根据美国国立卫生研究院制定的指南 ，并获得了美国国家神经系统疾病和中风研究所或国家牙科和颅面研究动物护理委员会的批准 ，进行了使用动物的实验。鼠标线AI95（RCL-GCAMP6F）-d（编号024105）30，MRGPRD-CREERT2（第031286号）29 ，MRDPRB4-TDTT-2A-CRE（NO 。021077）4 ，TRPV1-CRE（NO 。017769）54，SST-CRE（no。017769）54，SST-CRE（NO 。（第003770号）38是从杰克逊实验室购买的 。先前描述了TAC1-TAGRFP-2A-TVA小鼠系列56 ，Avil-FLP Line57是D. Ginty的礼物。我们还生成了与SST-CRE ，AVIL-LSL-2A-TENT系列和使用CRISPR-CAS9介导的重组56的Rosa-LSL-2A-Tent系列和Rosa-LSL-2A-Tent系列和Rosa-lsl-2a-tent系列和Rosa-cag-fsf-lsl-kord系列的新的Rosa-Cag-LSL-SOMA-JGCAMP8S系列。雄性和雌性小鼠均在所有实验中使用，并随意使用标准实验室Chow和水 。将小鼠饲养在受控的环境中（23°C和50％的湿度 ，且面积为12小时）；没有使用统计方法来预先确定样本量 。
左脑室内注射1μLAAV9-CAG-CRE病毒（2×1012至2×1013病毒粒子ML-1；目录号CV17187-AAV9; Vigene）或AAV9-CMV-CRE病毒（virene）; catalog no 1; catalog no to catalog no to in in no no no catalog。如前所述42 ，使用3天大的小鼠幼崽在三叉神经节神经元中实现GCAMP的随机表达 。42 。为了诱导Creert2重组，将他莫昔芬（Sigma-Aldrich）溶解在玉米油中 ，浓度为20 mg ml-1 ，在37°C过夜。使用胰岛素注射器至少在钙成像前一周，将MRGPRD-CREERT2小鼠腹膜内注射为75 mg他莫昔芬的剂量 。
对于三叉神经元的荧光钙成像 ，成年动物（超过8周）的动物受到了三种实验方案之一 。实验制度A评估了机械和温度响应（图1和2以及扩展数据图1-5）。如前所述 ，用异氟烷和外科手术制备了动物，并通过外科手术制备用于三叉神经节的光学访问19 。如前所述 ，使用一系列手动涂抹涂料和手术钳夹紧的手动刷子机械刺激了脸颊的毛皮 。为了提高温度转移 ，使用棉布涂抹器将小鼠的脸颊用脱毛霜（Veet）处理不到300 s。施用眼睛药膏以防止对角膜和结膜损害，去除皮毛，用盐水至少将脸颊洗涤3次 ，并用kimwipes干燥 ，并将定制的5 mm2 peltier探针（TCS2; QST.lab）直接施加到皮肤上，以进行热刺激 。Peltier的应用没有诱导三叉神经元的长期活性 ，LTMR没有对加热反应（图1） ，排除了与探针机械刺激有关的主要混杂作用 。皮肤在30°C下进行基线未刺激的活性测量；37 、39 、42、45和50°C的温度刺激为4 s。
实验方案B评估了炎症后的机械敏化（图4和扩展数据图7）。基线机械刺激如实验性方面A.然后使用20-30μL，0.5 mM PGE2（Sigma-Aldrich）对三个位点诱导脸颊的炎症 。孵育10分钟后 ，确认炎症并重复机械刺激 。
实验方案C评估了炎症后的热敏化（图3和5以及扩展数据图5和6）。小鼠脸颊降压是在功能成像前一天进行的 。与实验方案相同 ，对皮肤进行了一系列的捏和热刺激 。为了评估一致性，在实验方案A和C之间比较了对常见刺激的反应（扩展数据图10）。
使用荧光钙成像确定L5和L6神经节中DRG神经元的功能活性 。将PGE2和LY344864注射为单个注入（上述浓度和浓度） ，中后爪 。机械刺激也被应用于足底表面 ，该表面保持在30°C，以进行未刺激的记录。对于MRGPRB4-TDT-2A-CRE小鼠 ，将腿的毛皮刺激为NP2B神经元选择性支配的毛皮4 。
如先前所述的3,58 ，使用定制的纤维荧光CERNA显微镜（Thorlabs）和PCO.PCO.PCO.PANDA 4.2 BI CMOS相机进行钙成像 。以5 Hz获取40-S录音发作。对于需要事后事后的每个实验，收集了红色荧光tagrfp图像，或者将三叉神经节用500μL的1 m kCl短暂地超过超级订阅 ，以激活并可视化所有表达GCAMP神经元的神经元 ，以提供一致性指导杆 。如先前所述，对体内图像进行对齐并处理3 。
如先前所述 ，生成了空间活动图和感兴趣区域（ROI）3。简而言之 ，通过重复的机械刺激引起的活性被认为是每个像素的标准偏差。通过减去平均荧光在刺激过程中平均荧光刺激之前，通过减去平均荧光来可视化热诱导的活性 。使用ImageJ中的“单元格魔杖”插件手动提取ROI 。在盲目的转录组信息的同时 ，将被彼此反应污染的重叠的细胞ROI排除在分析之外。GCAMP荧光的相对变化计算为每个细胞的ΔF/F（％） ，并通过使用Custom Matlab Script42减去围绕每个细胞的白菜形状区域的荧光来消除潜在的污染物信号和邻近细胞的潜在污染物信号 。通过将类别特异性掩膜叠加在同源刺激的活性图（用于热特异性和多聚峰细胞的热量；用于机械特异性细胞的刷子和捏合）的活性图来生成细胞类别特异性的活性图 。
体内成像和组织切片后三叉神经节的全部iSh如先前所述进行3，使用以下杂交链反应探针（分子仪器）的组合（分子仪器）：trpm8（genbank nm_134252; full长度）（NM_001205321;编码顺序） ，Calca（NM_007587;全长） ，TRPV1（NM_001001445;全长），TMEM233（NM_001101546; full thumep） ，MRGPRD（NM_203490; Full Rempus; Full Replue; full Repply; nM__00872626;（NM_009215;全长） ，MLC1（NM_133241;全长），TAGRFP-TVA，TDT和EGFP（检测GCAMP表达式）。整个载体神经节表面的二维背视图被带有10μm间隔的共聚焦Z堆栈的最大强度投影崩溃 ，以捕获神经节的凸表面 。
如先前所述 ，使用TAG1-TAGRFP/TVA动物中的TaGRFP阳性指南细胞或用直接应用于三叉神经节刺激的高K+刺激的表达GCAMP表达细胞的TAGRFP阳性指南细胞进行了整个安装图像与体内荧光图像的比较 。简而言之，使用turboreg插件和imagej/fiji中的自定义宏通过缩放旋转 ，将多通道的二维ISH图像与体内荧光进行了粗略对齐。然后 ，使用自定义的ImageJ宏手动将指南细胞与其体内荧光对应物进行手动匹配，该自定义imagej宏识别每个指南的坐标对 。使用这些坐标与OpenCV Library 3上的自定义Python脚本3 。使用探针在两轮中部分重叠的细胞集标记 ，将几轮ISH彼此对齐 ，以提供用于变形的指南。如前所述3，这种类型的图像对齐不会产生像素到像素匹配 ，而是准确地识别了响应功能的ISH阳性单元格（扩展数据图2） 。
手动分析细胞ROI（反应细胞） ，以使用诊断ISH Data3的每个基因的表达（阴性，弱或强）（扩展数据图2C） 。使用扩展数据中概述的规则和补充表3 ，将二进制表达模式解码为转录组细胞类 ，这也解释了转录组类命名命名10与其他分类方案如何相关。
来自DRG28的单细胞测序数据是从GEO系列GSE254789中获得的，并在Rstudio中用Seurat v.5分析。排除了少于800个表达基因或超过5％的线粒体转录本的细胞，并在主成分分析还原为30个组件后 ，使用规范相关分析整合使用数据集组合 。通过分析SNAP25 ，MBP，APOE ，QK ，PECAM1，SLC17A7和SLC17A6的表达 ，在UMAP中鉴定了神经元和非神经元细胞簇 。使用DoubleTfinder v.3鉴定了双线 ，并从数据集中删除了双重和非神经元细胞。将神经元重新归一化后，还原为40个主成分并重新整合 ，使用Louvain算法计算神经元簇 ，分辨率为0.2，并根据扩展数据中所示的基因鉴定/合并图2 。
对于行为实验 ，测试了成人C57BL/6 ，TRPV1-CRE :: AVIL-LSL-TENT和对照同窝仔的组 。DRG12（高级细胞诊断）的新鲜冷冻切片的rnascope用于检查帐篷重组的程度和选择性。如上所述，将后爪的脸颊或足底表面注入PGE2，LY344864或磷酸盐缓冲盐水（PBS） 。在行为测试之前的几天中 ，将小鼠（雄性和女性；超过8周龄）习惯于至少两次 。当小鼠用于多个实验时 ，将它们至少7天恢复在测试之间。实验者对动物的基因型视而不见 。
对于图5A，E所示的数据 ，使用von Frey刺激在注射PGE2或LY344864后2小时 ，使用von Frey刺激确定了机械阈值（50％撤回阈值） 。实验者对小鼠的基因型视而不见。对于图5F，使用冯·弗雷（Von Frey）刺激在基线时通过标准的上下方法 ，在腹膜内注射后15-30分钟的单个时间点（二甲基硫氧化二甲基硫酸氧化物）或Salvinorin b（Hello Bio; Hello Bio; Hello bl -g kg kg kg kg kg kg kg kg kg kg kg kg kg）时 ，使用冯·弗雷刺激（五个试验）的机械阈值（60％的戒断阈值；在五项试验中的三个反应） 。（如上所述） 。实验者对注射化合物视而不见。对小鼠进行了两次测试（相对的爪子；相距6天），在第一个测试中有四个接收萨尔维诺蛋白B ，而在第二轮中进行了其他三个。小鼠向这两组分配是伪随机 。通过刺激C57BL/6小鼠 ，在同一行为设备中确定刷痛 。如图9a所示，使用油漆刷（7950-5回合； Kingart）在每分钟前和PAW注射后10-30分钟输送20刷刷子。响应被计为从刺激中提取的任何退出 。如图9b所示 ，在基线和爪子注射PBS或LY344864后的每个时间点都输送了带有绒毛棉签的单个刷子 。对疼痛状行为（重复或延长的举重和守卫）以及对刷牙的简短反应进行了评分。实验者对注入的化合物视而不见 。因此 ，将小鼠随机分配给组 。
注射500 µM PGE2（在20 µL PBS中）或单独进入后爪或脸颊后，自发性疼痛行为被蒙蔽了基因型和/或所使用的化合物。在注射后爪的小鼠中，对注射的爪子的舔评分15分钟 ，并定量10分钟 ，从注射后5分钟开始，以匹配炎症的发育37 。对于脸颊注射盲 ，将动物随机分配到组 。注射后 ，将小鼠放在被镜子包围的圆柱形有机玻璃腔中。注射后的头15分钟，对所有面向定向的行为和无活跃的周期都大于1 s ，并在用于爪子的相同10分钟的时间内进行量化 。尽管不活动可能代表类似冻结的行为（补充视频3） ，但也可能代表坐着或睡觉 。注射了表现出相当不活跃的PBS的单个小鼠似乎没有进入冻结状态，而大多数PGE2注射的小鼠都没有进入。为了避免在视频的分辨率分数中得分时的判断错误 ，在没有试图评估鼠标是否处于困境的情况下分析了不活动性。右脸颊在行为记录前两天部分降低 ，以帮助注射 。
补充表1列出了每个转录组类测试的动物和响应细胞的数量 。使用Python v.3.8，Pandas v.1.1.3 ，Numpy V.1.19.2和Scipy v.1.5.2进行了所有定量和统计分析。
自发活性被检测为ΔF/F轨迹中的峰值 ，最小突出性为4％ΔF/F，最小绝对峰为4％ΔF/F，使用Scipy Find_peaks功能 ，最小的绝对峰为4％ΔF/f ，最小间隔间隔为0.6 s 。事件的幅度计算为峰高与其先前最小值之间的差异 。通过求和事件振幅，将脸颊或爪子保持在30°C（三叉神经元为105 s ，对于DRG为40 s）时 ，可以在多个时窗上量化自发活动。
温度诱导的响应被确定为峰值，最小突出性为5％ΔF/f ，最小间隔间隔为0.6 s ，在温度刺激窗口期间发作 。响应的末端定义为信号降至10％峰高的时间点 。从响应的开始到结束的ΔF/F曲线下的面积用于量化对温度的反应。如果AUC超过了定义的最小值，则认为一个细胞对温度刺激的反应（对应于4-S刺激窗口的平均值为3.5％ΔF/F） 。如果细胞在刺激施用窗口中其峰值幅度超过15％ΔF/F ，则一个细胞具有机械敏感性 。如果机械刺激和温度刺激之间的比率小于5：1 ，并且大于1：5，则细胞为多聚座。
根据分析中包含的细胞的选择 ，对给定刺激的反应的量化有所不同 。例如 ，细胞可能具有自发活性，但对脸颊的机械或热刺激没有反应 。为了保持一致性并允许在数字之间进行比较，我们报告了脸颊引起神经元的响应幅度（和数量） ，即对响应于脸颊上施加的任何刺激的细胞。
为了区分化学诱导后的刷子反应与自发活性 ，在施加刺激的1 s窗口内的个体锁定的刷子反应被确定为峰值，最小突出性为5％ΔF/f/f/f/f ，最小绝对峰高为20％ΔF/f。善意的刷子细胞被鉴定为对至少50％的刷子响应的细胞 ，这些细胞在很大程度上覆盖了脸颊的斑点，但并非完全重叠 。
如先前所述 ，通过将给定类别的响应细胞数除以用该类别的ISH探针测试的响应细胞的数量来计算对功能细胞类别的转录组细胞类的百分比 。因为并非所有类别都在所有动物中都进行了测试 ，所以总比例不一定总计100％。为了在堆叠的条形图中显示比例，在这些图中将百分比进一步标准化至100％ 。
使用两尾配对学生的t检验分析了PGE2注射的效果 。使用一尾韦尔奇的t检验分析了通过TRPV1敲除对热反应的衰减（允许不同条件之间的不平等差异）。使用两尾韦尔奇的t检验分析了TRPV1敲除对自发活动的影响 。
在研究几个转录组类别时 ，将Holm -šidák校正应用于所有统计检验 ，以调整多次比较 。一尾Wilcoxon签名的秩检验用于von frey阈值和刷子诱导的行为，在将异常尼亚诱导后的时间点与配对的基线值进行比较时。在扩展的数据图9b中 ，在注射后跨时间点汇总了数据 ，并通过卡方检验进行了比较 。行为组之间的所有其他比较都使用了Mann-Whitney U检验 。补充表2中提供了详细的统计信息。
有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得 。
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文章不错《热增敏和炎症性疼痛的分布式编码逻辑》内容很有帮助