参与者的性别 ，年龄和种族及其在急性MIS-C期间的临床表现细节在扩展数据表1和补充数据9-11和15中报道
，以及补充数据中的对照8 。关于MIS-C患者性别和对照组的性别的信息
。患者和对照组是在柏林（德国），里昂（法国） ，安卡拉（土耳其）
，圣地亚哥（智利）和那不勒斯（意大利）招募的。This study was approved by the local institutional review boards (IRBs) of the Charité (Pa-COVID-19 and EA2/178/22) (Berlin, Germany), the Comité de Protection des Personnes Sud Méditerranée I (Marseille, France) (ID-RCB: 2020-A01102-37) for the French patients and by the ethical committee of Hospices civils de Lyon (Lyon University Hospitals,法国）不 。Hacettepe University Ethical委员会（2021/09-45，土耳其Ankara ，土耳其Ankara）的23_5231针对来自土耳其的MIS-C患者，Mass-Mass Brigham IRB 2020P000955的患者
，来自波士顿的患者和对照组，由伦理学委员会以及NIH的NIH 2020（NIH/NIH）的NIH/NIH;以及克里尼卡·阿勒马纳（ClínicaAlemana）大学的道德委员会（IRB ID 202098） ，供智利的样品
。参与本研究的患者的法律代表提供书面和知情同意。 　　从柏林慈善大学招募了39名患者
，柏林柏林小儿呼吸医学，免疫学和重症监护医学系 ，在里昂招募了49例患者
，在土耳其，土耳其 ，两名患者
，在意大利的那不勒斯，2名患者 ，在圣地亚哥
，奇利特，14名患者 。根据世界卫生组织60的定义 ，疾病控制与预防中心61和皇家儿科和儿童健康学院的定义，顾问小儿风湿病学家在所有患者中都诊断了MIS-C。62
。在MIS-C的急性阶段和门诊诊所的随访期间采集血液样本。本研究中包含的儿科对照在纳入六周前的SARS-COV-2 PCR结果阳性 。此外
，来自36名健康儿童的样本，57名无症状或轻度SARS-COV-2感染的儿童以及39名中度和2名患有急性和随访期间患有SARS-COV-2的严重感染的儿童 ，有11名儿童6 WPI用作对照
。根据WHO临床管理指南定义疾病的严重程度60。 　　如前所述4
，将外周血吸入EDTA收集管和SST管中 。通过Ficoll-Paque Plus（Cytiva）密度梯度在室温下从外周血中分离出PBMC
。细胞直接用于分析，或在热灭活的胎牛血清（FCS; Corning ，35-079-CV）中以10％V/V二甲基硫氧化二甲基硫氧化物的热量储存。分析之前
，将血清样品储存在-80°C下 。 　　根据制造商的协议，使用了基于珠的多重细胞因子阵列（细胞因子/趋化因子/生长因子45-plex人Procartaplex面板 ，Thermofisher Scientific）
。对于TGFβ1测量
，使用1 N HCL将TGFβ1转化为生物活性形式，然后用1.2 N NaOH进行中和。如先前所述4 ，使用了人类TGFβ1单纯胶囊试剂盒（Thermofisher Scientific） 。为了使不同运行之间的数据归一化
，每次运行重复测量4至16个样本
。平均倍数变化差异用于使数据归一化。定量的特异性下限在图中指示，并在补充数据16中列出 。 　　使用人类PAN T细胞分离试剂盒（Miltenyi Biotec）从PBMC中分离T细胞 ，并在Texmacs培养基（Miltenyi Biotec）中每孔接种1-2×106细胞。plenti-cmv-blast-dntgfbr2-ha是G.-p的礼物
。dotto（addgene质粒＃130888; http://n2t.net/addgene:130888; rrid：addgene_130888）63。使用Lipofectamine（Invitrogen）（DNA：Lipofectamine）在2×105 HEK293T细胞中过表达质粒（1.6 µg） 。作为对照，使用了具有Blasticidin选择标记的非表达载体
。转染后六个小时
，将细胞与10 µg ml -1 blasticitidin（Thermofisher）孵育18-48小时，以呈阳性转染细胞的阳性选择。T细胞和转染的HEK293T细胞在一夜之间与MIS-C患者的10％V/V血清孵育30分钟之前 ，将血清饥饿 。对于T细胞作为对照
，将患者的血清与针对TGFβ1，TGFβ2和TGFβ3的抗体预孵育10分钟
。30分钟后收集细胞 ，并使用含有0.5％V/V NP40（Sigma）
，150 mM NaCl，50 mM TrishCl的缓冲液 ，完整的蛋白酶抑制剂（Roche）和Phosstop磷酸酶抑制剂（Roche）（Roche）。根据制造商的协议
，通过BCA（热科学）（热科学）（热科学）（热科学）定量蛋白质浓度，并在简单的12–2330 kDa分离板（Bio-Techne）上加载3 µg 。用于检测抗体后的SMAD2或SMAD3以及磷酸化的Smad2或Smad3：Smad2/3（D7G7）XP兔兔单克隆抗体8685和磷酸smad2（Ser465/467）/smad3（Ser423/425）（Ser465/467）（Ser465/467）（ser465/467）（d227f4）ravbit monocyanal rabyan;两个细胞信号传导）
。作为负载对照兔抗β-微管蛋白（NB600-936; 1：100; Novus生物学）。抗兔二级HRP抗体（042-206; Bio-Techne;提供作为制造商的库存稀释）用作二级抗体 。样品是在WES仪器上获取的 （蛋白质简单；生物技术）和数据使用Compass for SW软件（Bio-Techne;蛋白质简单版本3.1.7）分析
。信号的强度用于量化磷酸化的SMAD2/3的相对丰度 ，并标准化为总SMAD2/3信号。 　　从11例MIS-C患者和4例未发展MIS-C的患者的4例患者中冷冻PBMC在RPMI 1640（GIBCO 61870-044）中解冻
，具有20％V/V/V fcs（FCS； Corning； Corning，35-079-CV） 。将细胞在含有1％W/V BSA（PAN Biotech P06-1391500） ，2 mM EDTA（Invitrogen）和2 µg ML-1肌动蛋白D（Sigma-Aldrich）的PBS（Th。Geyer）中洗涤一次
。将细胞与人类FCR阻断试剂（1:50; Miltenyi Biotec）孵育，并使用4个总4个抗人类主题标签中的1个（C0251 C0252
，C0252，C0253或C0254）（1：250CD14 PERCP-CY5.5（1:50 ，克隆QA18A22
，biolgend），CD38 APC（1:25 ，克隆Hit2
，Biolegend），HLA-DR APC-VIO770（1：1：1：100 ，克隆AC122
，Miltenyi Biotec），Miltenyi Biotec） ，Miltenyi Biotec）
，CD19 V500（CD19 V500（1：1：1：200，200 hib） ，BD27，BD27
，BD27，BD27 ，BD27
，BD27，（1：100 ，克隆M-T271
，Biolegend）在4°C下30分钟。在对BD ARIAII（BD Biosciences）进行分类之前，添加了DAPI（Sigma-Aldrich ，0.1 µg ML-1） 。 　　活化的T细胞被鉴定为DAPI-CD14-CD19-CD3+CD38+HLA-DRHI
，记忆B细胞被鉴定为DAPI-CD14-CD3-CD3-CD19+CD27+（和CD38HI）的daPi-CD19+CD38Hi（plasmablasts），而单细胞为DAPI-CD14+（CD38HI） ，并鉴定出214+（24+）
。 　　为了鉴定对活化细胞的甲基丙酮酮和受感染流感患者的活化细胞的影响
，对MA900多施加细胞分系师（Sony Biotechnology）进行了分类。对谱系-HLA-DRHI细胞而不是静脉结构（鉴定为DAPI-CD14-CD19-CD3-HLA-DRHI）（扩展数据图3B和5A） 。For sorting of B cells and plasmablasts and analysing TCRVβ21.3 frequencies on T cells, frozen cells were prepared for sorting as mentioned above and stained with CD3 FITC (1:100, clone UCHT1, in house), CD27 PE (1:100, clone M-T271, BioLegend), HLA-DR PerCP-Cy5.5 (1:50, clone L243,Biolegend），CD21 PE-VIO770（1:75 ，克隆HB5，Miltenyi Biotec）
，CD14 Vioblue（1：200，克隆Tük4 ，Miltenyi Biotec）
，Miltenyi Biotec）或CD14 Alexafluor700（1：500，CLONE TM1 ，CLONE TM1
，CD19BV5510，HHOME） ，CD19BV5510
，HHIB 1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：500CD38 APC（1:25，克隆HIT2 ，Biolegend）
，TCRVβ21.3APC-VIO770（1：100，克隆Rea894 ，Miltenyi Biotec）
。直接在对DAPI（Sigma-Aldrich，0.1 µg ML-1）进行分类之前。将细胞对MA900多施加细胞分选蛋白（Sony Biotechnology）或Cytek Aurora（Cytek Biosciences）进行分类 。B细胞被鉴定为DAPI -CD14 -CD3 -CD19+CD21+
，而Plasmablasts则为DAPI -CD14 -CD3 -CD19+CD27+CD27+CD38HI（扩展数据图9A）
。T细胞被鉴定为DAPI-CD14-CD19-CD3+，活化的T细胞被鉴定为DAPI-CD14-CD19-CD19-CD3+CD38+CD38+HLA-DRHI（扩展数据图7L ，m）
，使用麦克斯克（Macsquant）分析仪16（MiLtenyiii exeed Biotec）进行计数，并用麦克斯克（MiLtenyi）进行了分类 ，并进行了进程。 　　如前所述4,30进行了单细胞RNA库的结构和测序 。简而言之
，根据制造商的协议，使用了用于细胞表面蛋白（CITE）映射的特征条形蛋白（CITE）映射（CITE）映射（CITE）映射的特征条形码技术的Next Gem单细胞5'试剂盒V2（双指数）
。最终的Cite-seq库是在用双索引盒TN集合A（10倍基因组学）的索引PCR后生成的 ，最终GEX
，TCR和B细胞受体（BCR）库是在碎片，适配器连接和最终索引PCR之后生成的 ，具有双索引套件TT套件tt a（10x GENOMICS）。使用Quibit HS DNA测定试剂盒（Life Technologies）对文库进行定量
，并使用HS NGS片段（1-6,000 bp）试剂盒（Agilent）确定片段大小 。 　　使用P3试剂盒（100个循环）（Illumina）在NextSeq2000测序仪（Illumina）上进行测序，并具有以下建议的测序条件：读取1：26 NT ，INDEX 1：10 NT，读取2：90 NT
，INDEX，INDEX 2：10 NT。 　　使用CellRanger（版本5.0.0）处理原始序列读取 ，包括基于空滴定方法的完整单元格的默认检测
。使用Cellranger的计数管道在默认参数设置中使用Refdata-cellranger-HG19-1.2.0作为参考
，作为参考1-4作为特征参考和预期的3,000个单元的预期数量，使用CellRanger的计数管道在默认参数设置中使用CellRanger的计数管道进行反复绘制 ，映射
，检测以及基因表达的定量。值得注意的是，使用的参考文献不包含由各自的生物型定义的免疫球蛋白基因和TCR基因 ，除了trbv11-2外
，该基因还被除外 。这导致了MIS-C池的8,531、4,356和7,644个完整的细胞，对照组为8,060个
。接下来 ，使用Cellranger的AGGR合并图书馆而无需大小归一化
，并使用Seurat软件包（版本4.0.5）65在R（版本4.1.2）中进一步分析。特别是，使用Read10X和CreateSeuratObject读取转录组轮廓 ，并使用归一化元素进行对数正差 。使用Scaledata，RunPCA计算一个UMAP
，以使用1:50的维度计算50个主组件和RunuMap
。转录相似的簇通过共享最近的邻居模块化优化，使用带有PCA的Findneighbors作为还原和1:50的尺寸 ，以及使用FindCluster在0.1到1.0的findclusters
，分辨率为0.1至1.0。通过视觉检查线粒体基因的百分比，UMI计数 ，已识别基因的数量
，家具基因，TCR和BCR的数量 ，并在典型标记基因的表达上预测了umap图2d -2d -2d -2d -i 。根据核心标记基因的表达（扩展数据图2f – i）
，顶级表达的基因（补充数据1 、2和17），细胞周期评分 ，对群集进行注释（扩展数据） 使用Loupe浏览器（版本5和6
，10X基因组学）衍生自与不同细胞周期阶段相关的基因的缩放表达
。为了进一步完善细胞识别，使用BCR测序鉴定B细胞的同种型 ，以区分预切口和开关的内存B细胞（扩展数据图2i）。TCR测序还用于鉴定T细胞 。在进一步的分析中未考虑包含低质量细胞以及包含污染物的簇的簇
。使用主题标准化后，使用主题标签读取样品并使用直方图对正态分标记的单元进行了反复读取。 　　TCR注释基于单细胞免疫分析 。特别是
，使用refdata-cellranger-vdj-grch38-alts-Alts-Alts-Alts-Alts-ensembl-2.0.0在默认参数设置中，通过CellRanger（版本5.0.0）和VDJ处理了原始序列读取。TCR的注释通过相同的细胞条形码在单细胞转录组分析中分配给相应的细胞
。在多个重叠群的情况下 ，分别考虑了α和β或γ和δ链的最丰富
，生产性和完全测序的重叠群。值得注意的是，Cellranger错误地标记了TRBV11-2 ，用TRBV11-1注释
，通过将各个重叠群的序列对TRBV11-1和TRBV11-2的参考序列进行多重比对来判断，并将转录组映射到TRBV11-2基因座位 。 　　如先前所述的57对每个单个细胞进行的GSEA ，这是根据单核细胞的对数正态表达值的差异
，包括浆质的B细胞的均值，或使用cloupe（版本6.3.0）手动选择为预先排名的列表和1,000 Randomizations 66,67的B细胞或T细胞
。针对T细胞 ，B细胞（带有浆膜）和单核细胞的T细胞分别进行GSEA。通过基因设置进行置换以计算每个细胞的NE
，FDR，值和核心基因 。补充数据3中表示每个集合和核心基因的重要细胞数量
。显着的上调或下调由FDR≤0.50或FDR≤0.25（散装测序的建议FDR）定义为66的附加对照（扩展数据图6） ，并通过归一化的P值<0.05。为了可视化，绘制了重要细胞的NES 。使用标志性基因集对指示细胞进行GSEA
，这是我们先前发表的TGFβNK细胞基因SET4和先前定义的免疫转录模块59
。Hallmark基因集从MSIGDB Collections68获得。通过在UMAP上的NES分数以及在明显富集细胞的NES评分的小提琴图上的NES分数投影（阳性NES评分），可以看到GSEA结果 。 　　在RPMI 1640培养基（GIBCO）中进行了抗原特异性的重新刺激实验 ，并补充了5％V/V人AB血清（Sigma-Aldrich）或10％V/V患者血清
，100 U ML-1青霉素/链霉菌素/链霉菌素/链霉素（Gibco）（Gibco）（Gibco）和2 MM-氯丁胺（羟基胺）
。对于抗原反应性测量，用以下抗原刺激了16小时的总共5×105 PBMC。对于SARS-COV-2：肽剂SARS-COV-2 PROT_N ，肽SARS-COV-2 PROT_S
，肽剂SARS-COV-2 PROT_M，OMICRON特异性肽肽SARS-COV-2 PROT_S B.1.1.1.529（每60 nm; liltenyiiiiiiiiiiii biotech） 。对于EBV：肽剂EBV共识 ，高级等级（每肽60 nmol； Miltenyi Biotech）。对于HSV-1：肽HHV1包膜糖蛋白D
，研究级（每肽60 nmol； Miltenyi Biotech）
。对于HSV2：PEPMIX HSV2（GD）（每肽15 nm； JPT肽技术）。对于HHV-6（U54）肽池（每肽15 nm；肽和大象） 。对于ADV：肽剂ADV SELECT（每肽60 nm； Miltenyi Biotech）
。所使用的其他肽是肠毒素B（SEB； Sigma-Aldrich）1 µg ML-1或巨细胞病毒（CMV）PP65（每肽60 nm; Miltenyi Biotech）的肽池。在1μgmL -1 CD40和1μgml -1 CD28功能级纯抗体的情况下进行刺激 。使用时，将患者血清与针对TGFβ1 ，TGFβ2和TGFβ3的抗体预孵育10分钟
。对于EBNA2肽特异性T细胞
，EBNA2275–295肽PRSPTVFYNIPPMPLPPSQL（10 µg mL-1）或EBNA2279-290肽TVFynippMpl（5 µg ml-1）是定制的（5 µg ml-1）（5 µg ml-1）（肽和Elephest和Elephants，purity＆Elephants ，purity and purety and purets and purets and purets and perty and permc and≥80％＆≥80％＆≥80％＆≥80％和刺激。 　　将细胞与FCR阻断试剂（1:50，Miltenyi Biotec）一起孵育
，并用CD14 VioBlue（1：200，Clone Rea599 ，Milenyti Biotec）
，CD19 Vioblue（1：100）（1：100，Clone Rea675 ，Miltenyi Biotec）
，Miltenyi Biotec BV510（1：100），CLONE RECON599 ，CLONE RECON 599
，CLONE RECON 599，CD14510（1：100） ，CD14510（1：1）Biosciences), CD3 PE Cy5 (1:200, clone UCHT1, BioLegend), CD8a BV650 (1:100, clone RPA-T8, BioLegend), CD4 PerCPeFluor710 (1:200, clone SK3, eBioscience), CD69 APC-Cy7 (1:100, clone FN50, BioLegend), CD154 PE (1:100,如上所述
，克隆Rea238，Miltenyi Biotec）CD137 PE CY7（1：100 ，克隆4B4-1，Biolegend） 。直接在使用MacSquantify软件对MacSquant Analyzer 16（Miltenyi Biotec）进行分析之前
，添加了DAPI（Sigma-Aldrich，0.1 µg ML-1）
。CD69+CD4+记忆T细胞定义为DAPI -CD14 -CD19 -CD3+CD45RO+CD8 -CD4+CD69+。CD69+CD8+记忆T细胞定义为DAPI -CD14 -CD19 -CD3+CD45RO+CD4 -CD8+和CD69+ 。CD154+CD69+CD4+ memory T cells were defined as DAPI−CD14−CD19−CD3+CD45RO+CD8−CD4+CD154+ and CD69+CD154+CD69+CD8+ memory T cells were defined as DAPI−CD14−CD19−CD3+CD45RO+CD4−CD8+CD154+CD69+.CD137+CD69+CD8+记忆T细胞被定义为DAPI -CD14 -CD19 -CD3+CD45RO+CD4 -CD8+CD137+CD69+（扩展数据图7A ，C）
。对于EBNA2275–295-和EBNA2279–290特异性T细胞
，用CD14 VioBlue（1：200，Clone Rea599 ，Milenyti Biotec）
，CD19 VioBlue（1：1：1：100）染色细胞（1：100）Biosciences), CD3 PE Cy5 (1:200, clone UCHT1, BioLegend), CD8a BV650 (1:100, clone RPA-T8, BioLegend), CD4 PerCPeFluor710 (1:200, clone SK3, eBioscience), CD69 APC (1:50, clone FN50, Miltenyi Biotec), CD154 PE (1:100,克隆Rea238，Miltenyi Biotec）和TCRVβ21.3APC-VIO770（1：100 ，Clone Rea894
，Milteyi Biotec）。使用FlowJo Software 10.8.1（Treestar）分析了CD4+或CD8+记忆T细胞和CD154+ CD69+ CD4+或CD8+存储T细胞的TCRVβ21.3（扩展数据图8C）的表达 。 　　使用QIAAMP DNA微型试剂盒（QIAGEN）从MIS-C和HEATHY对照组的患者（没有MIS-C的儿童和用于生成病毒特异性T细胞库的生成）中，从全血或颊拭子（ESWAB ，COPAN）中提取DNA。将DNA进行HLA-A
，HLA-B，HLA-C ，DRB1，DRB3
，DRB3，DRB4 ，DRB5
，DQA1，DQA1 ，DQB1和DPB1进行HLA基因分型
。使用下一代测序使用Protrans NGS进行7个基因座（Protrans Medical Diagnostics）进行HLA键入。分离的基因组DNA用于八个多重PCR反应中
，并用Nextera XT索引引物试剂盒（Illumina）标记 。在特定于小组的合并之后，然后进行清洁珠纯化（Beckman Coulter）和归一化（Quant-It Picogreen ，Thermo Fischer Scientific）
，在Illumina Miseq平台上准备了Miseq库
。基于最新HLA数据库的Hitype软件（Inno-Train）用于数据分析。 　　如上所述，刺激了至少1×107的总PBMC 。刺激后 ，如前所述
，将细胞用总Seq抗人类主题标签染色，然后根据制造商的协议（CD154 Microbead Kit ，Human; Miltenyi Biotec），然后根据CD154 Mac富集
。MAC之后
，将细胞与人体FCR阻断试剂（1:50，Miltenyi Biotec）孵育 ，并用Pe-Anti Biotin（1：100
，Clone Bio3-18e7，Miltenyi Biotec）染色 ，以进行FACS浓缩
，Miltenyi Biotec），CD154 PE（1:40 ，CLONE REA238
，MILTENYIBIEECEC），CD14 ，CD14：1.1：1.14 vio。Milenyti Biotec）
，CD19 Vioblue（1：100，克隆Rea675 ，Miltenyi Biotec），CD3 PE CY5（1：200
，克隆UCHT1，Biolegend）和CD69 APC（1：100 ，克隆Rea824
，Miltenyi Biotec） 。DAPI (Sigma-Aldrich, 0.1 µg ml−1) was added and cells were sorted on a MA900 Multi-Application Cell Sorter (Sony Biotechnology) according to scatter properties, viability (DAPI−) and dump− (CD14 and CD19) specifically for CD3+CD154+CD69+ antigen-specific cells (Extended Data Fig. 8a).使用R包装pheatmap生成热图
。 　　如前所述，从健康供体中产生了来自健康供体的EBV延育B细胞（LCL）。简而言之 ，将5–10×106个PBMC播种在RPMI 1640培养基（GIBCO）中
，补充了10％V/V fcs（Corning或biowest）和250 µL EBV级别的4μgML -1 CPG和0.5μgml -1 CPG和0.5μgml -1 Cyclosporin a和passected a和passected suppered suppered suppered 。从相同的供体中，使用人类PAN T细胞分离试剂盒（Miltenyi Biotec）从PBMC中分离出T细胞 ，并与人FCR阻断试剂（1:50
，Miltenyi Biotec）孵育，并用CD3 FITC染色 ，并用CD3 FITC（1：100percpefluor710（1：200
，克隆SK3，EBIOSCIENCE） ，TCRVβ21.3APC-VIO770（1：100，Clone Rea894
，Miltenyi Biotec）
。在排序之前，添加了DAPI（Sigma-Aldrich ，0.1 µg ML-1）。将细胞对MA900多施加细胞分类器（Sony Biotechnology）进行分类 。根据CD4
，CD8和TCRVβ21.3表达（扩展数据图8D），对可行（DAPI-）和Vioblue -CD3+细胞进行了进一步分类。每孔播种4万个细胞 ，并使用Dynabeads以1：1的珠子与单细胞比为1：1的人类T-激活器CD3/CD28（热泡）膨胀
，以生成足够的材料以进行杀戮测定
。对于CD4细胞，添加了50 U ML-1人类重组IL-2（peprotech） ，对于CD8的扩展
，将10 ng ml-1 IL-15（peprotech）添加到培养基（Texmacs Mediup（Miltenyi Biotec）中，用5％的人AB Serum Serum（Sigma-Aldrich）（Sigma-Aldrich）（Sigma-Aldrich）（Sigma-Aldrich）（Sigma-Aldrich）（Sigma-Aldrich）（Sigma-Aldrich）和100 U ml-1 Penectocco）（gib-1 Penectocco）。LCL用CFSE标记（1：2000 ，Biolegend） 。膨胀后
，用DAPI染色后，对每个供体的CFSE标记的LCL和扩展的T细胞进行了计数 ，并在200 rpm的200 rpm下用来自同一供体的许多可行T细胞播种了1×104活的LCL
。将LCL与CD8+ T细胞共培养4小时，在37°C 5％CO2下与CD4+ T细胞共培养24小时。为了检测最近的脱粒
，使用了CD107A分析 。为此，CD107A Alexafluor647（1：3000 ，克隆H4A3
，Biolegend）和Brefeldin A （在最后4小时内添加（5 µg mL -1，生物本） ，因为CD107A仅在脱粒过程中在表面上短暂表达44
。用可固定的活力染色僵尸（1：400
，Biolegend）或Viobility 405/452可固定染料（1：1：1：1：1：100，Miltenyi Biotec） ，CD3 PE CY5（1：200
，克隆UCHT1，Biolegend） ，Biolegend）
，CD8A BV650（1：1：1：1：100，clfeR cloe rpa rpega rpegegen ，cd3 pe cy5（1：200）（cd3 pe cy5（1：200），将细胞染色。（1：200
，克隆SK3，Ebioscience）和TCRVβ21.3APC-VIO770（1：100 ，Clone Rea894
，Miltenyi Biotec） 。之后，将细胞固定并用真正的核染色试剂盒（Biolegend）透化 ，并用活跃的caspase-3 Alexafluor647（1:50
，BD Bioscience）染色
。可行的LCLS定义为CFSE+，可固定的可活力染料和活动caspase-3-细胞（扩展数据图8E）。将细胞计数归一化为没有T细胞的LCL和CD107A（扩展数据）染色 ，将染色标准化为在没有LCL的情况下培养的T细胞
，以减去CD107A的背景表达 。 　　血清IgG抗体抗体水平抗HSV-1（ABNOVA，KA0229） ，HSV2（ABNOVA
，KA0231），EBNA1（ABCAM ，AB108731），CMV（ABNOVA
，ABNOVA，KA1452） ，KA1452）
，HHV-6（HHV-6）（HHV-6（ABNOVA，DEIA2）和DEIA 2（ka1457）和ADVIA233和ADVIA ，创造性诊断
，创造性诊断，IgM antibody levels against HSV-1/2 (Abnova, KA4842), EBNA1 (Abnova, KA1449), CMV (Abnova, KA0228), HHV-6 (Creative Diagnostics, DEIABL57) and AdV (Creative Diagnostics, DEIA1767) were measured in first serum samples obtained from patients according to manufacturer’s manuals.提供的抗体的工作储备解决方案无需进一步稀释
。根据参考对照计算任意单位。为了使年龄匹配的血清毒性比较 ，根据出版年龄为50,70,70,71,72的患者按年龄分组 。扩展的体验数据是从先前发表的MIS-C同伴中获得的。已发表的队列或对照组
，包括健康的儿童和未获得MIS-C的SARS-COV-2感染儿童，已被调整以与测试人群的年龄分布相匹配（补充数据12）
。通过自动分析（联络 ，迪亚索蛋白和建筑师
，雅培），通过认可的EBV-IGM和–IGG抗体和酶免疫测定的免疫印迹测定法确定了病毒血清学的医院数据。 　　为了检测EBV重新激活 ，从转录组分析中提取了从转录组分析的.bam文件中提取未映射的读取，并映射到人伽马疱疹病毒4参考文献（NCBI_ASSEMBLIES：GCF_0024022265.1
，GCF_0002265.1，GCF_0008772045.1 。）
。使用标准数据库的BLAST验证了特定的结合以及正确的基因注释。EBV UMI计数通过相同的细胞条形码在单细胞转录组分析中分配给相应的细胞 。 　　根据制造商的指示 ，使用EAPYMAG提取器（BioMérieux
，Marcy-l’etoile，France）从200 µL血浆样品中提取EBV病毒DNA（洗脱体积50 µL）
。然后使用EBV R-GENE试剂盒确定EBV的存在和病毒载荷（仅用于研究使用 ，而不是用于诊断
，69-002B；BioMérieux）。EBV DNA拷贝数的日志每ML（log副本ML -1）等离子体用于描述EBV病毒载荷 。报告的LOD为1.6 log拷贝ML -1
。 　　对于EBV重新激活，将LCL在RPMI 1640（GIBCO 61870-044）中孵育 ，其中10％V/V fcs（Biowest S1600-500）或10％V/V患者血清和1％V/V Pericilcin/thepsylcin/theptomycin（Gibco 15140-122）。重组人TGFβ1（10 ng ml-1; peprotech
，100-21）用作阳性对照 。如果TGFβ被中和，则将患者的血清预孵育10分钟 ，用针对TGFβ1
，TGFβ2和TGFβ3的50 µg ml-1的抗体（R＆D Systems，MAB1835-SP）
。24小时后收集细胞 ，并使用RNeasy Plus Micro Kit（Qiagen）提取总RNA。使用随机六聚体（Life Technologies）使用Taqman逆转录套件转录cDNA 。使用人类HPRT1引物和Taqman基因表达分析（生命技术）的探针以及转录因子BZLF1的引物和探针的以下组合，诱导Lytic EBV复制周期
，前向：5'- ctcaacctgggagacaattctactctactgt-3'，反向：5'-TGCTAGCTGTTGTCCTTGGTGTTAG-3' ，探针：5'-FAM-CTGCTGCTGCTGCTGTTTG-3'NFQ（Life Technologies）。在QuantStudio 5实时PCR系统（Applied Biosystems）上测量样品
。 　　用于Windows（GraphPad软件）的GraphPad Prism（v8.00至v9.4.1）用于数据的统计分析。如果适用
，将所有数据绘制为个体值，并将中位数作为数据摘要 。对于非正常分布数据的两组比较 ，使用了两尾Mann-Whitney U检验
。如果可以假定正态分布
，则使用两尾t检验。对于配对样品，使用了配对的测试等效性 。为了进行多个组比较 ，使用了两尾非参数方差分析（Kruskal – Wallis测试）
，然后进行DUNN的多重比较测试，并进行了校正以进行多次比较
。使用Spearman相关性计算相关性。测试GSEA的显着性：如果仅量化阳性富集 ，则使用两尾的Mann-Whitney U检验；否则
，为了测试双峰数据中的阳性和阴性富集，使用了两尾Fisher的精确测试 。测试潜在病毒感染的血清阳性增加：使用了一尾Fisher的精确测试
。所有测试的显着性阈值均设置为0.05 ，并且P值在适用的情况下提供了多达4个重要数字。 　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得 。