RNAI（BL＃33623）男性
。通过与UAS-GFP-RNAI越过女性（BL＃9331）进行阳性对照实验。UAS-PH-RNAI（VDRC＃50028）男性 。对于救援条件，我们将女性越过UAS-ZFH1-RNAI（VDRC＃103205）；UAS-PH-RNAI（VDRC＃50028）和UAS-STAT92E-RNAI（VDRC＃43866）;UAS-PH-RNAI（VDRC＃50028）男性
。这种系统的育种策略促进了在瞬时pH-KD条件下ZFH1和STAT92E基因的特定作用的研究。 　　饲养苍蝇并在18°C越过 ，并在18°C下将卵子放电过夜 。对于瞬时耗竭
，将果蝇保持在18°C的48小时，然后在29°C下移动24 h ，并返回至18°C
，直到解剖10天AEL
。 　　根据先前描述的方案进行同种异体移植。62 。使用了以下飞行线：EY-FLP（BL＃5580），UBI-P63E（frt.stop）Stinger（BL＃32249）;Tub-gal80ts（BL＃7019）;ACT5C-GAL4（FRT.CD2） ，UAS-RFP（BL＃30558）/UAS-PH-RNAI（VDRC＃50028）
。简而言之，将NO-PH-KD
，恒定pH-KD或瞬态pH-KD L3雌性幼虫的GFP阳性ED在PBS中解剖，切成小块 ，并注入成年雌性宿主的腹部（BL＃23650）。在18°C进行整个实验
，以避免pH-RNAI表达的重新激活 。为了在同种异体移植物中评分肿瘤进展，使用Leica MZ Fliii每2天对苍蝇进行一次成像 ，以验证GFP作为肿瘤生长的读数。当宿主腹部完全GFP时
，解剖并重新注射肿瘤
。使用Sony CMOS毒物传感器的Ximea USB 3.1 Gen1摄像头拍摄了注射的果蝇图片。 　　在1×PBS的室温下剖析了L3雌性幼虫的EDS，并在4％甲醛中固定20分钟 。将组织在旋转轮上的1×PBS+0.5％Triton X-100中透化1小时
。将透化组织在3％BSA PBTR（1×PBS+0.1％Triton X-100）中阻塞1小时 ，并在4°C的旋转轮上用PBTR+1％BSA稀释的原代抗体在4°C的旋转轮上孵育O/N。对于双链断裂染色
，在室温下以1×PBS剖析幼虫，将4％多聚甲醛固定30分钟 ，然后在室温下孵育初级抗体2小时 。The following primary antibodies were used: goat anti-PH63 (1:500), mouse anti-ELAV (1:1,000, DSHB, catalogue no. 9F8A9), mouse anti-ABD-B (1:1,000, DSHS, catalogue no. 1A2E9), chicken anti-GFP (1:500, Invitrogen, catalogue no. A10262), rabbit anti-ZFH1（参考文献49）（1：2,000）和兔子反启动H2AVD PS137（1：500
，Rockland，目录号600-401-914）
。然后 ，将样品在PBTR中洗涤3次，然后在旋转轮上的室温下在PBTR中添加二级抗体2小时。The following secondary antibodies were used: donkey anti-goat Alexa Fluor 555 (1:1,000, Invitrogen, catalogue no. A-21432), donkey anti-mouse Alexa Fluor 647 (1:1,000, Invitrogen, catalogue no. A-31571), donkey anti-chicken (1:1,000, Clinisciences, catalogue no.703-546-155）
，驴抗兔Alexa Fluor 555（1：1,000，Invitrogen ，CatalogNo 。A-31572）
，驴抗兔Alexa Fluor 488（1：1,000，Invitrogen ，Invitrogen
，Catalogno
。A-21206）。F-肌动蛋白通过添加Rhodamine phalloidin Alexa Fluor 555（1：1,000，Invitrogen ，CatalogNo 。R415）或Alexa Fluor 488（1：1,000
，Invitrogen，CatalogNo
。A12379）染色。在PBTR中将组织洗涤3次 。DAPI（4,6-Diamidino-2-苯基吲哚）以1 µg ML-1的最终浓度进行15分钟进行染色。然后将圆盘在PBTR中洗涤 ，并安装在Vectashield培养基（Eurobio Scientific
，CatalogNo
。H-1000-10）或延长金色抗FANTIFADE剂（Life Technologies， P36930）。使用Leica SP8-UV共聚焦显微镜进行图像采集 。使用Fiji64测量ED区域 ，通过在DAPI标记的组织周围绘制轮廓线并测量其表面
。至少考虑了30个EDS来测量每种情况下的平均ED区域。使用×60的油浸入物镜和冷却NAP HQ2摄像头量化双链断裂焦点的图像是用Deltavision Deonvolution显微镜拍摄的 。通过SoftWorx v.6.0使用反卷积处理图像
。所有实验均在生物学重复项中进行。 　　使用Click-It Plus Alexa Fluor 555 Imaging Kit（Invitrogen，CatalogNo 。C10638）进行EDU实验
。在施耐德培养基中
，在室温下解剖L3雌性幼虫的EDS。然后，在室温下在旋转轮上用25 µm的EDU溶液进行15分钟的EDU掺入 。用PBS洗涤后 ，将组织固定在4％甲醛中30分钟
，并用PBS洗涤3次
。将想象的盘在旋转轮上的1×PBS+0.5％Triton X-100中透化1小时，然后在1×PBS+0.1％Triton X-100+3％BSA中阻塞1小时。根据制造商的说明 ，在室温下在旋转的轮子上进行30分钟进行EDU检测 。接下来
，在包含20 eDs的管子中制备了500 µL的单击反应鸡尾酒。1×PBS+0.1％Triton Wash DAPI染色后，最终浓度为1 µg mL -1 15分钟
。将组织在1×PBS+0.1％Triton中洗涤 ，并将圆盘安装在Vectashield培养基中。使用Leica SP8-UV共聚焦显微镜进行图像采集 。补充视频中显示的EDU染色ED的图像是使用4Y模态的Zeiss LSM980飞机显微镜获得的
。使用默认设置
，使用Zen（v.3.6 Blue Edition，Zeiss）处理Edu染色ED的Airyscan图像。使用Imaris（V.10.1 ，牛津仪器）创建视频 。所有实验均在生物学重复项中进行
。 　　如前所述65,66进行染色体制备和鱼类。在0.7％NaCl溶液中剖析了L3期幼虫的EDS
，并在秋水仙碱溶液（3 mL的0.7％NaCl+100 µL 10-3 m秋水仙碱）中孵育1小时 。将EDS在0.5％乙酸钠中孵育7分钟，然后在盖玻片上固定（在45％乙酸中新鲜制备的2.5％PFA）4分钟
。使用手动力将EDS压到聚赖氨酸涂层的载玻片上 ，然后在液氮中捕获冷冻。将载玻片在100％乙醇中洗涤5分钟，空气干燥并用荧光原位杂交（FISH）探针染色
，如先前所述65 。探针序列为：5'-6-FAM-（AACAC）7，5'-CY3-TTTTTTTTCCAAATTTCGGTCATCAAAATAATCAT和5'-CY5-（AATAT）6
。鱼染剂用于帮助鉴定在重排条件下的染色体。使用×60的油浸入物镜和冷却NAP HQ2摄像机在Deltavision Deonvolution显微镜上进行显微镜采集 。使用SoftWorx v.6.0处理图像进行反卷积。 　　L3早期雌性幼虫被转移到含有标准食品培养基的培养皿中 ，并使用精密的X-RAD IR160辐照体暴露于5 Gy X射线
。辐照后
，在1×PBS的室温下在指示的时间点上解剖幼虫头，并在免疫染色之前固定在4％多聚甲醛中30分钟。如上所述进行显微镜和图像分析 。 　　L3雌性幼虫在冰上的施耐德培养基中解剖
。使用TRIZOL试剂从ED中提取总RNA。使用RNA清洁和浓缩器试剂盒进行RNA纯化（Zymo Research ，CatalogNo 。R1015）
。使用Maxima第一链互补DNA合成试剂盒进行逆转录（Invitrogen
，CatalogNO。K1642） 。使用LightCycler 480 SYBR Green I Master Mix（Roche，CatalogNo
。04707516001）进行定量PCR（QPCR）。使用LightCycler和GraphPad Prism软件分析了具有逆转录（RT -QPCR）实验的QPCR 。所有实验均在生物学三份中进行
。 　　L3雌性幼虫在冰上的施耐德培养基中解剖。使用TRIZOL试剂从ED中提取总RNA 。使用RNA清洁和浓缩器试剂盒进行RNA纯化（Zymo Research ，CatalogNo。R1015）
。最后
，通过Novogene（https://en.novogene.com/）进行了多A RNA选择，库制剂和光明测序（20 m配对 - 末端读数 ，150 nt）。所有实验均以三份进行 。 　　按照制造商的说明
，使用QIAAMP DNA微型试剂盒（Qiagen）分离GDNA
。对于每种生物学重复，阐述了大约70个来自流浪的雌性幼虫的ED。总的来说 ，我们对对照样品进行了四个生物学重复（无pH-KD条件，即用于瞬时耗竭的幼虫
，这些杂物在恒定的允许温度为18°C下饲养） 。此外，对12个肿瘤样品进行了测序 ，也就是说
，两种生物学重复针对六个不同的耗尽条件，如下：（1）恒定pH-kd；（2）瞬态pH-KD D9;（3）瞬态pH-KD D11;（4）早期L3 pH-KD ，恢复24小时；（5）早期L3 pH-KD
，96 h恢复和（6）早期L3 pH-KD，144 h恢复
。所有这些条件都会导致肿瘤形成。所有样品的GDNA均由Novogene（https://en.novogene.com/）处理图书馆准备 。简而言之 ，GDNA的平均大小约为350 bp
，然后根据制造商（Illumina）配对的协议进行处理进行DNA库制备
。使用Illumina Novaseq 6000平台进行测序，以生成150 bp的配对读数 ，覆盖范围至少为99％的基因组。 　　每次重复的冰上
，在冰上介绍了大约150 eds 。为了收集足够的材料，将ED分批分解 ，在液氮中冷冻，并存储在-80°C下
。将椎间盘直接在放射免疫沉淀测定缓冲液（50 mM Tris pH 7.5
，150 mM NaCl，1％NP40 ，0.5％Na-脱氧乙基酸盐
，0.1％SDS，2×蛋白酶抑制剂）中匀浆 ，并在冰上孵育10分钟。如有必要
，进行第二轮机械解离 。将样品在4°C下在10,000克离心10分钟，然后将上清液转移到新的管中。使用BCA蛋白测定法对蛋白质进行定量 ，并在每块凝胶道中使用10 µg
，在MES 20×迁移缓冲液和转移1小时的200 V迁移前使用10 µg（1 A）
。在室温下，PBS+0.2％Tween+10％奶粉在PBS+0.2％Tween+10％的奶粉中阻塞1小时 ，在4°C下在4°C的PBS中孵育O/N
，并在PBS+0.2％Tween中洗涤。使用了以下主要抗体：兔抗PH（1：200），兔抗ZFH1（参考文献49）（1：2,000） ，小鼠抗β微管蛋白（1：5,000，DSHB
，目录NO.AA12.1） 。在室温下将膜偶联的二抗与膜孵育2小时
。使用了以下二级抗体：山羊抗trabbit（1：15,000，Sigma ，目录号A0545）
，兔抗小鼠（1：15,000，Sigma ，Catalogno。A9044） 。在PBS+0.2％Tween中洗涤膜
，并使用Super Signal West Dura试剂盒（Pierce）和Chemidoc Bio-Rad揭示
。使用来自Bio-Rad的Imagelab软件v.6.1分析蛋白质印迹。补充图1中提供了全尺寸的原印迹图像 。 　　如先前所述41，对L3 ED进行了芯片序列 ，并进行了少量的修改
，并且每次重复使用400 ED
。如有必要，将几个解剖和/或收集批次在液氮中冷冻 ，并在-80°C下储存以收集足够的材料。使用Bioruptor Pico（Diaco）对染色质进行超声处理10分钟（30 s ON
，30 s折） 。pH抗体67被稀释1：100，以进行免疫沉淀
。降低链接后 ，使用DIAGODE的微chip尿布柱纯化DNA。使用Nebnext Ultra II DNA库准备套件为Illumina制备用于测序的DNA文库 。Novogene（https://en.novogene.com/）进行测序（配对 - 末端测序150 bp，每个样品大约4 GB）。所有实验均在生物学重复项中进行
。 　　剪切和运行实验如卡米·艾哈迈德（Kami Ahmad）所述进行的
，以较小的修改为“ protasts.io”（https://doi.org/10.17504/protocols.io.umfeu3n）。我们在Schneider培养基中剖析了50次ED，在700g处将它们离心3分钟 ，然后用洗涤+缓冲液洗涤两次
，然后再添加浓蛋白粉A涂层珠 。在冰上进行30分钟的MNase消化（来自细胞信号传导的PAG-MNase酶）
。蛋白酶消化后，使用Spriselect珠回收DNA ，并在50μl的Tris-EDTA中洗脱。使用Nebnext Ultra II DNA库准备套件为Illumina制备用于测序的DNA文库 。Novogene（https://en.novogene.com/）进行测序（配对 - 末端测序150 bp
，每个样品大约2 GB）
。使用了以下抗体：H3K27me3（1：100，Active Motif ，CatalogNo。39155）
，H3K27AC（1：100，Active Motif ，Active Motif
，CatalogNo 。39133），H2AK118UB（1：100 ，细胞信号，CATINGING NO. 8240）
。所有实验均在生物学重复项中进行。 　　使用Diagodode（目录号C01080002）的ATAC-SEQ试剂盒进行ATAC-SEQ实验 。将十个ED用作每种复制和条件的起始材料
。使用13个循环通过PCR扩增标记的DNA
，并通过Novogene（https://en.novogene.com/）对纯化的DNA库进行测序（配对 - 末端测序150 bp，大约2 GB）。所有实验均在生物学重复项中进行 。 　　ChIP–seq, CUT&RUN and ATAC-Seq were performed in duplicates, following Encode’s standards (https://www.encodeproject.org/chip-seq/transcription_factor/#standards; https://www.encodeproject.org/atac-seq/#standards).根据Encode的建议（https://www.encodeproject.org/data-antard/rna-seq/long-rong-rnas/） ，一式三份进行RNA-Seq。 　　通常
，在生物学重复项中进行了免疫染色实验
。每个生物学重复均从独立的遗传杂交中获得。唯一的例外是图1J所示的磷酸-H2AV染色和扩展数据图2C，该染色是一次进行的 ，但是从六个独立的遗传杂交中得分的组织 。有关免疫染色实验的样本量
，请参见补充表6中的名为“所有样本数 ”的表格
。对于转录组，RT – QPCR和Western印迹分析 ，在生物学三份中进行了实验。ATAC-SEQ
，剪切和运行，芯片seq和免疫染色实验在生物学重复项中进行 。每个生物学重复均从独立的遗传杂交中获得
。 　　对于图1和图2中提出的实验。1和5 ，以及扩展的数据图2 。1 、2
、3、5和6
，涉及具有不同线条和不同条件的遗传杂交，然后进行组织面积测量和免疫荧光 ，进行了两种独立的生物学重复，结果相似
。在补充表6中报道了成像中测得的面积和成像中分析的组织数量。 　　同种异体移植实验在两个独立的生物学重复中进行 。在第一个复制中
，使用了一种在恒定的pH耗竭中获得的起始肿瘤，并使用了一种从瞬时pH耗竭获得的肿瘤
。在第二重复中 ，注射了两个恒定的pH耗竭和两个瞬时pH耗竭肿瘤。两个重复的结果相似 。在扩展数据的图中报告了注射宿主蝇的总数图7b
，c。 　　所有内部生物信息学分析均在R v.3.6.3（https://www.r-project.org/）中进行
。使用data.table r软件包进行了基因组坐标文件和下游计算的计算（数据：data.frame'的扩展。在所有相关图形和扩展数据图的面板中，框图描绘了中位数（线） ，上和下四分位数（框）±1.5×四分位数范围（晶须）和异常值 。对于每个相关面板
，使用的统计检验在标题中指定：NS表示不显着（p> 0.05）， *p< 5 × 10−2, **P < 1 × 10−2, ***P < 1 × 10−3, ****P < 1 × 10−5. 　　gDNA variant calling was performed by Novogene (https://en.novogene.com/). Briefly, base calling was performed using Illumina pipeline CASAVA v.1.8.2, and subjected to quality control using fastp with the following parameters: -g -q 5 -u 50 -n 15 -l 150 --min_trim_length 10 --overlap_diff_limit 1--overlap_diff_percent_limit 10. Then, sequencing reads were aligned to the dm6 version of the Drosophila genome using Burrows–Wheeler aligner with default parameters and duplicate reads were removed using samtools and PICARD (http://picard.sourceforge.net). Raw SNP and InDel sets were called using GATK with the following parameters: --gcpHMM 10 -stand_emit_conf 10 -stand_call_conf 30. Then, SNPs were filtered using the following criteria: SNP QD < 2, FS >60 ，MQ< 30, HaplotypeScore >13
，绘图QualityRanksum< −12.5, ReadPosRankSum < −8. For INDEL variants, the following criteria were used: QD < 2, FS >200，readposranksum< −20. UCSC known genes were used for gene and region annotations. Finally, the variants were compared to a batch-matched control sample (no ph-KD), in the search for bona fide SNVs and InDels using the MuTect2 module of the GATK package. Only SNVs and InDels variants that passed Mutect2 filtering (FILTER = “PASS
”) were considered for downstream analyses. Structural variants and CNVs were detected using breakdancer (https://github.com/genome/breakdancer) and CNVnator (https://github.com/abyzovlab/CNVnator) software packages, respectively. 　　Then, called variants were imported in R for downstream analyses. When looking at the fraction of tumour samples that contained a given alteration (Fig. 1h), we only retained SNVs or InDels with an allelic fraction greater than 0.2, structural variants that were supported by at least five reads and CNVs with an allelic fraction bigger than 1.5 (duplication) or smaller than 0.66 (deletion). 　　After initial quality checks of the newly generated data using fastqc (http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/), the paired-end reads were aligned to a custom index consisting of the dm6 version of the Drosophila genome together with GFP, EGFP and mRFP1 sequences, using the align function from the Rsubread R package68 (v.2.0.1) with the following parameters: maxMismatches = 6, unique = TRUE. Next, aligned reads were counted for each D. melanogaster transcript (dmel_r6.36 annotation) using the featureCounts function from the Rsubread R package (v.2.0.1, isPairedEnd = TRUE) and differential expression analysis was performed using the DESeq2 R package69 (v.1.26.0, design = ~replicate + condition). The tables corresponding to the different comparisons are available in Supplementary Tables 1, 4 and 5. 　　For the differential analysis of the transcriptomes after no ph-KD (control), constant and transient ph-KD, each ph-RNAi sample was compared to temperature-matched w-RNAi controls (Fig. 2a and Extended Data Fig. 8b). DESeq2 outputs are available in Supplementary Tables 1 and 5. For the differential analysis of the transcriptomes after zfh1+w-KD, Stat92E+w-KD, gfp+ph-KD, zfh1+ph-KD and Stat92E+ph-KD, all were compared to temperature-matched gfp+w-KD (Supplementary Table 4). 　　For the clustering, we selected the genes that were differentially expressed (Padj < 0.05 and |log2fold2 fold change | >1）在恒定或瞬态pH-kd（D9或D11 AEL）之后
。此外 ，我们仅考虑了在没有pH-KD后未显示显着变化的基因（对照）。然后
，将log2折叠变化值剪切在第5和第95个百分位数，并使用Kohonen R Package70（v.3.0.10）的SuperSom函数聚类 。由于第9天和第11天的瞬态pH-KD产生了基本相似的转录组 ，因此对两层的两层自组织图进行了训练（第1层，恒定pH-kd；第2层
，D9和D11瞬态pH-KD），具有相似的两层 ，使用3×2网格（拓扑= topology = hexagonal
，toroidal = true）
。群集输出在补充表2中可用。 　　After initial quality checks of the newly generated data using fastqc, the reads were aligned to the dm6 version of the Drosophila genome using bowtie 2 (ref. 71, v.2.3.5.1) with the following parameters: --local --very-sensitive-local --no-unal --no-mixed --no-discordant --phred33 -I 10 -X 700, and low mapping quality reads were使用samtools72（-q30，v.1.10）丢弃 ，使用htslib v.1.10.2-3） 。 　　pH
，H3K27ME3，H3K27AC ，H2AK118UB和ATAC -SEQ峰和/或域分别为每个复制和使用MACS2（Ref
。73
，v.2.2.7.1）的读取，并使用以下参数使用以下参数： - keep -gecept 1 -g gep dm -f dm -f dm -f dm -f bampe -bampe -b -bampe -b -bampe。对于pH芯片seq ，将输入样品用作对照 。对于H3K27me3
，H3K27AC和H2AK118UB切割和运行，IgG样品被用作对照
。仅在两个重复中检测到峰（富集大于0和Q值小于0.05） ，并使用合并的重复（富集大于2和Q）< 0.01) were retained for further analyses, after being merged with a minimum gap size of 250 bp for narrow peaks (PH, H3K27Ac and ATAC-Seq) and 2.5 kb for broad marks (H3K27me3 and H2AK118Ub). The macs2 bedgraph files were used for visualization purposes. 　　For the differential analysis of H3K27me3, H3K27Ac, H2AK118Ub CUT&RUN and ATAC-Seq, peaks and/or domains were first merged across all conditions (maximum gap of 250 bp for H3K27Ac and ATAC-Seq peaks; 2.5 kb for H3K27me3 and H2AK118Ub domains) and overlapping reads were counted using the featureCounts function from the Rsubread R package (v.2.0.1, isPairedEnd = TRUE). Differential analysis was then performed using the DESeq2 R package (v.1.26.0, size factors, total number of aligned reads; design, ~replicate + condition). The same procedure was used for the differential analysis of ATAC-Seq peaks between zfh1+ph-KD and gfp+ph-KD. 　　For the clustering of ATAC-Seq peaks, we only considered the peaks showing a significant difference (Padj < 1 × 10−3 and |log2 fold change| >1）在恒定或瞬态pH-KD（第11天AEL）和最小log10碱基平均值为1.25之后，以避免嘈杂的峰。使用Kohonen R package70（v.3.0.10）的SuperSom函数在第五和第95个百分点处剪辑log2倍数变化值
，并使用四层自组织映射（第1层，log2fold Change Consance ph-kd; log2 fless ph-kd; log2 flase 2; log2fold phs ph ph-kd; log 2 flast ph-kd; log2 flast ph ph-kd; log 2 forter 3;层 ，使用1×3网格（拓扑=六边形
，圆环= true） 。完整的聚类输出在补充表3中可用。 　　为了定义PCG靶基因，我们通过删除由于测序间隙（GITHUB）而删除对控件（无pH-KD）条件中的一组干净的H3K27me3域 ，从而导致241个域
。然后
，只有至少50％的基因体与H3K27me3结构域重叠的基因被视为直接PCG靶标。相关时，只有不可逆转 ，可逆和不受影响的基因在考虑时是直接的PCG靶标（图3） 。PCG目标基因分配可在补充表2（PCG_BOUND和类列）中获得
。 　　为了评估一个基因在给定条件下的H3K27me3结构域或H3K27AC峰重叠
，我们使用了不同的标准。对于H3K27me3（图3B），只有至少50％的基因体与自信的H3K27me3结构域重叠的基因（“切割和运行 ，ChIP-Seq和Atac-Seq处理
，峰值处理，峰值呼叫和差异分析”部分）被视为上面的基因 。对于H3K27AC（图3C） ，仅在基因体或TSS上游2.5 kb上游的基因被视为命中
。 　　为了分配pH峰（扩展数据图6E）或ATAC-SEQ峰（图4B），将峰分配给最接近的TSS
，最大的基因组分离为25 kb（不考虑位于较远的峰）。 　　使用AnnnotationDBI R软件包（https://bioconductor.org/packages/AnnotationDbi.html，v.1.48.0）检索了与感兴趣基因和一组基因相关的基因本体术语 ，这些基因和背景基因组成 。对于每个基因本体论项
，使用单方面的Fisher精确检验评估了过度占代表性（替代=“更大 ”）
。使用错误发现率（FDR）校正所获得的P值以进行多次测试。 　　为了搜索在每个ATAC-SEQ簇上富含的DNA结合基序，我们使用了相应峰±250 bp的中心（总计500 bp） 。使用位置权重矩阵数据库的v.6.0（由24,453个位置权重矩阵）的v.6.0使用I-Cistarget Online工具74分析所得区域
。仅考虑归一化富集得分的最高评分基序大于5.5 ，而排名小于50的基序才被考虑在内（图4E）。 　　为了搜索与恒定或瞬态pH-KD后增加或降低可访问性相关的图案
，我们使用了MotifMatch r套件中的MatchMotifs函数（V.1.1.1.18.0; v.1.1.18.0;https://doi.org/10.18129/b9.b.bioc.motifmatchr）带有以下参数：pcutoff = 5×10-4，bg ='Genome' ，Genome ='dm6' 。值得注意的是
，仅考虑与果蝇转录因子基因相关的基序，该基因通过初始DESEQ2初始过滤器进行了考虑。然后 ，我们使用cv.glmnet和r（v.4.1.4）中的glmnet软件包的glmnet函数拟合了两个拉索回归
，其中包括以下参数：lambdas = 10seq（2，-3 ，by = -0.1），标准化
，true，true;Nfolds ，5）
，旨在预测恒定或瞬态pH-KD后的Log2折叠变化
。最强| S0 |的前25个主题|两种模型中的任何一个中的系数均用于训练两个线性模型，以预测瞬态或恒定pH-kd后的log2折叠变化。仅考虑了两个线性模型中的至少一个（p <1×10-5）中具有显着系数的基序（图4F） 。 　　通过使用Mann-Whitney检验和TNMPLOT数据库进行差异基因表达分析 ，该数据库包含来自癌症基因组（TCGA）和基因型基因组 - 基因组 - 基因组 - 基因组 - 基因组基因组表达（GTEX）的转录组级RNA-SEQ数据Repositories76
。 　　使用Pan-Cancer（膀胱
，肺腺癌和直肠腺癌）或基因阵列（乳腺癌，卵巢和前列腺）77,78进行生存分析。PAN-CACTER数据集基于使用Illumina HISEQ 2000平台生成的TCGA数据 ，其生存信息来自已发表的来源79 。使用Affymetrix HGU133A和HGU133PLUS2基因芯片获得基因阵列样品
。样品被MAS5标准化
，每个样品中的平均表达缩放到1,000。鉴定出代表单个基因的最可靠的探针集被识别为usnaiing jetset80 。 　　在生存分析中，通过COX比例危害回归分析了表达下部四分位数之间的每个截止值 ，并计算FDR以纠正多个假设检验
。然后
，在绘制生成以可视化生存差异的Kaplan-卑鄙生存图时，使用了最佳性能。计算具有95％置信区间的危险率以数值评估两个队列之间的生存时间差 。统计分析是在R统计环境（www.r-project.org）中进行的
。可以在www.kmplot.com和www.tnmplot.com上使用平台验证单个基因的分析结果。 　　对于来自多发性骨髓瘤患者的基因表达分析数据 ，我们使用了六个同类群，其中包括来自TT2的纯化多个骨髓瘤细胞的Affymetrix基因表达数据（HGU133PLUS2）（Ref 。81）（基因表达综合
，登录号GSE2658），GSE2658） ，TT3（REF。82）（REF
。82）（Ref。82）（cosceion eccession eccession eccession eccession nymum-1138 HOM-1138 HOM-1138 HOM-1138 HOM-1138 HOM-1138 HOM-113）（登录号GSE19784）队列（345 、158和282例新诊断的多发性骨髓瘤患者
，他们接受了高剂量的Melphalan和自体造血干细胞的治疗）；Mulligan COHORT84（在单一疗法中通过蛋白酶体抑制剂治疗的188例复发患者）；MTP队列不合格HDT85（63例新诊断的多发性骨髓瘤患者，他们不符合高剂量的Melphalan和自体造血干细胞移植的资格 ，MTP DARA COHORT 85,86（51例患者在抗复发治疗中
，由抗复发抗体）anti-CD38 monocodum（Da​​raTumumumumum）（DARATUM）（DARATUM） 。使用MAS5算法将基因表达数据标准化，并使用以前完成的WebTool GenomicsCape（http://www.genomicscape.com）使用R环境（www.r-project.org）进行数据处理
。如前所述89 ，研究了PHC1
，PHC2，PHC3 ，CBX2
，CBX7和BMI1基因表达的预后值和BMI1基因表达的预后值。通过使用Mann -Whitney检验，进行了来自健康供体的正常骨髓浆细胞与患者多个骨髓瘤细胞的差异基因表达分析 。PHC1 ，PHC2，PHC3
，CBX2，CBX7和BMI1基因的预后价值使用我们先前发表的Methodology89（六个基因的COX B系数的总和）（如果患者的多发性骨髓瘤细胞信号高于proge at proge at Pibe at MaxStat值）
。使用morpheus软件（https://software.broadinstitute.org/morpheus）进行聚类 使用GraphPad Prism软件（http://www.graphpad.com/scientific-software/prism/）和小提琴图。 　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得 。