作为抗生素和免疫反应（AIR）研究的一部分 ，在2017年4月至2021年3月之间，在澳大利亚阿德莱德妇女和儿童医院的研究中招募了婴儿。研究护士在产后病房中与潜在的参与者接触
，并邀请如果母亲及其婴儿符合研究资格标准 。先前还通过产前护理包的小册子向妇女和儿童医院分娩的妇女提供了研究信息。遵循书面知情同意书，向家庭提供了粪便收集包 ，并审查了医疗案件以确认资格标准和抗生素暴露状态
。该研究的伦理批准是从妇女和儿童健康网络的人类研究伦理委员会（批准号HREC/17/WCHN/19）获得的
，作者确认他们遵守了所有相关的道德法规。 　　排除标准的妊娠不到37周；孕产妇体重指数大于30（在初期产前访问时）；孕产妇败血症（由实验室确认的血液培养物或脑脊液中的细菌感染定义）；剖腹产分娩的婴儿；确认婴儿的败血症（由实验室确认的细菌感染在血液培养或脑脊液中定义）；免疫系统的已知或疑似疾病，可以防止对疫苗的免疫反应 ，例如先天性或获得的免疫缺陷
，或接受全身免疫抑制治疗；患有怀疑或确认的艾滋病毒，主要先天性异常或严重疾病的婴儿；孕产妇或婴儿参与一项可能干扰参与这项研究的临床研究；任何会使个人处于增加风险或完全遵守研究或完成研究的任何事情 。对于免疫原性分析 ，仅包括至少接受研究访问1疫苗1的参与者
。 　　根据病历审查和与母亲的讨论
，将参与者分配给抗生素暴露组进行免疫原性分析，以确定在研究时疫苗接种前的任何抗生素暴露 ，请参观1（约6周龄）。抗生素暴露组的先验定义为：没有直接或母体抗生素暴露的婴儿（n = 80
，no-abx）；（1）在新生儿期（出生后的前28天）接受至少48小时抗生素治疗的婴儿，有或没有母体抗生素暴露（n = 32 ，neo-abx）；（2）母亲接受了产前抗生素的婴儿（在分娩前或分娩期间的28天内），并且没有直接的婴儿抗生素暴露于6周龄（n = 49
，IP-ABX）；（3）不符合NO-ABX，NEO-ABX或IP-ABX组的标准的婴儿 。研究完成后 ，第3组中的所有婴儿都是在产后prevaccination期间母乳喂养期间可能会暴露于母体抗生素的婴儿
，因此我们称该组为产后暴露组（PN-ABX，n = 30）
。进行血清学测定 ，OMICS分析和其他数据分析的研究人员对抗生素暴露组分配视而不见。参与者的数据记录在安全的RedCap（https://project-redcap.org/）数据库中 。 　　父母在第1周（生命的第2-10天）和第6周（生命的第38-56天）从每个婴儿的尿布（尿布）中收集了元基因组学的粪便样品
，并将其放入Zymo DNA/RNA Shield Faecal Collection Tubes（Zymo Research）中，然后存储在-80°C下
。在大约6周 ，7周
，7个月零15个月中，从婴儿那里获得血液（3-5毫升）。在6周时 ，将1-3毫升的全血液放入BD真空吸管中
，将2 mL放在Paxgene血液RNA管（BD）中，以保存RNA ，并存储在-80°C下 。在7周时，在BD真空吸尘器K3 EDTA管中收集了多达1 mL的血液
，收集了2 mL进行流式细胞仪分析，然后将其余的（最多2 mL）放入Paxgene（BD）管中
。在7个月零15个月时 ，将3-5毫升的血液收集到BD真空吸管中。 　　婴儿在6周和4个月大的6周和6个月大的6周和6个月大的PCV13（Prevenar 13
，辉瑞）和6英寸1-1疫苗（Infanrix Hexa，GSK）中接种疫苗 ，口服轮状病毒疫苗（Rotarix
，GSK，GSK ，GSK
，GSK）在6周和4个月的年龄较大，同时在澳大利亚的年龄上均与2017年的疫苗相同 。B出生时B疫苗（H-B-VAX II儿科或ENGERIX B儿科）。这项研究中的婴儿还在7周 ，4个月零6个月大时接受脑膜炎球菌B疫苗（4cmenb/bexsero
，GSK）的疫苗接种，并在12个月大时接受增强剂量
。脑膜炎球菌ACWY（Nimenrix ，Pfizer）和麻疹，腮腺炎
，红宝石（M-M-R II，Merck Sharp＆Dohme;或Priorix ，GSK）疫苗在12个月大时使用
，作为标准NIP时间表的一部分（尽管在这项研究中未评估这些抗体反应的一部分）。在这项研究中，PCV13的助推器剂量是在15个月的时间内提供的 ，而不是当前的NIP计划时间点12个月 。除口服轮状病毒疫苗外
，所有疫苗均肌肉内施用
。所有疫苗均按照澳大利亚免疫手册的建议一致。 　　如先前所述的13,15,16，测量了针对PCV13血清型的抗体 ，并进行了修改 。简而言之
，将生物质量COOH-Microspheres（6.25×106，500 µL ，Bio-Rad）与1×PBS pH 7.2（Life Technologies）的PER Schlottmann等人相结合过夜
。最佳涂料剂量为1：1剂量
，500 µl微球，500 µL DMTMM修饰的多糖用于血清型1、3 、5、7F和9V；和1：0.5剂量 ，500 µL微球，具有250 µL DMTMM修饰的多糖4
、6a
，6a，6b ，14、18c
，19a，19a ，19a
，19f，23F ，23F
，23F和11A。 　　在含有0.05％tween-20，2％N-丁基苯甲甲酰胺（2％n-butylymide）的吸附剂缓冲液中稀释了人类敌人胶囊国际参考标准的十个步骤 ，三个连续稀释
，007SP（NIBSC），两个内部质量控制和测试样品 。诊断）持续30分钟以去除非特异性抗体 ，然后再与多糖偶联的微球孵育
。将相当体积的（25 µL）的稀释样品和珠混合物含有每个区域的4,000微球含量，并在多屏滤板（Merck）上组合在用50 µL的0.05％PBS（PBS-T）（PBS-T）的多杆过滤板（Merck）中。将板在室温下在黑暗中在轨道振动器上以500 rpm孵育20分钟 。然后将它们用100 µL 0.05％PBS-T洗涤两次
，然后再添加100 µL（1：150）RPE偶联的山羊抗人IgG FC FC二级抗体（Jackson Immunoresearch Laboratories Inc.），再孵育20分钟
。洗涤后 ，将珠子重悬于125 µL 0.05％PBS-T中
，并在Bio-Plex-200机器（Bio-Rad）上读取。 　　如先前所述的14,42，测量了针对百日咳毒素 ，胸膜血凝集素
，破伤风类毒素和二骨毒素的抗体浓度 。 　　如前所述，对抗HIB-PRP和HB-SAG的抗体进行了测量 ，如白喉
，破伤风和百日咳（DTP）14,42，仅改变了抗原涂覆的微球 ，质量控制和所使用的参考血清。简而言之
，将DMTMM-MODIFIED41 HIB-PRP 12/306（NIBSC）偶联到Bio-Plex COOH-MICRopheres（Bio-Rad），如上所述 ，用于肺炎球菌多糖，最佳剂量
，最佳剂量为1：1，500 µl微粒 ，具有500 µl Microspheres
，具有500 µL DMMMCHACCHACCHARIFID proys chrys conuccrified proysmmchmchudified proys conudified
。重组HB-SAG亚型ADR（prospec Bio）与先前针对DTP抗原相结合，最佳涂层浓度为10 µg mL-1。对抗H的国际标准的十个步骤 ，三个连续稀释 。在该血清中确定了抗Hb-SAG滴度后
，将B型B型B型，09/222（NIBSC）用作参考血清
。使用最终的Bio-plex方案 ，使用第二个反HB-SAG（NIBSC）的第二个国际标准对09/222的抗HB-SAG滴度进行了定量；使用当前的金色标准方法
，即Alition I Anti-HBS试剂盒（PathWest），进一步验证了它们 ，该方法表现出极好的一致性（变化的系数小于5％）。 　　轮状病毒IgA抗体通过经过验证的酶联免疫测定法测量
，如前所述17,18 。 　　对于评估的每种抗原，高疫苗反应者和低疫苗反应者分别定义为在第75个百分位和第25个百分位数中具有IgG滴度的婴儿
。 　　使用先前发表的方法43,44在三种血清型（6B ，9V和18C）上进行了多重发肠化核细胞增多症测定法。血清样品在56°C下热灭活30分钟；然后，制作了连续稀释液
，并在96孔U孔的微滴定板（Interpoth Services）中以每孔的每孔为单位进行20μl 。使用了三倍稀释液
。将靶性肺炎球菌的冷冻等分试样融化，用打击缓冲液洗涤（含镁和钙的HBSS和0.1％明胶） ，并稀释至每种血清型的5×104 CFU ML -1。然后将所有血清型放在一个细菌悬浮液中
，并将10μl细菌悬浮液添加到每个孔中 。将板在室温下与摇动（微型轨道振动筛；贝尔科生物技术）在700 rpm中孵育30分钟
。然后，将10μl的婴儿兔补体和40μl的HL60细胞（约1×107个细胞ML -1）添加到每个孔中（使用前用HBSS洗涤HL60细胞两次）。将板以700 rpm的摇动在组织​​培养孵化器（在5％CO2大气中的37°C）中孵育 。45分钟后 ，将板放在冰上以停止反应
，并将10μl的最终反应混合物发现在补充有0.5％酵母提取物的Todd-Hewitt琼脂板上。将含有一种选择性抗生素（靶细菌的选择性标记）之一的叠加琼脂添加到TODD-HEWITT琼脂板之一中，然后将其在37°C下用5％CO2孵育过夜
。使用方案3自动菌落计数器列举了细菌菌落的数量（合成菌病）。结果表示为打击指数 ，定义为杀死50％细菌的血清插值稀释液 。测定中检测的下限为4
。出于分析目的
，未杀死50％细菌的样品的调子指数被报告为2。截止值8用于定义正响应 。 　　如先前所述，对140个匹配的研究参与者的血清样品进行了人类血清杀菌活性测定（从6周 ，7个月和15个月的研究中抽血）进行了45
。简而言之
，在测定缓冲液中连续稀释热灭活的研究参与者血清，并用大约1×103 cfu的脑膜炎N.脑膜炎菌株NZ98/254接种。加入外源的人类补体（25％v/v ，pel-freez生物学），并在37°C下用5％二氧化碳在37°C下孵育60分钟；然后
，将样品铺在使用倾斜方法制备的GC琼脂底板上，并在37°C下与5％CO2孵育过夜 ，以实现CFU枚举 。据报道
，杀菌性滴度是参与者血清最低稀释的互惠，相对于NO-NOSERUM对照 ，诱导至少50％的杀伤力
。脑膜炎链球菌保护的血清学相关性被认为是大于或等于4的人血清杀菌活性滴度（参考文献22）。使用单向方差分析和两尾配对的学生的t检验进行统计分析 。 　　为了进行流式细胞仪分析
，将450 µL的婴儿血液从收集到3小时内的10 mL管中从BD真空吸管K3 EDTA管转移到无菌的10 ml管中，并在室温下添加4.5 mL的1×BD Pharm Lyse裂解红细胞
。然后 ，通过在200g离心5分钟通过离心颗粒
，将上清液吸出，然后将细胞沉淀重悬于10 mL流式细胞仪缓冲液中 ，然后再次离心。随后将细胞重悬于150 µL流式细胞仪缓冲液中
，并平均分为三个试管进行染色 。FC受体首先在冰上使用明亮的染色缓冲液（BD）中的人类信任FCX（Biolegend）封闭10分钟。设计三个面板用于当天流式细胞仪分析（有关每个面板中鉴定的细胞集的完整列表，请参见补充表8）
。面板1是一个泛白细胞面板 ，可鉴定中性粒细胞，单核细胞
，树突状细胞，嗜酸性粒细胞 ，嗜碱性粒细胞
，T细胞，B细胞 ，B细胞和天然杀伤细胞。用抗CD3 FITC（HIT3A
，1：20，BD Biosciences） ，抗CD11C PE（B-Ly6
，1：20，BD Biosciences） ，抗HLA-DR APC-H7（G46-6-6
，1：40，BD Biosciences ，BDI-CD15 V515 V515 V515 v5，Hy98
，抗CD11C PE（B-LY6，1：20 ，BD BIOSCIENCES）
，抗CD11C PE（B-LY6，1：20 ，BDBC-H7（BD）
，抗CD11C PE（B-LY6，1：20 ，BBD BISCIENCE）
，抗CD11C PE（B-LY6，1：20 ，BBD BISCIENCE）
，将细胞染色 。抗CD45 BUV395（HI30，1：80 ，BD Biosciences），抗CD16 BV421（3G8
，1：143，BD Biosciences） ，抗CD14 AF647（MOP-9
，1：1：1：143，BD Biosciences）anti-CD56 PE-Cy7 (5.1H11, 1:40, BioLegend), anti-CD19 BV605 (HIB19, 1:80, BioLegend), anti-CD20 BV786 (2H7, 1:80, BioLegend), anti-FcεRIα PerCP Cy5.5 (AER-37, 1:80, BioLegend) andAnti-Siglec8 PE Dazzle（7c9 ，1：143
，Biolegend）
。面板2启用了大约20个B和T细胞功能子集的表征，包括幼稚 ，中央记忆和效应子记忆CD4+和CD8+ T细胞；调节性T细胞；和天真的记忆和血浆B细胞。抗体鸡尾酒由抗CD19 PE（Hib19
，1：10，BD Biosciences） ，抗CCR7/CD197 AF647（150503
，1：10，BD Biosciences） ， anti-CD127 BV421 (A019D5, 1:40, BioLegend), anti-CD38 BV510 (HIT2, 1:40, BD Biosciences), anti-HLA-DR APC-H7 (G46-6, 1:40, BD Biosciences), anti-CD3 BUV395 (UCHT1, 1:40, BD Biosciences),抗CD4 BV605（RPA-T4，1：80
，BD Biosciences），抗CD8 CY7（RPA-T8 ，1：80
，BD Biosciences），抗IGD PERCP CY5.5（IA6-2 ，1：80
，BD Biosciences），抗C-CD27 BV7BV711（L128）抗CD25 PE Dazzle594（M-A51 ，1：80
，Biolegend），抗CD20 BV786（2H7 ，1：80
，Biolegend）和抗CD45RA FITC（HI100，1：1：1：143 ，Biolegend） 。面板3旨在使用抗CD3 BUV395（UCHT1，1：1：50
，BD Biosciences），抗CD4 BV605（RPA-T4 ，1：RPA-T4
，1：RPA-T4，1：100 ，BD BISCIESCESS
，ANT），Anticiences ，Anty-ant Icciences
，Anti-tpa，alti-tpa ，使用抗CD3 BUV395（UCHT1
，1：50，BD Biosciences） ，使用抗CD3 BUV395（UCHT1，1：50
，BD Biosciences）评估特定的T辅助子集，包括TH1 ，TH2
，TH9，TH9 ，TH17
，TH22和自然杀手T细胞
。BD Biosciences), anti-CXCR3 BV421 (1C6/CXCR3, 1:100, BD Biosciences), anti-CCR10 APC (1B5, 1:100, BD Biosciences), anti-CCCR6 BV711 (11A9, 1:50, BD Biosciences), anti-CCR4 PECF594 (1G1, 1:50, BDBiosciences），抗CD45RA FITC（HI100 ，1：100
，Biolegend）和CD1D-TET PBS57 PE（1：5,000，NIH）。有关抗体源 ，目录数和荧光团的综合列表
，请参见补充表8 。 　　添加每种抗体鸡尾酒后，将样品在冰上在黑暗中孵育30分钟 ，然后洗涤并重悬于300 µL的流式细胞仪缓冲液中
。将面板1添加到BD Trucount FACS管（BD）中，而面板2和3添加到圆底的5-mL FACS管中
，并与10 µL液体计数珠（BD）一起添加。如前所述25产生计数 。通过添加DNA结合染料DAPI染色，并将其排除在分析之外
。使用FACSDIVA软件在FACSymphony（BD）流式细胞仪上运行样品 ，并使用FlowJo V.10.6.1（Tree Star）分析结果。 　　根据制造商的说明
，使用Paxgene Blood RNA试剂盒（QIAGEN）进行RNA提取和消除基因组DNA，并最终洗脱为80μlRNase无RNase水 。进行了进一步的RNA沉淀反应。简而言之 ，将RNA重悬于2.5×100％乙醇和10％乙酸钠中
，并在4°C下以12,000g旋转30分钟
。在75％乙醇中洗涤样品。将颗粒气干燥，并重悬于40 µL无RNase水中 。使用Bioanalyzer 2100/Tapestation（Agilent）和Qubit（Thermo Fisher Scientific）确定总RNA产量
。在文库制备之前 ，将0.2 ng的合成参考RNA标准标准（亮片
，Garvan Institute）添加到250 ng的RNA中。 　　根据制造商的指示，使用Nugen Univers Plus MRNA-Seq库套件 ，将总RNA转换为链特异性的Illumina兼容测序文库
，并根据制造商的指示（MO1442 v.2），并具有任何耗尽的探针和自定义的Gamma Globin耗竭 。简而言之 ，将250 ng的总RNA选择，并在逆转录之前将mRNA分散
。根据制造商的说明
，在用汇集的伽马耗尽寡寡寡中进行链选择II互补DNA（cDNA）之前，进行了任何耗尽和自定义的伽马球蛋白耗竭。最终修复所得的cDNA ，然后连接光明的条形码测序适配器 。cDNA库是链选择的
，并在使用贴纸（安捷伦技术）进行质量控制评估之前将12个周期放大了12个周期
。使用量子荧光测定法（Thermo Fisher Scientific）评估文库浓度。测序池是通过根据量子测量值混合兼容样品库来产生的 。使用Illumina Novaseq 6000 S1流动池对图书馆池进行测序，该流量单元具有2×100 bp配对的读数
。 　　使用FASTQC V.0.11.4（参考46）评估了序列阅读质量 ，并用MultiQC V.1.8（参考文献47）进行了总结
，然后使用Trimmomatic v.0.38（参考48）进行质量控制，窗口尺寸为4 ，平均质量得分为4
，平均质量得分为25。然后使用HISAT2 v.2.1.0（参考文献49）将通过所有质量控制步骤的读取与人类基因组（GRCH38）对齐 。基因计数矩阵是使用带有Ensembl v.93注释的联合模型的功能销售版本1.5.0-P2（参考文献50）生成的。然后将数据导入R v.4.2.0进行进一步分析
。使用EDGER v.3.38（参考文献40）中M值方法的修剪平均值进行标准化，然后进行多维缩放分析和使用GLMLRT函数进行的差异基因表达分析。对于比较第6周和第7周的差分表达分析 ，使用了配对设计
，将每个参与者拟合到模型和每个时间点 。随着每个参与者的样本进行处理，这种本质上控制了批处理效应
。为了进行非对比较 ，将处理批处理和婴儿性别安装在模型中以调整这些影响。使用SVASEQ v.3.46.0（参考文献38）鉴定了未知的变异来源，并在多维缩放和基因集变异分析之前进行了调整 。在差异表达分析之前
，对基因计数基质进行过滤以消除15个样本中的每百万次数少于5个
。Benjamini – Hochberg方法用于校正多个比较。使用FGSEA R软件包v.1.22.0（参考文献39）进行基因集富集分析，并具有预定义的BTMS24 ，输入等级为EDGER计算出的倍数变化 。使用R Bioconductor package GSVA V.1.44.1（参考文献51）
，使用了每个BTM的基因组变异分析来计算每个BTM的每样本活性评分（不包括标记为“ TBA”的未注释的模块）
。。使用hmisc v.4.7-0软件包在R v.4.2中进行了Spearman相关分析 。 　　从Zymo DNA/RNA屏蔽粪收集管（Zymo Research）中的两毫升粪便悬浮液转移到无菌的微输出管中，并在4°C下以16,200G离心20分钟
。然后除去上清液 ，然后使用Powerlyzer Powersoil Kit方案（Qiagen）在粪便颗粒上进行DNA提取
，如前所述52。 　　如前所述53，使用基于SYBR的测定法确定样品中样品中的总细菌载荷通过16S核糖体RNA（RRNA）基因的定量PCR（QPCR）确定 。每个QPCR反应包括1×Powerup Sybr绿色主混合物（由Thermo Fisher Scientific应用生物系统） ，每个正向和反向引物的0.2 µM
，在35 µL的总反应量中1 µL DNA。然后将每个反应等分为10μL的三个技术重复，进行qPCR分析
。根据大肠杆菌基因组DNA的连续稀释液产生的标准曲线 ，计算了16S rRNA基因拷贝的数量
，并针对每个样品的粪便重量（以毫克为单位）进行了归一化。 　　如前所述，生成了shot弹枪宏基因组学库54 。简而言之 ，使用nextera dna XT文库制备试剂盒为具有至少0.2 ng µl -1的DNA浓度的样品生成文库，并使用Nextera XT Index Kit Kit Kit V.2（Illumina）进行索引
。使用生物分析仪（Agilent Technologies）上的DNA 1000芯片进行了PCR富集后DNA片段大小的质量控制检查。在Novaseq 6000平台（Illumina）上
，所有浓度为5 nm及以上浓度的文库均为配对测序（2×151 bp） 。 　　使用FASTQC V.0.11.4（参考文献46）评估读取质量，并用MultiQC v.1.8（参考文献47）进行了总结
。使用Cusadapt v.1.18去除适配器 ，并使用Trimmomatic V.0.38（参考文献48）进行质量过滤和修剪
，窗口尺寸为4，平均质量得分为25 ，最小长度为50个核苷酸。使用Kraken2 v.2.1.1（参考文献55）估算每个样品的人DNA的百分比 。通过使用Metaspades v.3.15.2（参考文献56）单独组装409个样品中的每一个
，生成MAG垃圾箱
。然后将读取与此组件目录对齐，并将映射的输出用于binning与metabat2 v.2.15（参考文献57）。然后 ，根据Bowtie2 v.2.5.0输出的SAM文件计算每个箱的计数 。每个MAG BIN都使用GTDB-TK V.2.1.0和参考数据版本释放207（参考文献58）对每个MAG BIN进行分类分类
。然后将此MAG BIN计数矩阵进口到R中进行进一步分析。在使用条形图可视化之前
，将计数数据转化为相对丰度，并通过在R库Theryseq V.1.28中实现的CLR进行标准化 。用linda进行了差异丰度分析 ，并在r库Microbiomestat v.1.18中实现
，原始计数数据作为输入。在使用Prev
。在Linda59中测试前的样品中，对在至少5％的样品中检测到的分类单元的计数进行过滤。使用基本R中的函数将Spearman相关分析与CLR归一化数据作为输入进行 。使用Thyloseq V.1.28（参考文献60）在R中进行了α和β多样性分析
。将元基因组样品聚集到CST中 ，其中具有差异性多项式混合物建模（r包装dirichletmultinomial v.1.38.0），并使用最低的laplace近似值计算出最佳的簇数。质量过滤的读数也被用作Humann v.3.0（参考文献61）的输入
，用于生成微生物途径数据，并求和以表示每个Metacyc途径和基因本体论项的计数（仅生物学过程） 。途径计数数据也被化为CLR归一化
。为了说明样品之间16S rRNA拷贝数的变化 ，这可能会使细菌负载的QPCR估计有偏见
，每个样品的平均拷贝数是根据从shot弹枪元素数据中的物种级相对丰度曲线和RRNDB62的拷贝数中计算出来的。通过使用Prodigal V.2.6.3对MAG的编码蛋白序列的预测分析抗菌抗性基因，以95％的身份以CD-HIT v.4.8.1的身份聚类 ，并使用TransSeq使用TransSeq生成非冗余预测蛋白质的蛋白质 。使用电阻基因标识符（v.5.2.1）的综合抗生素抗性数据库（v.3.2.1）与非杂种目录对齐
，除了添加“ –exclude_nudge ”外
。通过使用Bowtie2对基因目录进行对齐读数，并通过Samtools v.1.17产生按样本计数来产生人均计数。每千座读数为每百万映射的读取值是在r中产生的 ，用抗生素类别总结
，并使用Wilcoxon秩和测试进行了比较，从而控制了与Benjamini – Hochberg方法的多次比较 。通过中介R套件（v.4.5.0）28在R中进行因果中介分析
。 　　C57BL/6J小鼠（杰克逊实验室； RRID：IMSR_JAX：000664）在南澳大利亚州卫生与医学研究所（SAHMRI）的特定和机会性病原体（SPF）条件或gnotobiotic条件下进行了繁殖和维持。将SPF小鼠保存在笼子里 ，可以自由获取商业颗粒食品和水
，并在标准化条件下容纳具有调节的日光，湿度和温度 。gnotobiotic（GF）C57BL/6小鼠（翻译研究所）被安置在SAHMRI临床前 ，成像和研究实验室（PIRL）的积极加压的HEPA过滤隔离器（PIRL）中，并访问了可产生的食产品
，并供应了经济植物的食品，并与2小时的5小时杂物及其量身定制的杂物（4小时）（18–24°C）。所有实验均根据SAHMRI动物伦理委员会批准的方案进行
。每个疫苗实验都是作为独立实验进行的。使用相等数量的雄性小鼠 。年轻小鼠（大约3周）或大坝（8-16周龄） ，幼崽被随机分为治疗组
。研究人员没有对小鼠治疗组视而不见。根据我们以前的小鼠疫苗实验的数据确定鼠实验的适当样本量 。 　　GF小鼠大坝及其幼崽仍保持GF（根据粪便样品和16S rRNA基因qPCR培养）或以前描述的63被定植
，并通过与双歧杆菌种类的联盟进行口腔饲养，该物种由B. breve组成的双歧杆菌种类（DSM 20213 ，Leibniz Institute）
。iftantis（DSM 20088）在大约14天后（E14）
，第7天和第14天出生后。通过培养和桑格测序证实了成功的殖民化 。为了进行培养，将富含1 mg Ml -1半胱氨酸的MRS Agar（Thermo Fisher Scientific）将双歧杆菌分离株分离 ，并分离出单个菌落
，并使用MALDI BIOTYPER（BRUKER）（BRUKER）确认，并使用BD Gaspak Pouch Systems（BD）在37°C下培养48 h
。为了评估商业上可用的益生菌的给药是否可以恢复对PCV13的抗体反应 ，在生命的第21天
，用2×107 CFU L. cfu L. cfu L. cfu L. cfu L. cfu L. cfu和B. bifidum从商业益生菌的Forroran（Laboratoric Farmatorio farmaceatiCo）殖民了GF小鼠。同样，将进一步的GF小鼠与2×107 CFU一起定植 ，每个菌株单独地殖民 。通过将成熟的成熟液连续稀释到含有半胱氨酸的嗜酸杆菌或增强的梭菌琼脂（Thermo Fisher Scientific富含半胱氨酸）的嗜酸乳杆菌和双歧杆菌培养物中，以在厌氧条件下为双歧杆菌
。使用Maldi Biotyper（Bruker）鉴定出单个菌落。用Murinus（DSM 20452）
，Gallinarum肠球菌（DSM 24841），akkermansia Muciniphila（DSM 22959） ，细菌酸性（DSM 15896）
，Blautia（Blausia lacyab）（Blausia lactob）（dsm 15896），将另外21天的GF小鼠享年21天 。Plantarum（ATCC 202195 ，全球生物库中心）或肠杆菌1。 　　在MyD88 - / - 
，TLR2 - / - 和TLR4 - / - 小鼠中产生窝窝型野生型和基因敲除小鼠，对杂合的MyD88 +/- ，Tlr2 +/-和Tlr2 +/-和Tlr4 +/- dam（8-12周）与年龄的杂质MyD88 +/-
，Tlr2 +/-，Tlr4 - / - 小鼠hyters Heters hertere
。同等数量的野生型和敲除后代共同进行研究。 　　小鼠用3μgPCV13（辉瑞） ，8μgInfanrix HEXA组合疫苗（GSK）或17.5μgBexsero脑膜炎球菌血清组B疫苗（GSK）peastertone peist 28延迟
，并在同一dose延迟2周后延伸 。用100μlPBS对照小鼠进行模拟疫苗接种
。在每个实验中，每组四到八只性别匹配的小鼠接种或模拟疫苗接种。在每个实验中 ，在免疫后2和4周收集血清，在选定的实验中也收集了6和8周的血清 。 　　在每个实验开始时和每个实验时间点
，从小鼠中收集粪便样品，以确认小鼠的GF或定植状态
。无菌收集粪便颗粒 ，立即捕获冻干并储存在-80°C下。 　　分别称重粪便样品
，通过涡旋重悬于1 ml磷酸盐缓冲盐水（PBS）（pH 7.2）中，并通过13,000g离心5分钟 。使用Dneasy Powersoil试剂盒（QIAGEN）在粪便中进行微生物DNA提取 ，并进行以下较小的修饰：将粪便重悬于750μl的750μlPowersoil珠溶液中
，并在PowerSoil板中以​​65°C孵化为10分钟，以前在65°°C中孵化 ，以前均以10分钟的固定
。 　　如先前所述
，使用鼠粪便DNA提取物来产生16S rRNA基因的V4高变量区域的扩增子。63 。使用Illumina Miseq系统（2×300 bp运行）进行扩增子库的测序
。将配对的末端16S rRNA基因序列解散并导入Qiime2（发行2023.2）进行处理64。序列是错误校正的，每个样品的错误校正读数计数 ，我们将其称为精确序列变体
，用DADA2生成（参考文献65） 。使用SILVA v.138数据库66，将分类法分配给具有80％置信阈值的Sklearn插件的序列。精确的序列变体计数转换为相对丰度 ，并在r v.4.2.0中使用GGPLOT2 v.3.3.6绘制
。 　　如参考文献中所述，使用靶向16S rRNA基因的靶向保守区域的引物在Quant Studio 7 flex实时PCR系统（Thermo Fisher Scientific）上进行实时PCR。67 。每个反应包括5μLSYBR绿色QPCR（Thermo Fisher Scientific）
，每个前进剂0.2μm和反向引物，1μLDNA模板和无菌水为22μl的总反应体积
。每次运行中都包括一个无动dNA对照 ，用1μl无菌水取代的DNA。每个样品的实时PCR反应是重复的
，由每个反应的10μl组成 。放大程序为50°C 2分钟，95°C 10分钟 ，然后在95°C的40个循环和60°C的40循环中持续1分钟
。在程序末尾进行了熔融曲线分析。每个样品中的总细菌载荷是根据在同一运行中进行的大肠杆菌基因组DNA的标准稀释液的标准曲线进行了定量的
，可检测到3至3×106-等效的大肠杆菌细胞的范围内 。然后根据每个样品使用的粪便重量计算细胞数量
。Mann – Whitney测试用于评估统计意义。 　　通过从每个疫苗实验收集的血清中，通过酶联免疫吸附测定（ELISA）测量抗原特异性IgGtotal IgG1 ，IgG2C
，IgG3和IgM的水平 。简而言之，将NUNC MAXISORP ELISA平板（Sigma）与CRM197（0.5μgml-1 ，Finabio）
，PCV13疫苗（0.05μgml-1，Pfizer） ，Pfizer），肺炎球菌多糖（4μgml-1 pps1 pps1
，161- 161-161-161- pps atcc）涂覆
。169-X, ATCC), PPS6B (4 μg ml−1 105-X, ATCC), PPS9V (4 μg ml−1 305-X, ATCC) or diphtheria toxoid (1 μg ml−1, List Biological Laboratories), tetanus toxoid (1 μg ml−1, List Biological Laboratories), pertussis toxoid（1μgml -1，列表生物实验室）或Bexsero疫苗（2μgml -1 ，GSK）。用0.5％Tween-20/PBS洗涤板
，并用1×ELISA缓冲液（Ebioscience）阻塞 。将小鼠血清样品稀释在1×ELISA缓冲液中，并在阻塞的板上孵育。使用辣根过氧化物酶（HRP）结合的抗体检测抗原特异性血清抗体：抗小鼠IgG（NOVEX）或抗小鼠IgG1（ABCAM） ，以1：1,000或IgG2C
，IgG2C，IgG3 ORIGM（IgG3 OR IGM（ABCAM））稀释
。使用四甲基苯胺底物（Thermo Fisher Scientific）检测到HRP活性 ，并使用2 N H2SO4停止。使用Synergy HTX微板读取器（Biotek）在450 nm处记录了开发的板
，并通过减法在595 nm处进行校正 。使用Prism 10（GraphPad）分析数据
。 　　通过70 µm尼龙滤波器（Merck Millipore），通过机械解离和过滤制备鼠脾或淋巴结的单细胞悬浮液。用可固定的活力染色780（BD生物科学）和鼠FC阻断抗体克隆2.4G2（1：100 ，BD Biosciences）在PBS中染色15分钟 。Cells were washed and then stained with fluorochrome-conjugated antibodies in FACS buffer (PBS, 0.1% bovine serum albumin, 2 mM EDTA) against CD3 (142-C11, 1:300, BD Biosciences), CD4 (RM4, 1:300, BD Biosciences), CD8 (53-6.7, 1:600, BD Biosciences), CD19（1d3
，1：300，BD Biosciences） ，CD38（90，1：600
，Biolegend），CD44（IM7 ，1：600
，BD Biosciences），CD62L（Mel-14 ，1：1：1：1：600
，BD Biosciences），CD95（CD95Biosciences） ，B220（RA3-6B2
，1：600，BD Biosciences） ，CXCR5（L138D7
，1：200，Biolegend） ，GL7（GL7，1：600
，BD Biosciences），Igd（IgdPD-1（RMP1-30 ，1：300
，BD Biosciences）和链霉亲和素PECF549（1：400，Biolegend）
。 　　为了评估CRM+ GC B细胞 ，用可固定的生存力染色780（1：1000
，BD）和鼠FC块（1：100，BD）在PBS中染色15分钟；然后 ，将它们与FACS缓冲液中的生物素化的CRM（1：100
，Fina Biosoloses）一起洗涤并孵育。在4°C染色20分钟后，直接添加表面抗体鸡尾酒 。数据是在BD FACS交响曲上获取的 ，并使用FlowJo V.10进行了分析
。为了评估CD86
，CD80和MCHII表达，用僵尸固定的可固定可行性染色780（1：1000 ，Biolegend）和鼠FC-Block-Blockododer抗体抗体2.4G2（1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：bd Biosciences），将单细胞悬浮液染色。将细胞洗涤
，然后用CD19（ID3，1：200 ，BD）
，CD3（145-2C11，1：150 ，BD Biosciences）
，CD8（53-6.7，1 2003-6.7 ，1 200
，100，1：200 ，100
，100，1 200 ，1 200，12c11
，pbs）（PBS，PBS ，0.1％牛血清白蛋白
，2 mm EDTA）用FACS缓冲液（PBS，0.1％牛血清白蛋白 ，2 mm EDTA）染色的细胞进行染色然后染色 。1：200
，bd），LY6G（1A8 ，1：600
，BD），B220（RA3-6B2 ，1：3000
，BD），CD11B（M1/70 ，1：500，BD）
，CD11C（HL3，1：400（PO3.3 ，1：150
，Miltenyi）和CD80（16-10A1，1：150 ，Tonbo Biosciences）
。 　　纵隔淋巴结在1 ml 4％多聚甲醛（Sigma）中固定4小时
，然后在1 ml 30％蔗糖溶液中在4°C中孵育过夜，然后如前所述嵌入OCT（Tissue Tek）（如前所述）68。在阻塞缓冲液（正常的山羊血清4％V/V（南跨科学） ，正常驴血清4％V/V（Stratech Scientific Apac）和牛血清白蛋白15％V/V（AUSGENEX））中
，将载玻片阻塞2小时 。用Triton X-100 2％V/V（Sigma）通透载玻片，并用CD16/32（1：1：1：1：1：1：100 ，BD Biosciences）和CD21/35克隆7E9（1：200）
，GL7（1：200），CD3 CLONE 17A2（1：200）（1：200）和IGD Clone 11-26c.2a（来自1：200）使用Leica TCS SP8X共聚焦显微镜获取图像 ，并在ImageJ中使用fiji69进行分析。 　　空气研究的主要目的是确定7个月大时对PCV13疫苗的抗体反应在抗生素暴露和未暴露的组之间是否有所不同，具体比较以下内容： 　　作为次要结果
，我们比较了15个月大时的PCV13疫苗反应，以及对抗体暴露和暴露的婴儿在两个时间点的抗体暴露和暴露婴儿中对Infanrix Hexa 6- inca疫苗（6英寸1 ，DTPA-HEPB-IPV-HIB）的抗体反应
。对基线预期滴度和性别的多变量线性回归调整了抗生素暴露组与评估疫苗抗原的IgG几何平均浓度之间的任何关联。通过拟合混合效应的多变量线性回归（包括参与者ID的随机效应）来评估每种疫苗抗原的IgG几何平均浓度
，从而评估了参与者ID的随机效应，从而进行了进一步的纵向分析 。多变量的逻辑回归用于测试抗生素暴露组与获得血清保护反应的婴儿比例之间的任何关联
。统计显着性定义为p <0.05。进行了进一步的敏感性分析 ，以评估关联对益生菌消耗
，配方消耗，基线IgG/IgA浓度 ，婴儿性别和妊娠时的鲁棒性 。空中研究还包括一系列探索性系统免疫学评估
，以根据每种数据类型的最佳实践进行分析，并如上所述
。测量取自不同的样品。所有统计测试均为双面；图图中指定了使用的特定统计分析 。 　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得
。