购买时芝加哥大学综合基因组核心（EIGC）和至少每年适当地适当地在芝加哥大学综合基因组核心（EIGC）中 ，通过基因组短串联重复（STR）分析对所有细胞系进行了身份验证 。人类T淋巴细胞细胞系Jurkat T购自美国型培养物收藏（ATCC）
。H.C.提供了人类Plat-E细胞和小鼠黑色素瘤细胞系B16-OVA。W.S.实验室提供了人类RS4； 11个细胞 。小鼠黑色素瘤癌细胞系B16F10
，乳腺癌细胞系E0771和刘易斯肺癌细胞系LLC1购自ATCC
。小鼠结直肠癌腺癌细胞系MC38购自Kerafast。Plat-E，B16-OVA ，B16F10
，E0771和LLC1细胞在Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）中培养，胎儿牛血清（FBS）（Sigma ，F2442）和青霉素/链霉素 。在含10％FBS和青霉素/链霉素的RPMI-1640培养基中培养Jurkat T细胞
。在37°C和5％CO2上培养所有细胞。根据芝加哥大学机构生物安全委员会（IBC）批准的方案进行了细胞系实验 。 　　通过磁珠纯化使用EaskSep小鼠纯化CD8+ T细胞分离套件
，根据制造商的说明（干细胞技术），通过磁珠纯化（由cas9; ot-i小鼠的实验室提供）从脾脏和外周淋巴结（由H.C. H.C.实验室提供）分离出表达Cas9的OT-I细胞。CAS9; OT-I细胞在体外用板结合的抗CD3（10μgml-1; Biolegend）和抗CD28（5μgml-1; Biolegend）抗体在37°C和5％CO2二氧化碳培养基的5％培养基中激活18小时
。 　　根据芝加哥大学机构动物护理和使用委员会批准的方案进行了动物实验。小鼠在芝加哥大学动物资源中心（Dement Chement Center Center）饲养并繁殖 ，该中心在没有特定的无病原体条件下 。在美国伊利诺伊州芝加哥的日光下，小鼠在12小时的光/黑暗周期上与日光一致
。住房设施保持在20–25°C和30–70％的湿度。C57BL/6 J（Jackson实验室
，JAX：000664； RRID：IMSR_JAX：000664），C57BL/6裸体（B6.CG-FOXN1NU/J）（Jackson实验室 ，JAX：000819; 000819; rrid：imsr_jax：imsr_jax：imsr_jax：0008819）
，tragnt，（B6.129S2-TCRATM1MOM/J）（杰克逊实验室 ，JAX：002116； RRID：IMSR_JAX：002116）
，PMEL-1（B6.CG-THY1A/CYTG（TCRATCRB）8rest/J）（jackson Laboratory，jax：jax：jax：005023; 0050505023; rid：0050）OT-I (C57BL/6-Tg(TcraTcrb)1100Mjb/J) (The Jackson Laboratory, JAX:003831; RRID:IMSR_JAX:003831), Cd8a-cre (C57BL/6-Tg(Cd8a-cre)1Itan/J) (The Jackson Laboratory, JAX:008766;RRID：IMSR_JAX：008766）小鼠是从杰克逊实验室购买的 。GPR43 - / - 和GPR43FL/FL小鼠由B.L.提供
。在整个研究中 ，在7-12周大的整个研究中都使用了性别和年龄匹配的小鼠
，并且使用了雄性和雌性小鼠。转基因的小鼠是可行的，并且正常发育 。 　　接受商用CAR-T细胞疗法的患者的血清来自芝加哥大学细胞疗法生物库
。补充表8包含相​​关的患者信息。 　　根据制造商的说明 ，用表达人PD-1的预制慢病毒（Gen Target
，LVP1076-PBS）感染Jurkat T细胞 。感染24小时后，选择2 µg mL-1紫霉素的细胞获得PD-1+ Jurkat T细胞
。使用蛋白质印迹检查PD-1表达水平。 　　为了构建用于基于细胞的筛选目的的循环营养复合库 ，由于种类繁多而难以区分的抗体等组件，而某些仅在包括鱼油和草药在内的整个生物水平上起作用的补充剂都被排除在外 。人类代谢组数据库（https://hmdb.ca/）可用血清水平的生理范围
，并在实验设计中应用。对于初始屏幕（1A），将Jurkat T细胞用营养库处理48小时 ，然后用2.5μgml-1抗CD3和0.5μgml-1抗CD28抗体再激活12小时
，然后在使用ELISA KIT（BioleSa Kit）中测量中等超级nim-2水平的IL-2水平
。对于屏幕1B，将1×105 PD-1+ Jurkat T细胞与2×104 H596（PD-L1+）细胞共培养60小时 ，然后用2.5μgml-1抗CD3和0.5μgml-1抗CD28抗体的培养基与另一个培养基的培养基一起激活
，然后用2.5μgml-1抗CD3和0.5μgml-1抗CD3抗元素与2张均级别进行激活。Elisa Kit 。有关更多详细信息，请参考补充表1-4
。 　　For C57BL/6 mice and the TCRα-knockout mice tumour model, mice were anaesthetized with isoflurane, shaved at the injection site, and then injected subcutaneously in the abdominal flank with 1 × 105 B16F10, MC38 or LLC1 cells, or in the mammary gland with 2 × 105 E0771 cells. C57BL/6 nude mice were injected subcutaneously in the abdominal flank with 1 × 105 B16F10 cells. The tumour-bearing mice were assigned to TVA-enriched diet (1% TVA, special order from Research Diets), CVA-enriched diet (1% CVA, special order from Research Diets) or control diet (Research Diets) as of the day of tumour inoculation, with mice body weight monitored. Tumours were measured using a calliper every 2–3 days. Tumour volumes were calculated using the following formula: length × width × [(length × width) × 0.5] × π/6. Mice were euthanized at humane endpoints or day 11–15 for tissue collection. 　　For the 666-15 treatment mouse model, 6–8-week-old C57BL/6 mice were anaesthetized with isoflurane, shaved the injection site, and then injected subcutaneously in the abdominal flank with 1 × 105 B16F10 cells for tumour development. The tumour-bearing mice were assigned to TVA-enriched diet or control diet as of the day of tumour inoculation. When the tumour volume reached approximately 100 mm3, the mice were treated with either vehicle or 666-15 at 20 mg kg−1. The 666-15 was dissolved in 1% N-methylpyrrolidone, 5% Tween-80 in H2O. The mice were treated once a day for 5 consecutive days per week for 2 weeks. Tumours were measured using a calliper every 2–3 days. Tumour volumes were calculated using the following formula: length × width × [(length × width) × 0.5] × π/6. Mice were euthanized at humane endpoints. 　　对于抗PD-1治疗小鼠模型 ，用异氟烷麻醉了6-8周龄的C57BL/6小鼠
，剃光了注射位点，然后在腹侧下皮下注射1×105 B16f10细胞 ，以进行肿瘤的发育。截至接种肿瘤当天
，含有肿瘤的小鼠被分配给富含TVA的饮食或对照饮食 。在第3、6 、9
、12和15、250 µg抗PD-1（bioxcell）或IgG对照（bioxcell）腹膜内注射
。每2-3天使用卡盘测量肿瘤。使用以下公式计算肿瘤体积：长度×宽度×[（长度×宽）0.5]×π/6 。小鼠在人道端点上被安乐死
。 　　对于GPR43和CREB1敲除Cas9; OT-I细胞的产物转移小鼠模型，将4×105 B16-ova细胞皮下注射在6-8周大的C57BL/6裸鼠的腹侧 ，并在第0天，肿瘤生长6天。在CAS9中将靶基因撞倒； OT-I细胞
，在第6天通过尾静脉注射将5×106细胞转移到含有肿瘤的C57BL/6裸鼠中 。在第6天，将含有肿瘤的小鼠分配到富含TVA的饮食或对照饮食中 ，每2-3天使用卡尺测量肿瘤
。使用以下公式计算肿瘤体积：长度×宽度×[（长度×宽）×0.5]×π/6。小鼠在人道端点上被安乐死 。 　　对于GPR43 - / - 小鼠肿瘤模型
，用异氟烷在注射部位剃光了6-8周龄的GPR43 - / - 或同化对照小鼠，然后在注射部位剃光 ，然后在1×105 B16f10细胞中皮下注射腹侧
，用于tumor开发。在肿瘤接种当天，将含有肿瘤的小鼠分配给富含TVA的饮食或对照饮食 ，每2-3天使用卡盘测量肿瘤
。使用以下公式计算肿瘤体积：长度×宽度×[（长度×宽）×0.5]×π/6。小鼠在人道端点上被安乐死 。 　　对于GPR43-/FLCD8ACRE小鼠肿瘤模型
，使用GPR43 - / - ，GPR43FL/FL和CD8ACRE小鼠繁殖以获得GPR43 CD8 CD8条件敲除小鼠（GPR43-/FLCD8ACRE）
。用异氟烷麻醉了六到八周龄的GPR43-/flcd8cre或同窝对照小鼠 ，将注射部位剃光
，然后在1×105 b16f10细胞中皮下注射注射部位，以进行肿瘤发育。在肿瘤接种当天 ，将含有肿瘤的小鼠分配给富含TVA的饮食或对照饮食，每2-3天使用卡盘测量肿瘤 。使用以下公式计算肿瘤体积：长度×宽度×[（长度×宽）×0.5]×π/6
。小鼠在人道端点上被安乐死。 　　补充表9中总结了有关控制
，TVA和CVA富含饮食的全部组成的详细信息 。 　　Five- to eight-week-old C57BL/6 mice were injected subcutaneously in the abdominal flank with 1 × 105 B16F10 cells, and then injected intraperitoneally with six doses of depleting antibodies (anti-CD8α, BioXCell, clone 2.43) or isotype control (rat IgG2β isotype control, BioXCell, clone LTF-2)在第1天（200μg），2（200μg） ，4（200μg）
，8（200μg），12（200μg）和16（200μg）相对于肿瘤注射（第0天）
。收集脸颊出血并进行流式细胞仪 ，以检查第3 、12和18天的CD8+ T细胞耗竭效率
，使用靶向非竞争CD8表位（BV711抗小鼠CD8α）的抗体。 　　根据制造商的说明，通过ELISA MAX标准组（Biolegend）检测人或小鼠T细胞分泌的IL-2 ，TNF和IFNγ 。 　　从PMEL小鼠中分离PMEL-1细胞
，并在6孔板中以1×106细胞/孔的密度（用抗CD3和抗CD3和抗CD28）播种18小时
。然后将100万个活化的PMEL-1细胞与2×105 B16F10细胞共培养24小时，或不带20 µm TVA。收集所有悬浮液中的细胞 ，用抗小鼠CD45和PI染色
，并通过流式细胞仪进行分析 。 　　通过在6孔板中播种5×104细胞进行细胞增殖测定。使用TC20自动细胞计数器（Bio-Rad）在5天内每天记录细胞数量
。 　　如上所述，分离了含肿瘤动物的TIF和血清。简而言之 ，将肿瘤从安乐死的动物中解剖，在含有培养皿的盐水中冲洗
，然后放在20μm网状尼龙过滤器（Spectrum Labs，148134）的顶部 ，该滤液固定在圆锥管上（Falcon
，1495949 A） 。将圆锥管盖放在顶部没有拧紧并使用实验室胶带胶带上后，将含肿瘤的圆锥管的胶带胶带在4°C下在4°C下进行离心10分钟 ，在106克使用冷藏临床离心机进行离心
。总共在圆锥管的底部获得了10–50μl的流体。为了制备小鼠血清
，一旦解剖肿瘤，使用1 ml 25 g TB注射器从心脏穿刺从小鼠心脏中分离出血液 ，并通过在室温下不受干扰
，然后在1,500G下以1,500G离心10分钟，以在冷藏的中心裂片中分离10分钟 。由此产生的上清液被指定为血清
。人血清样品是从芝加哥大学细胞疗法生物库中获得的。使用配备有冰冻蛋白酶的Bruker Ascend TM 600光谱仪 ，将TIL和血清样品通过1H-NMR光谱对TVA水平进行定量 。在典型的过程中
，将350 µL氘化甲醇（甲醇-D4）添加到冻干样品中以溶解TVA
。涡旋后，将样品以10,000克离心5分钟以收集上清液。在335-PP精度3 mM NMR管（Wilmad-Lab玻璃）中 ，上清液（250 µL）的1H-NMR光谱以延迟时间（D1）设置为2 s，进行3,072张扫描 。根据1.97 ppm和四甲基硅烷内标准的峰积分计算TVA浓度
。 　　从安乐死的含肿瘤的小鼠中解剖肿瘤组织
，使用手术刀在盘中切成小块（≤2mm），然后转移到含5 ml肿瘤消化培养基（500μl胶原酶/透明酶/透明质酸酶溶液 ，750μl1 ml-11 ml-11 ml-11 ml-1 ml-1 ml-lpmi y的14 mL圆底管）中中等的）。在37°C在摇动平台上孵育25分钟后
，将消化的肿瘤组织转移到50 mL圆锥管上的70μm网状尼龙滤网中，使用注射柱塞的橡胶端推进过滤器 ，并用推荐的介质冲洗 。在室温下以低位在室温下以300克离心10分钟后
，将所得的细胞颗粒加入10 ml氯化铵溶液在室温下孵育5分钟，然后在300g下在室温下以300克离心10分钟。在PBS中 ，将所得的细胞颗粒以每毫升的1-10×106细胞重新悬浮
，然后使用EasySep小鼠TIL（CD45）阳性选择试剂盒根据制造商的指示（Stemcell Technologies），通过磁珠纯化进行CD45+肿瘤浸润的白细胞隔离
。 　　PBS中的剪刀将新鲜切除的小鼠肿瘤组织切成小块（体积小于1 mm3） ，在37°C下
，胶原酶IV（1 mg ML -1）和DNase I（200 u ml -1）在PBS中的PBS中消化20分钟。将消化的肿瘤组织加入5倍的体积0.01 m EDTA，通过200个网筛（100μm滤网）过滤到新的管中 ，然后在室温下以300克离心5分钟 。将所得的细胞颗粒用3 mL PBS重新悬浮，在3 ml淋巴细胞隔离液体（预热至室温）上轻轻放置
，并受到密度梯度离心（300g，30分钟 ，室温
，室温，加速 ，加速6
，减速2）
。细胞的中间层被小心地移动到新管，将PBS添加到15毫升中 ，并离心（300g
，10分钟，室温）。指定细胞颗粒（如有必要 ，裂解红细胞）
，并用于以下实验 。 　　用注射器柱塞在1 ml PBS中用注射器柱塞中断的40μm滤波器中的脾脏破坏，该滤网被过滤到15 mL管 ，用PBS洗涤，并在300g下离心5分钟
。将所得的细胞颗粒与2 ml红细胞裂解缓冲液（Invitrogen）重新悬浮
，在室温下孵育10分钟，并在加入13 ml PBS后以300克离心5分钟。所得的细胞颗粒被指定为脾细胞 ，用于以下实验 。 　　用注射器柱塞在1 mL PBS中破坏DLN
，在40μm滤网中过滤到15 mL管，用PBS洗涤 ，并在300g下离心5分钟
。所得的细胞颗粒被指定为LN淋巴细胞
，用于以下实验。 　　使用EasySepep小鼠CD8+或CD4+ T细胞分离试剂盒，根据制造商的说明（Steamcell Technologies） ，通过磁珠纯化从脾脏和C57BL/6小鼠的外周血淋巴结中分离出小鼠初级CD8+或CD4+ T细胞 。根据制造商的说明（Stemcell Technologies）
，通过人CD8+ T细胞分离试剂盒从PBMC（ZEN-BIO）中分离出人类原发性CD8+ T细胞
。在37°C和5％CO2 Inugubator的Click's培养基中，在体外用板结合的抗CD3（10μgml-1; Biolegend）和抗CD28（5μgml-1; Biolegend）抗体激活分离的原代CD8+或CD4+ T细胞 ，在体外激活18小时。活化的CD8+或CD4+ T细胞已准备好进行进一步的实验 。在含有10 ng ml-1 IL-7（Biolegend）的Click's培养基中
，保持了幼稚的CD8+ T细胞对照。 　　用荧光抗体从肿瘤，脾脏和DLN中分离出的小鼠原代细胞 ，并通过流式细胞仪进行分析
。 　　对于实验/死亡标准的实验，首先根据制造商的说明将细胞用可固定的生存力染料（FVD）（Thermo Fisher Scientific）染色。随后的表面标记物染色在流式细胞仪染色缓冲液（Thermo Fisher Scientific）中进行 。根据制造商的说明
，使用Ebioscience FOXP3/转录因子染色缓冲液集（Thermo Fisher Scientific）进行了含有核蛋白的流量面板的细胞内染色
。对于细胞质蛋白的细胞内染色，根据制造商的说明使用了固定/透化溶液试剂盒（BD Biosciences）。 　　对于磷酸化抗体染色 ，将细胞与FVD（细胞活力染料）在室温下在管中的管中孵育15分钟
，并在管子中重新悬浮，并直接将200μl预热的1×BD Phosflow Lyse/Fix Buffer直接放入管中 ，并在37°C下在37°C下孵育10-15分钟
，然后在300-15分钟内进行300分钟，以进行300分钟的中心 。将所得的细胞颗粒用FACS缓冲液洗涤一次 ，用200μlBDPhosflow Pers Perm缓冲液III在冰上透化45分钟
，然后以300克离心5分钟
。再次用FACS缓冲液清洗细胞颗粒，以300克离心5分钟 ，并在FACS缓冲液中与抗体在室温下孵育45分钟1小时。 　　小鼠抗CD11b抗体用于髓样细胞（CD11b+）标记 。用CD11b+细胞输在一起后
，将抗F4/80和GR1抗体用于巨噬细胞（GR1-F4/80+）标记，将抗CD11C抗体用于树突状细胞（CD11C+）标记 ，抗CD16和CD63抗体用于中性粒细胞（CD16-CD16--CD6363+），用于单核细胞（CD14+）标记
。 　　在BD LSR-Fortessa 4–15流式细胞仪或Attune NXT 4-14上收集数据
，并使用FlowJo V10.4分析。 　　大鼠抗IGG2B同种型（Bioxcell，BE0090; Clone LTF-2; Irrid：ab_1107780）;小鼠抗CD8α（Bioxcell ，BE0061;克隆2.43; i Ways：ab_1125541）;鼠标抗PD-1（Bioxcell
，BE0146;克隆rmp1-14; i Ways：ab_10949053）;小鼠PERCP/CYANINE5.5抗KI-67抗体（Biolegend，652423; Clone 16a8; Irrid：ab_2629530 ，1：200）;亮紫605抗T-bet抗体（Biolegend
，644817;克隆4B10;我想要：AB_11219388，1：200）;小鼠APC抗CD223（LAG-3）抗体（Biolegend ，125209;克隆C9B7W;我想要：AB_106399935
，1：200）;鼠标亮紫650抗CD223（LAG-3）抗体（Biolegend，125227; Clone C9B7W;我想要：AB_2687209 ，1：200）;小鼠PERCP/CYANINE5.5抗CD366抗体（Biolegend
，134012;克隆B8.2C12; Irrid：ab_2632736，1：200）; PE ANT-TCF1（TCF7）抗体（Biolegend ，655207; Clone 7f11a10;我想要：AB_2728491，1：200）;人/小鼠/大鼠FITC抗CD278（ICOS）抗体（Biolegend
，313505;克隆C398.4 A; irrid：ab_416329，1：200）;人/小鼠FITC抗GZMB再生抗体（Biolegend ，372205;克隆QA16A02; irrid：ab_2687029
，1：200）;小鼠PE/Cyanine5抗CD69抗体（Biolegend，104509;克隆H1.2F3;我想要：AB_313112 ，1：200）; FITC抗小鼠CD63抗体（Biolegend
，143919;克隆NVG-2; irrid：ab_2876488，1：200）;小鼠APC抗CD152抗体（Biolegend ，106309;克隆UC10-4B9;我想要：AB_2230158
，1：200）;小鼠APC抗CD279（PD-1）抗体（Biolegend，135209;克隆29 F.1A12; irrid：ab_2251944 ，1：200）;小鼠PE/Cyanine5抗CD4​​抗体（Biolegend
，100409;克隆GK1.5;我想要：AB_312694，1：200）;鼠标亮紫421抗2抗体（Biolegend ，503825; Clone Jes6-5H4;我想要：AB_10895901，1：200）;小鼠APC抗CD45.2抗体（Biolegend
，109813;克隆104;我想要：AB_389210，1：200）;小鼠APC抗IFNγ抗体（Biolegend ，505810;克隆XMG1.2; i Ways：ab_315404
，1：200）;人/小鼠PE/CYANINE7抗凝集酶B重组抗体（Biolegend，372213; Clone QA16A02; irrid：ab_2728380 ，1：200）;小鼠PERCP/CYANINE5.5抗TNF抗体（Biolegend
，506321;克隆MP6-XT22; i Ways：ab_961435，1：200）; 鼠标亮紫711抗CD8A抗体（Biolegend ，100747;克隆53-6.7;我想要：AB_11219594
，1：200）;鼠标明亮的紫罗兰色421抗Foxp3抗体（Biolegend，126419;克隆MF-14;我想要：AB_2565933 ，1：200）;小鼠APC抗CD3抗体（Biolegend
，100235; Clone 17a2;我想要：AB_2561455，1：200）; FITC抗BCl-2（Biolegend ，633503; Clone Bcl/10c4;我想要：AB_2028392，1：200）;鼠标APC抗CD98（4F2）（Biolegend
，128211;克隆RL388;我想要：AB_2750544，1：200）;小鼠FITC抗F4/80重组抗体（Biolegend ，157309;克隆QA17A29;我想要：AB_2876535
，1：200）;小鼠APC抗LY-6G（GR1）抗体（Biolegend，127613; Clone 1a8;我想要：AB_1877163 ，1：200）;小鼠/人APC抗CD11b抗体（Biolegend
，101211;克隆M1/70;我想要：AB_312794，1：200）;小鼠PERCP抗CD11c抗体（Biolegend ，117325;克隆N418;我想要：AB_893236
，1：200）; Alexa Fluor 647抗小鼠CD16抗体（Biolegend，158021; Clone S17014E; I RID：AB_2904300 ，1：200）; PE/Cyanine5抗小鼠CD28抗体（Biolegend
，102108;克隆37.51;我想要：AB_312873，1：200）;小鼠PE/Cyanine7抗CD14抗体（Biolegend ，123315; Clone SA14-2;我想要：AB_10641133，1：200）;小鼠/人类PE抗KI-67抗体（Biolegend
，151210;克隆11f6;我想要：AB_2716008，1：200）; PE抗LCK Phosho（Tyr394）（Biolegend ，933103; Clone A18002D; Irrid：ab_2820203
，1：200）; PE TOX单克隆抗体（TXRX10）（Thermo Fisher Scientific，12-6502-82;克隆TXRX10; irrid：ab_10855034 ，1：200）; APC磷酸化 - 磷酸化（SER133）重组兔单克隆抗体（Thermo Fisher Scientific
，MA5-36992; Clone Crebs133-4D11; Irrid：ab_2896927，1：200）; Rabbit PE活动caspase-3（Thermo Fisher Scientific ，BDB561011;克隆C92-605;我想要：AB_2033931
，1：200）;兔PE PE PHOSCHO-STAT1（TYR701）重组单克隆抗体（Thermo Fisher Scientific，MA5-37039; Clone Stat1Y7701-3E6; Irrid：ab_2896974 ，1：200）; GPR43多克隆抗体生物素单克隆抗体（Z021）（Thermo Fisher Scientific
，03-3700; 克隆Z021;RRID：AB_2532265，1：1,000）;PKA C-α抗体（细胞信号技术 ，4782 s;克隆N/A; rRID：AB_2170170，1：1,000）;Rabbit Stat1（D1K9Y）单克隆抗体（细胞信号技术
，14994 s;克隆D1K9Y; rrid：ab_2737027，1：1,000）;小鼠单克隆抗β-肌动蛋白抗体（Sigma-Aldrich ，A1978; Clone AC-15; RRID：AB_476692
，1：1,000）;山羊抗小鼠IgG（H+L）二抗，HRP（Thermo Fisher Scientific ，31430; Clone n/a; rrid; rrid：ab_228307
，1：1,000）;山羊抗兔I克隆GG（H+L）二抗，HRP（Thermo Fisher Scientific ，31460; clone n/a; rrid; rrid：ab_228341
，1：1,000）;山羊多克隆IFNα/βR1抗体（Novus，AF3039-SP；克隆N/A; RRID：AB_664107）;仓鼠单克隆TNF RI/TNFRSF1A抗体（Novus ，Mab430-Sp; Clone 55R170; RRID：AB_2208782） 。 　　对照组和TVA组的肠道粪便（每组7个样品）B16F10含肿瘤的小鼠
，然后在第16天收集，然后通过Zymo Research进行微生物组16S测序
。简而言之 ，Zymobiomics-96 Magbead DNA试剂盒（Zymo Research）用于使用自动化平台提取DNA。细菌16S核糖体RNA基因靶向测序是使用Quick-16S NGS图书馆预备试剂盒（Zymo Research）进行的 。细菌16S引物扩增了16S rRNA基因的V3-V4区域。使用创新的库制备过程制备了测序库，在该过程中
，在实时PCR机器中进行了PCR反应以控制周期，因此限制了PCR嵌合体的形成
。用定量的PCR荧光读数对最终的PCR产物进行定量 ，并基于相等的摩尔力汇总在一起。最终的合并图书馆用精选的DNA清洁和集中器（Zymo Research）清洁
，然后用贴纸（Agilent Technologies）和Qubit（Thermo Fisher Scientific）进行量化 。如果执行，则将Zymobiomics微生物群落标准（Zymo研究）用作每种DNA提取的阳性对照
。最终库是在Illumina Miseq上使用V3试剂套件（600个周期）测序的。测序是用10％的Phix Spike-In进行的 。为了进行生物信息学分析 ，使用DADA2 Pipeline36从原始读取中推断出唯一的扩增子序列变体
。通过DADA2管道
，还去除了潜在的测序误差和嵌合序列。还使用DADA2管道除去嵌合序列 。使用Qiime v.1.9.1的UCLUST与Zymo Research Database一起进行分类学分配，该数据库是一个内部设计和策划的16S数据库 ，作为参考
。使用Qiime v.1.9.1（参考文献37）进行了组成可视化
，α多样性和β多样性分析。 　　在含有0
、20、50μM [13C1] TVA（Sigma）的RPMI-1640培养基中培养一百万个活化的小鼠初级CD8+ T细胞，用0.9％的盐水溶液冲洗 ，并用裂解缓冲液冲洗
，并用裂解缓冲液裂解（400 µL冷甲醇，300 µL ，300 µL 0.88％（W/V）KCl） 。将裂解的细胞从板中刮下到玻璃小瓶中，加入800 µL冷的二氯甲烷
，并在4°C下涡旋15分钟，然后在4°C下以最大速度离心10分钟
。离心后 ，将样品保存在室温下
，形成两个不同的阶段。总共将650 µL的底部二氯甲烷馏分转移到新的玻璃管中，并用氮气干燥以获得脂质分数颗粒 。如前所述38进行了名声衍生化。简而言之 ，将干脂质沉淀溶解在100 µl甲苯中
，在甲醇中添加了200 µL 2％硫酸在50°C孵育过夜，然后添加500 µL 5％NaCl以用500 µL己烷提取两次
。如果分析动物组织（名望清理：弗洛里西尔柱）用3 mL己烷 ，添加甲基酯
，并用1 ml Isohexane-diethyl醚（95：5 v/v）在两次以二乙烯酯（95：5 v/v）进行两次洗脱，则将使用名望清理。否则 ，将样品在氮下干燥
，并在50 µL的己烷中重新悬浮，以将样品加载到气相色谱 - 质谱法（GC – MS）上 。使用DB-FastFame列（Agilent Technologies ，G3903-63011）将衍生的样品注入GC-MS中，安装在安捷伦GC系统中
。TVA-FAME的保留时间为9.6分钟
，M/z为264和292，13C1-TVA-FAME的保留时间为9.6分钟 ，M/z 265。代谢物水平和衍生化片段的大量同位素分布
，用内部MATLAB分析了一个内部的Matlab文本，该片段成分 ，用于将天然片段和iS ies ies iSOBERES组成 。 　　将小鼠初级CD8+ T细胞分离
，激活并进行进一步治疗
。通过将细胞与100μMSSO孵育24小时（参考文献39），对SSO进行处理。对于抑制剂和调节剂治疗 ，SCH-202676（200 nm）
，666-15（100 nm），H-89 H-89二氯化物（200 nm） ，Rhosin HCl（10μM）
，NFAT抑制剂（1μm），U0126（1μm） ，U0126（100 nm）（100 nm），ruxolitib（100 nm）
，ruxolitib（100 nm），SCNMING（100 NM） ，SCCA（100 nm）
，SCCA（100 nm），SCCA（100 nm） ，SCCA（SCA）
，SCCA（100 nm），SCCA（100 nm） ，SC.A（1μm）（0.02 、0.2
、2、20 mm）
，丁酸酯（0.02 、0.2、2
、20 mm）或丙酸酯（0.02、0.2 、2
、20 mm）与20μMTVA40,41,42,42,42,43,44同步24小时 。对于TVA洗涤实验，将小鼠CD8+ T细胞用TVA处理24小时 ，洗净
，然后在带有或不带有TVA的培养基中再培养24小时
。对于8-溴训练营和TVA不同剂量治疗实验，将活化的小鼠CD8+ T细胞用8-溴训练营（0.01、0.1 、1.1
、1、10 、100μM）或TVA（10
、20、20 、100
、500、1,000μM）处理24小时 ，收集细胞，以进行P-CREB水平检测。对于人T细胞和CD8+ T细胞RHPD-L1分析
，在存在或不存在20μMTVA的情况下，用0.5μgml-1重组人PD-L1（R＆D）处理活化细胞72小时 ，然后用ELISA检测到IL-2和TNF水平 。 　　将小鼠和人CD8+ T细胞分离
，激活和用或不带20μm的TVA处理20分钟，40分钟和2小时
。然后将500 mM N3-甲氧含量补充到培养基中 ，然后短暂而有力摇动以使溶液完全匀浆。然后将6孔板移入细胞孵化器（37°C
，5％CO2）中10分钟，以促进基因组ssDNA的标记 。然后将细胞悬浮液转移到15 mL圆锥管中 ，并在4°C下以300克离心5分钟。丢弃上清液
，然后提取基因组DNA
。具有N3-甲氧标记的ssDNA在已建立的KAS-SEQ方案15,45之后被生物素化，富集和碎片。使用ACCEL-NGS甲基序列DNA文库试剂盒为高吞吐量测序构建了双重指数文库 ，然后通过Illumina Novaseq 6000（SP Flowcell
，100 BP Cassette）在两个单独的运行中通过Illumina Novaseq 6000（芝加哥大学）进行了测序 。然后将每个条件下的原始测序数据从两个运行中搭配，然后修剪适配器；阅读重复数据删除和映射；在Kas-Pipe分析管道15,45之后 ，进行了差异KAS-SEQ分析（比较TVA处理的未处理细胞）
。随后在Rstudio中生成火山地块。为了进行GO富集分析，每个时间点都会生成TVA处理后显示出差异ssDNA水平的基因列表 。M. Musculus和H. sapiens CD8+ T细胞KAS-SEQ数据分别评估
。然后将差异表达的基因体的列表提交以进行GO富集和可视化
，这是通过基因本体论项目18,19和Revigo46和Cytoscape47进行的。 　　为了分析信号通路，根据制造商的说明 ，将小鼠初级CD8+ T细胞分离
，激活，并用TVA处理指示的时间 ，然后根据制造商的说明为磷酸抗体阵列（R＆D系统） 。使用软件ImageJ（ImageJ
，RRID：SCR_003070）从点强度中减去背景信号来进行阵列每个位置的像素密度的量化
。 　　用TRIZOL试剂（Invitrogen）提取总RNA，然后根据制造商的说明将第一条链cDNA与Primescript第一链cDNA合成试剂盒（Takara）合成。使用ITAQ通用SYBR绿色SuperMix（Bio-Rad）进行定量RT-PCR 。 　　将小鼠初级CD8+ T细胞分离并在含有15％FBS的RPMI-1640培养基或单击的培养基中培养 ，其中55 µm 2-羟基乙醇
，2 mM谷氨酰胺，青霉素/链霉素/链霉素/链霉素 ，以及与ACCELL CORDIM（sir droven sirde sirde sirne sir sirne sirde sirce sirde sirde sir sirne sirde sirne sir sirne sirde sirde sirde sircel）（sir sir sir sir sir sir sirne sirne sirde sirde（水平）siRNA
，20 IU ML-1 IL-2和1％FBS）持续72 h
。收集细胞以进行随后的功能分析以及使用RT – PCR的耗尽效率验证。 　　为了检查TVA治疗对小鼠CD8+ T细胞基因表达的影响，将初级小鼠CD8+ T细胞分离 ，激活，然后用或不含20μMTVA（TVA组与对照组）处理24小时
，然后使用PureLink RNA Mini Mini Kit提取RNA，作为制造商的说明 。一式三份的RNA样品用于Illumina下一代测序。为了检查CREB1敲低对TVA依赖性CD8+ T细胞基因表达的变化的影响 ，使用Accell SiRNA方法将小鼠初级CD8+ T细胞分离
，激活，然后用SINTC或SICREB1转染 ，然后使用或无20μMTVA进行处理
。提取了四组（SINTC
，SINTC+TVA，SICREB1 ，SICREB1+TVA）的RNA样品
，并用于Illumina下一代测序。如前所述48进行了数据处理和分析 。 　　将小鼠初级CD8+ T细胞分离，激活 ，然后用20μMTVA处理0 、20分钟
，40分钟和2小时
。营地循环AMP免疫测定系统（Fisher Scientific Company）根据制造商的说明来检查营地级别。 　　在有或没有葡萄糖的单击培养基中，将活化的小鼠初级CD8+ T细胞培养6或24小时 ，其中含有20μM13C1-TVA或20μM13C1-钙米酸酯酸 。然后将细胞用0.9％盐溶液冲洗，并使用裂解缓冲液（500μl80％冷甲醇）裂解
。样品在N2/ICE中冻结/解冻或超声处理。此后
，加入400μl二氯甲烷并涡旋60 s 。然后将混合物放在冰上10分钟以启动分区，然后在4°C下以2,000克离心15分钟
。将极（顶部）层小心地移入一个单独的标记管并冷冻 ，同时使用N2流将有机层干燥。干燥后
，将40μL甲氧基胺（10 mg mL -1）添加到每个干燥的，提取的代谢物的管中 。然后将固体用超声/涡旋重新悬浮 ，并短暂离心以去除不溶性碎片
。然后将吡啶溶液转移到含有插入物的自动注射器小瓶中
，并在70°C煮10-15分钟。随后，添加了80μl的TBDM ，短暂涡旋
，然后在70°C下煮1小时 。最后，将样品加载到GC -MS上。 　　将小鼠初级CD8+ T细胞分离 ，激活
，然后用20μMTVA或棕榈酸处理
。根据制造商的说明，Seahorse XF长链脂肪酸氧化应激试剂试剂盒（Agilent Seahorse XF Sub Ox）检查了TVA或棕榈酸治疗对粮农组织的影响。 　　将小鼠初级CD8+ T细胞分离 ，激活，然后用TVA或SCFA处理24小时 。根据制造商的说明
，通过Fluo-4 Kit（Thermo Fisher Scientific）和Fura-2套件（Thermo Fisher Scientific）测量结合和未结合的Ca2+水平
。 　　如前所述，进行了小鼠初级CD8+ T细胞的CRISPR编辑。简而言之 ，LMPD-SGNTC-MPGK-AMETRINE
，LMPD-SGGPR43＃1-MPGK-AMETRINE，LMPD-SGGPR43＃2-MPGK-AMETRINE和LMPD-SGGPR43＃3-MPGK-AMETRINA转染试剂产生逆转录病毒 。转染后18小时更换病毒收获培养基 ，然后在48小时后收集
。原代CAS9表达OT-I（CAS9; OT-I）细胞源自CAS9的脾脏和外围淋巴结；根据制造商的指令（StemCell Technologies）
，使用EasySep小鼠T细胞分离试剂盒通过磁珠纯化通过磁珠纯化来得出。总共将20-500万CAS9; OT-I细胞激活，将其放入24孔板的一个孔中 ，并用含有10μgml-1多甲氧烯的逆转录病毒上清液补充
，然后旋转感染（800G，制动器3） ，持续3小时 。感染后
，将细胞移至37°C的细胞培养培养箱再移动2小时，然后用新的Complete Click's培养基（包含20 IU ML-1人IL-2 ，2.5 ng ML-1小鼠IL-7，25 ng ML-1小鼠IL-15）进行72 h
。收集细胞
，用流式细胞仪对细胞进行排序，以富集病毒转导的细胞（氨基氨酸阳性） ，并经过随后的功能分析以及使用PCR逆转录的敲除效率验证。 　　小鼠初级CD8+ T细胞分离并激活 。收集1000万个细胞
，沉淀并重新悬浮在含有无EDTA蛋白酶和磷酸酶抑制剂鸡尾酒（Thermo Fisher Scientific，A32961）的0.3 ml冰冷的PB中 ，然后在冰上进行超声处理
。加入对照探针N-1或TVA探针3
，并在黑暗条件下在37°C下孵育2小时。探针标记后，将样品在365 nm的紫外线下在冰上辐照6分钟 ，用1％SD稀释
，并在冰上进行超声处理 。使用Pierce BCA蛋白测定试剂盒（Thermo Fisher Scientific）在微孔板读取器（Bio-Rad）上确定蛋白质组浓度，并将其归一化为1.5 mg ML-1。通过单击化学（100μM生物素 - 氮 ，100μMTBTA
，1 mM CUSO4和1 mM TCEP）在室温下，将700 µL蛋白样品与生物素标签偶联1小时
。将样品添加4体积的丙酮 ，冷冻至-20°C，涡旋
，然后在-20°C下孵育3小时，以完全沉淀蛋白质并去除未反应的生物素 - 氮杂。将样品在4°C下以17,000克离心15分钟 ，以颗粒沉淀蛋白质 。通过超声处理将所得的蛋白质沉淀分离在1％SDS中
，添加PBS以将SDS的浓度稀释至0.2％，然后添加60 µL预洗的高容量链霉亲蛋白C1珠 ，然后在4°C下在4°C下旋转孵育
。将珠在PBS中用0.1％SDS洗涤3次
，然后在PBS中，加入2×SDS样品缓冲液 ，并煮沸以进行TVA结合蛋白的蛋白质印迹分析。 　　RS4; 11个靶细胞使用细胞跟踪远红细胞增殖试剂盒（Invitrogen
，c34564）进行染色，然后以1：5的比例（2×105靶细胞）在平坦的24孔板板中与PBMC共培养24小时 ，该均为2×105靶细胞
，均为蓝布（blinatumobomab（0，100 ，100，10
，10，10 ，106 pbmc））输注（由W.S.实验室提供） 。将细胞混合物重新悬浮在流式细胞仪染色缓冲液中
，并使用可固定的活力染色器（R＆D）染色，然后通过流式细胞仪进行分析
。 　　总共将63,000个抗人CD19-CD28Z-GFP CAR-T细胞（由J.K.实验室提供）在T型细胞膨胀培养基（Stemcell）中培养 ，并在20μmTVA的情况下
，IL-7（5 ng ml-1）和IL-15（5 ng ml-1）和IL-15（5 ng ml-1）培养。在第2、5
、7和9天，在存在或不存在20μMTVA的情况下 ，将培养基更改为新的培养基（在存在或不存在20μMTVA的情况下IL-7和IL-15） 。在第7、9和10天计数细胞数
。 　　所有统计分析均使用GraphPad Prism 9进行。未配对的双向学生的t检验进行了数据统计分析
，除了进行双向方差分析测试以进行细胞增殖测定和肿瘤生长分析 。P值小于0.05被认为是显着的
。具有误差条的数据代表平均值±S.D。所有数据数字均代表至少三个独立实验，或两个独立的实验（扩展数据图4H ，右） 。所有复制尝试都是成功的。 　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得
。