没有使用统计方法来预先确定样本量 。实验不是随机的 ，研究人员在实验和结果评估过程中并未对分配视而不见。 　　根据知情同意，招募了56名健康志愿者进行该研究
。这项研究得到了斯坦福大学机构审查委员会（IRB 8269）的批准
，并根据《联邦法规》完全遵守良好的临床实践。所有参与者的人口统计在扩展数据表1中提供 。 　　SARS-COV-2尖峰蛋白购自中国生物学
。在PBS中将96杆高结合板用100 ng的尖峰蛋白涂覆，浓度为2μgml-1。第二天早晨 ，将板洗一次
，在室温下含有0.1％Tween 20（PBST）的PBS中用3％的非脂肪牛奶阻塞 。将在含有PBST的1％非脂肪牛奶中连续稀释的血清样品添加到板上，并在37°C下孵育1小时
。将板用PBST ，辣根过氧化物酶偶联的山羊抗孔基IgG（γ-链特异性
，α诊断，1：4,000稀释）洗涤3× ，在含有1％非脂肪牛奶的PBS-T中洗涤
，并在室温下添加1％的非脂肪牛奶。在添加3,3'，5,5'-四甲基苯胺（TMB）底物溶液之前 ，用PBST洗涤井3× 。12分钟后
，通过添加0.16 M硫酸或1 m盐酸来停止反应
。用Biorad Microplate读取器测量450纳米处的光密度。 　　如先前所述，用真实的SARS-COV-2病毒（来自2019-NCOV/USA_WA1/2020菌株）的真实SARS-COV-2病毒（传染性克隆SARS-COV-2）进行了 。血清样品在无重复的井中无血清Dulbecco修饰的Eagle的培养基（DMEM）中连续稀释（三倍） ，并在37°C下与100-200焦点形成的单元感染型克隆SARS-COV-2-MNG病毒32
。将抗体 - 病毒混合物添加到Vero E6细胞（C1008，ATCC
，NO。CRL-1586）单层中播种在96孔停电板中，并在37°C下孵育1小时 。孵育后 ，将接种物除去并用含有0.85％甲基纤维素的预热的完整DMEM代替。将板在37°C下孵育24小时
。24小时后
，除去甲基纤维素覆盖层，用PBS洗涤两次细胞 ，并在室温下用2％多聚甲醛在PBS中固定30分钟。固定后
，将板用PBS洗涤两次，并在荧光ELISPOT读取器（CTL Immunospot S6通用分析仪）上可视化焦点 ，并使用Viridot33进行枚举 。计算中和滴度如下：1-（在血清和焦点存在下
，在相应的血清样品最高稀释下的平均焦点比例）
。在不同时间进行的两个独立测定中测试了每个标本。使用四参数非线性回归在GraphPad Prism 8.4.3中，将焦点还原中和滴定（FRNT） - Mneongreen 50％（MNG50）滴度插值 。以低于检测极限的FRNT -MNG50值的样品在10中绘制
。对于这些样品 ，该值用于折叠减少计算。 　　源自2019-NCOV/USA_WA1/2020菌株的野生型感染性克隆SARS-COV-2在Vero E6细胞（ATCC）和测序32中传播 。32
。如前所述34分离出B.1.351变体。我们的实验室斑块在VEROE6细胞上溶解了病毒
，然后在Vero E6细胞上进行一轮繁殖（感染的多样性为0.05），以产生工作库存并进行测序 。病毒滴度是通过对Vero E6细胞的焦点形成测定来确定的
。将病毒量存储在-80°C下 ，直到使用为止。 　　如野生型FRNT分析所述进行FRNT测定 。使用野生型对照同时执行每个变体的测定法。使用DMEM在重复液中以1:10的最初稀释度为60μl，在8个系列稀释液中以3倍的稀释稀释样品
。将串行稀释的样品与相等体积的SARS-COV-2（野生型或变体）（每孔100-200焦点）在37°C下孵育1小时
，在一个圆底的96孔培养板中。然后将抗体 - 病毒混合物添加到Vero细胞中，并在37°C下孵育1小时 。孵育后 ，除去抗体 - 病毒混合物
，并将100μl预热的0.85％叠加层添加到每个孔中
。将板在37°C下孵育24小时。24小时后，除去甲基纤维素叠加层 ，并用PBS洗涤细胞3次 。然后用PBS（电子显微镜科学）中用2％多聚甲醛固定细胞30分钟
。固定后
，将板用PBS洗涤两次，并将100μl透化缓冲液（0.1％牛血清白蛋白（BSA） ，PBS中的Saponin）洗涤20分钟。将细胞与直接与生物素（CR3022-Biotin）直接偶联的抗SARS-COV尖峰一抗在室温下孵育1小时 。接下来
，将细胞在PBS中洗涤3次，并在室温下加入Avidin -HRP 1小时 ，然后在PBS中进行3次洗涤
。使用TrueBlue HRP底物（KPL
，第5510-0050号）可视化焦点，并在ELISPOT读取器（CTL）上成像。 　　如前所述35 ，使用细胞内细胞因子染色测定法测量了抗原特异性T细胞反应 。在完整的RPMI中，将实时冷冻的PBMC恢复
，计数和重悬于每毫升200万活细胞的密度（添加了10％FBS和抗生素的RPMI）中
。将细胞在二氧化碳孵化器中在37°C下休息过夜。第二天早晨，再次计数细胞 ，在完整的rpmi中以每毫升1500万个细胞的密度重悬
，将含有150万个细胞的100μl细胞悬浮液添加到每个孔中，将96孔圆孔的组织培养板的每个孔中的每个孔添加到每个孔中 。在1μgml-1的抗CD28（克隆CD28.2 ，BD Biosciences）和Anti-CD49D（clone-CD49D（clone 9f10
，clone 9f10，bdiccr3）中 ，每个样品用两种疾病进行了两种疾病
，无刺激和肽池跨越1μgml-1的峰值蛋白。使用商业供应商Genscript将肽定制为90％纯度
。所有样品均包含0.5％V/V DMSO，每孔的总体积为200μl。在添加10μgml-1 brefeldin-A之前 ，将样品在37°C的CO2孵化器中孵育2小时 。将细胞再孵育4小时
。用PBS洗涤细胞
，并用僵尸紫外线固定可活力染料（Biolegend）染色。在添加表面抗体鸡尾酒之前，用含有5％FC的PBS洗涤细胞 。将细胞在4°C下以100μl的体积染色20分钟
。随后 ，将细胞洗涤，固定并用细胞膜/细胞处理缓冲液（BD Biosciences）透化20分钟。将透明的细胞用细胞内细胞因子染色抗体染色20分钟
，在室温下，1×PERM/WASH缓冲液（BD Biosciences） 。然后 ，使用BD交响乐流式细胞仪和相关的BD FACS Diva软件在获取前用PERM/WASH缓冲液和一次染色缓冲液一起洗涤细胞两次
。使用FlowJo软件V.10分析了所有流式细胞仪数据 （Treestar）。 　　我们使用了现有的基于珠的自身抗原阵列
，以及基于最近Covid-19的研究的扩展含量的细胞因子阵列16 。所有抗原，供应商和目录数的完整列表可以在补充表2 ，3中找到
。“ Covid-19自动抗原阵列”包括55种与结缔组织疾病相关的商业蛋白抗原（补充表2）。“ COVID-19细胞因子阵列 ”包括58种蛋白质
，包括细胞因子，趋化因子 ，生长因子
，急性相蛋白和细胞表面蛋白（补充表3） 。如前所述16,36,37，抗原与羧化磁珠（Magplex-C ，Luminex）偶联
，使每种抗原与具有独特条形码的珠相连。原型的人血浆样品是从具有已知反应性模式的自身免疫性疾病的参与者中得出的，或从斯坦福风湿病诊所获得 ，以前是从斯坦福风湿病诊所获得的，并以前是表征的16
。使用自身免疫性多内分泌综合征（APS1）
，肺肺泡蛋白质病（PAP）或非典型分枝杆菌感染（AMI）的个体的血清样品验证抗细菌代因子抗体16。在补充1％（w/v）BSA之间的0.05％PBS中，以1：100稀释的稀释度测试血清样品 。使用R-PhycoeryThrin（R-PE）共轭Fcγ特异性山羊抗人IgG F（AB'）2片段（Jackson Immunoresearch）检测到结合抗体 ，然后使用FlexMAP3D仪器（Luminex）进行分析
。计数每个珠子标识符至少100个事件
，并重复研究样品。结合事件显示为平均荧光强度（MFI） 。所有数据分析和统计数据均使用R和各种R软件包进行38
。对于归一化，从抗原偶联的珠标识符的平均MFI值中减去“裸珠”标识符的平均MFI值。 　　将收集在柠檬酸钠细胞制备管（CPT）中的新鲜全血样品固定在蛋白质组学稳定器缓冲液中 。将270μl的全血样品与420μl的智能缓冲液混合 ，在室温下混合和孵育12分钟
，并在-80°C冷冻直至加工
。固定的冷冻细胞通过在CSM中温和重悬于（补充了2％BSA，2 mM EDTA和0.1％叠氮化钠）中 ，用CSM洗涤两次并计数。使用Cell-IDTM 20-Plex PD条形码试剂盒（Fluidigigm）对细胞进行通透并进行条形码 。将样品用CSM洗涤
，合并并计数
。在室温下用表面抗体鸡尾酒染色30分钟，其中包含一个包含所有条形码PBMC样品的合并样品。然后用4％新鲜制备的多聚甲醛（Alfa aesar）固定样品在室温下用CSM洗涤10分钟 ，用100％甲醇（Sigma）透化
，并保持-80°C过夜 。第二天，将细胞用CSM洗涤 ，在室温下用预先特剂的细胞内抗体鸡尾酒进行计数和染色30分钟。然后用CSM洗涤细胞，用含有虹膜的DNA介导剂（流体化）染色
，用Milliq水洗涤，并在补充1×EQ EQ四元素校准珠（Fluidigigm）的Milliq水中以Helios质量细胞仪（流体）的形式获得
。 　　在数据导出之前 ，FCS文件对珠归一致。处理该数据以在Flowjo软件v.10（Treestar）中进行脱编码 。简而言之
，使用FlowJo的DNA含量和事件长度，使用珠归一化文件来栅极单元格
。使用HELIOS软件版本7.0.5189对单个单元进行重新介绍并进行了删除。使用FlowJo或R版本1.2.1335分析了Debarced的样品 ，以进行分析和可视化 。 　　使用先前描述的基于R的管道39对磷酸化数据进行了高维分析
。简而言之
，将RAW .FCS文件导入R，并使用Arcsinh使用Arcsinh使用ARCSINH使用5。可视化进行了标记强度归一化 。为可视化 ，应用了另一个转换
，以将所有值的表达式缩放在0和1之间的表达式，以百分位数为边界
。使用Flowsom和Consensususususustlustlus从每个样品中随机选择的4,000个细胞进行细胞聚类。转化的基质用作流量的输入 ，将细胞分离为20个簇 。为了获得可重现的结果（避免随机开始）
，为每个聚类设置了种子
。在谱系标记表达式的基础上手动注释了20个簇，并合并以产生最终簇。使用UMAP在二维空间中可视化簇 。使用图块函数确定细胞群体的丰度。同时 ，手动门控数据以识别25种在UMAP中没有很好区分并用于所有定量目的的免疫细胞亚群
。 　　根据制造商的说明，我们使用Olink多重接近扩展分析（Olink蛋白质组学：www.olink.com）测量了血浆中的细胞因子。PEA是一种双识别免疫测定法
，其中两种用独特的DNA寡核苷酸标记的匹配抗体同时结合溶液中的靶蛋白 。这将两种抗体置于接近度，使其DNA寡核苷酸杂交 ，作为DNA聚合酶依赖性扩展步骤的模板
。这会产生双链的DNA“条形码
”
，该DNA“条形码”对于特定抗原是独特的，并且与靶蛋白的初始浓度成正比。杂交和延伸后立即进行PCR扩增 ，然后使用Fluidigm Biomark HD System（Fluidigigm）通过微流体QPCR定量扩增子 。 　　RNA是从储存在Yerkes基因组核心Paxgene管中的血液样本中分离出来的（http://www.yerkes.emory.edu/nhp_genomics_core/）
。使用Agilent 4200贴纸和浓度通过RNA HS分析评估RNA质量。在文库制备之前
，用快速选择的球蛋白试剂（QIAGEN）阻止了血液RNA中的球蛋白转录本 。使用Clontech Smart-Seq V.4超低输入RNA试剂盒（Takara Bio）与Nexteraxt DNA库制剂制备套件结合使用，以附加双索引适配器序列（Illumina）来制备库
。图书馆通过毛细管电泳在Agilent的4200次贴纸上通过等摩尔浓度汇总 ，并在100SR的Illumina Novaseq6000上进行测序
，每样品中的读数为25-300万。 　　过滤基因级计数以删除中位表达的人数小于32 。在基线样品上进行主成分分析（PCA）以识别异常值
。三个样本超过1.5 s.d。远离平均值，并从分析中删除 。用EDASEQ40生成相对的log表达（RLE）图；从分析中除去具有RLE> 0.6的样品。使用DESEQ241（V.1.26.0）进行差异基因分析 ，将参与者标识符纳入模型中以说明参与性偏置
。DESEQ2使用BTMS18对GSEA报告了WALD统计量对基因进行排名。通过将感兴趣当天的DESEQ2归一化表达数据除以第0天（对于第1天
，第2天和第7天）或第21天（对于第22 、28和42天）来计算每个参与者的变化 。为了获得与年龄相关的BTM，将每个参与者的年龄与第22天的每一参与者倍数变化进行了比较
。由此产生的相关值通过t统计量对其进行排名 ，并用GSEA进行分析。采用相同的方法获得BTM与IFNγ相关 。通过在5个干扰素BTMS中存在的独特基因集（M75，M111.1
，M150，M127和M68）中的每日平均折叠变化来计算IFN分数 ，该基因的平均折叠变化与第22天IFNγ折叠变化显着相关
。同样
，使用M16中存在的基因的第22天的平均折叠变化计算了每一参与者M16基因评分。 　　通过补充表4中的登录标识符从基因表达综合（GEO）获得数据集 。将属于同一试验的所有样品的CEL文件分组并通过RMA42在Bioconductor中进行了归一化，其中包括全局背景调整和分数归一化
。删除了映射到多个基因的探针 ，并通过选择每个受试者中平均表达最高的均值表达的探针
，将其余的探针折叠至每个数据集中的基因水平。唯一的非微阵列数据集是GSE97590，为此使用了GEO的归一化计数矩阵 。除去所有数据集中的基因
。然后 ，针对所有基因计算每个受试者的基线归一化log2转换的倍数变化。然后
，使用每个数据集对每个数据集的基因列表进行识别GSEA，以t统计量从双面学生的t检验中排名的每个数据集在疫苗接种后log2转换后的折叠变化上排名 。 　　如前所述 ，对PBMC的CITE-seq分析进行了分析4。简而言之
，将活的冷冻PBMC解冻，并用补充10％FBS和20μgml -1 DNase I（Sigma Aldrich）的RPMI洗涤2倍
。根据制造商的说明 ，使用Dynabeads DC富集试剂盒（Invitrogen，11308d）富含树突状细胞
，其中3-40万个PBMC作为起始材料。将富集的细胞与总PBMC以1：2的比例混合，混合细胞用总SSEQ-A抗体的鸡尾酒染色的PBS中 ，补充了5％FBS
，2 mM EDTA和5 mg ML-1人类IgG，并用5％FBS和2 mMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMMM ，（Miltenyi）和0.5UμL -1 RNase抑制剂（Sigma Aldrich） 。每个实验的目标约为9,000个细胞
。 　　将细胞与逆转录混合混合混合
，并使用10倍铬系统与铬凝胶珠一起进行分割，以使用3'V3化学（10x基因组学）在乳液（GEM）中产生凝胶珠（GEM）。逆转录反应是在C1000 Touch PCR仪器（Biorad）中进行的 。通过GEM后转录清理从宝石中提取条形码cDNA ，并放大12个周期
。放大之前
，将cDNA扩增混合物用ADT添加剂底漆（0.2μm库存）加入以扩增抗体条形码。放大cDNA进行0.6×SPRI珠的清理（Beckman，B23318） 。从上清液中回收了放大的抗体条形码 ，并按照制造商的指示进行处理以生成TotalSeq-A库（Biolegend
，具有10倍单细胞3'试剂盒的TotalSeq-A抗体v.3 3.1方案）
。根据制造商的协议，将其余的放大cDNA进行酶促碎片 ，末端修复，尾巴连接和10倍特定的样品索引。使用生物分析仪（Agilent）分析对库进行定量 。 　　使用推荐的测序读取长度为28 bp（读取1）
，8 bp（i7indexRead）和91 bp（读取2）（读取2），将10倍基因组学SCRNA-seq和TotalSeq-A库在Illumina Hiseq 4000上进行了汇总并在Illumina Hiseq 4000上进行了测序
。CellRanger v.3.1.0（10x基因组）用于消除原始原始测序数据 ，并针对10X Genomics GRCH38参考v.3.0.0量化转录物水平。 　　在Novaseq S4上汇总并测序了10X基因组学SCRNA-SEQ和TotalSeq-A库 。细胞游侠v.3.1.0（10倍基因组学）用于针对10X基因组学GRCH38参考（v.3.0.0。）的转录水平（v.3.0.0
。）的原始计数数据被过滤到用线粒体RNA分数大于每个细胞中的总RNA计数的20％的细胞
，每个细胞中的20％，少于100个独特的特征和少于200次读取的细胞。过滤的计数矩阵用于创建Seurat43（v.3.1.4）对象 。过滤后的读数计数缩放为10,000 ，并进行对数转换
。使用中心日志归一化
，每个功能将抗体衍生的TAG矩阵进行标准化。用SCDS44（v.1.2.0）识别双线;除去顶十分位数的双重评分的细胞被去除 。使用默认的Seurat管道处理其余的242,479个单元
。具体而言，最可变性的2,000个RNA功能用于在对数转换计数上执行PCA。前25个主要组件用于进一步的下游分析 ，包括聚类和UMAP预测 。用seurat snn图构造识别簇
，然后在结果图上以0.2的分辨率在结果图上进行检测，得出18个簇
。用MAST45（V.1.12.0）计算跨时间点的差异表达 ，以说明参与者间的异质性。 　　假设曲线是通过每天在每个参与者中的所有细胞中平均表达来构建的 。当计算折叠在跨时间点变化时
，将每个参与者的伪库曲线与基线概况进行比较，以减少参与者特定的偏见
。为了计算去除群集的效果 ，迭代删除了所有时间点的每个簇，并重新计算了折叠变化。 　　C8分别被重新安装并被UMAP和Louvain社区检测重新聚集 。从每个亚集群到其他簇的距离被计算为每个集群所有基因平均表达之间的欧几里得距离。在原始数据空间中计算了欧几里得距离
。具体而言
，使用所有基因作为对R的输入进行计算的欧几里得距离。DIST函数计算欧几里得距离d（x，y）为： 　　其中x是簇A中的基因I的值 ，y是集群B中基因I的值 。 　　用于所有热图的复杂Heatmap（v.2.2.0）
。所有分析均在R中进行（v.3.6.3）。 　　参考的数据 。从https://covid19cellatlas.org/下载了23个作为.h5ad文件
，并转换为R中的seurat对象
。所得的seurat对象和疫苗数据均以亚集为子集，仅包括髓样细胞并使用和谐组合。同样 ，参考文献中的数据 。使用Harmonony24与疫苗研究中的髓样细胞进行了4
。参考的淋巴样细胞。集成后4次去除 。对于这两种整合
，UMAP都是在和谐校正的嵌入中进行的
。 　　按照制造商的说明，使用未接触的人类单核细胞试剂盒（Invitrogen ，Cat。No 。11350d）对健康的PBMC产生负富集。简而言之
，用抗体鸡尾酒在4°C染色了20分钟，将5000万个实时PBMC染色
。将细胞洗涤并与0.5 mL的预混合dynabeads混合。将样品在4°C下在Hulamixer中孵育15分钟 。将试管放在磁铁上 ，并使用移液器将含有纯化的CD14+单核细胞的未结合分数吸入
。彻底洗涤纯化的单核细胞
，并以每毫升500万密度重悬于刺激。单核细胞的纯度通过流式细胞仪估计，在所有样品中均超过95％ 。 　　在100μl完全rpmi中 ，在96孔圆底板中刺激单核细胞（50万），持续24小时
。如图7J所示
，在100μl完整的rpmi中添加了不同浓度的IFNγ。第0、1或22天的等离子体样品来自参与者2055，分别<10 pg ml-1 ，<10 pg ml-1和300 pg ml-1IFNγ
，如酶联免疫吸附测定法所测量 。将50μl的血浆样品添加到适当的井中
。添加了五十μl的完整培养基，以使体积总计为0.2 mL。将板在37°C ，5％CO2细胞培养孵化器中孵育 。 　　根据制造商的协议
，使用Aurum Total RNA Minikit（Biorad，Cat
。7326820）分离RNA。使用iScript高级cDNA合成试剂盒（Biorad ，Cat 。No。1725038）合成cDNA
，使用20μl的150 ng总RNA
。通过添加80μl无菌核酸酶的水和5μl的cDNA用于PCR反应，将cDNA样品稀释5倍。使用Biorad Prime PCR试剂和SYBR绿色化学（Soadvanced Universal Sybr Green Supermix（Cat 。No
。1725272））在Biorad CFX384实时PCR中进行PCR。 　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然研究报告摘要中获得 。