所有动物实验均由协议APLAC-12684实验室动物护理行政小组（APLAC）批准 ，所有实验均符合斯坦福大学的道德规范规定 。小鼠的环境温度为22°C ，湿度为40％，其光明周期为12小时（07：00–19：00） 。先前报道了3,16,27。Rosa-LSLTDTOMATO45 ，ROSA-LSL-TTA46 ，TETO-HMYC47，TERC-KO48和TRP53-FLOX49小鼠购自杰克逊实验室 。他莫昔芬（Cayman）通过在50°C下孵育30分钟，每5分钟混合每5分钟将5–20 mg ml-1溶于玉米油（Sigma-Aldrich） 。通过口服瘤或腹膜内注射 ，每25 g体重用0.25–4 mg他莫昔芬给予两到四个月的小鼠。将强力霉素（Sigma-Aldrich）溶解在1或3μgml-1的光保护瓶中 ，并每三到四天更换一次。将BRDU（Sigma-Aldrich）以10 mg ml-1的速度溶解在PBS中，并在安乐死前两个小时以每25克体重为1.25 mg的腹膜内注射 。
将TERT基因座的9-Kb片段取代 ，并在第二个内含子的BSIWI位置插入了PBS.DAT-LOXSTOP质粒（来自D. Tuveson的礼物）的Lox-Puro-lox盒 。在第六个内含子的Kasi位置插入了另一个LOXP序列和NDEI位点。将靶向载体线性化并电穿孔到J1小鼠ES细胞中 。在对紫霉素进行阳性选择后 ，通过远距离PCR和Southern印迹选择正确靶向的ES克隆，然后注入C57BL6胚泡中以产生敲门线 。为了去除Flox的Puro Cassette ，将敲入线与CMV-CRE小鼠交叉 ，并通过PCR选择了Puro-puro阴性Tert-lox-lox-loxed小鼠，并使用尾端的基因组DNA进行了Southern斑点。tertflox/+小鼠以正常的门德尔频率出生 。补充图1中提供了南部印迹的原始图像 。
他莫昔芬注射后 ，使用含有1 mg ML -1胶原酶IV（Worthington）的PBS中的细镊子将睾丸解散 ，并使用精细的小管，将其放置在冷PBS中。用荧光解剖显微镜捕获图像 ，并用imageJ测量斑块的数量和长度 。总补丁长度是通过将补丁编号乘以平均贴片长度来计算的 。
将cauda附子酰胺剖分为小块 ，并在单纯钾优化培养基（KSOM）中在37°C下孵育一小时，低于5％CO2，以使精子散发出来。然后用4％PFA固定收集的精子 ，并用血液镜计数 。
使用细镊子在含有1 mg Ml-1胶原酶IV的PBS中解离10分钟 ，在4°C下用4％PFA固定两个小时，用0.1％Igepal Ca-630（Sigma-Aldrich）在PBST中用0.1％Igepal Ca-630（pBST）和脱水和5％的PR氢介导（25％）固定在4°C下固定 ，固定为0.1％igepal ca-630（Sigma-Aldrich）固定 。在4°C下 ，75％，100％ ，75％ ，50％，25％）持续5分钟。在PBST中洗涤后 ，将小管在阻塞缓冲液中孵育（PBST中的0.5％BSA） ，然后在免疫射击免疫染色中与抗体在4°C下温和（COSMO BIO）中孵育两天。用PBST进行大量洗涤后，将小管与二抗在室温下阻止缓冲液中孵育90分钟 ，用PBST洗涤 ，然后用DAPI（矢量实验室）安装在Vectashield中 。图像是在Leica SP5共聚焦显微镜上捕获的，并在Photoshop CC或更高版本中进行处理 。根据连续的E-钙粘蛋白，GFRA1或TDTOMATO染色 ，对美国的合成（AS – A16）进行了视觉判断。使用以下抗体：抗RFP（ABCAM ，AB124754，兔多克隆 ，1：500稀释）；抗RFP（MBL ，M208-3，小鼠单克隆1G9和3G5 ，1：200稀释）;抗E-钙粘蛋白（R＆D Systems ，AF748，山羊多克隆 ，1：200稀释）；抗GFRA1（R＆D系统 ，AF560，山羊多克隆 ，1：200稀释）；和反量（细胞信号技术 ，3074，兔单克隆D13A2，1：200稀释） 。
将睾丸在4°C下用4％PFA固定过夜 ，固定在一夜之间 ，在乙醇和Xylen梯度中孵育，嵌入石蜡中 ，切成5μm的切片 。补液后 ，使用柠檬酸或基于Tris的抗原检索溶液（载体实验室）在压力锅中进行5分钟进行抗原检索。将切片用PBST中的0.5％BSA阻塞，并在4°C下与一抗孵育过夜 。用PBST洗涤后 ，将切片与室温下的二级抗体一起孵育1小时 ，并与DAPI一起安装在Vectashield中 。对于BRDU检测，将载玻片用2 M HCl处理20分钟 ，在PBST中用0.5％BSA封闭 ，并在4°C下与兔抗PLZF和大鼠抗BRDU抗体一起在一夜之间与RABBIT抗Brdu抗体一起孵育，并通过Alexa 488偶联的抗rat抗原Igg和Cy5-Con5-congigity检测到信号。为了使用兔抗RFP抗体和兔抗PLZF抗体进行染色 ，在PBST中以0.5％BSA封闭了切片 ，并用抗RFP抗体孵育，然后用HRP结合的抗RABBIT二级抗体在上述抗体中与抗RFP抗体一起孵育，如上所述 ，该抗体和信号均与Themane cyains cysan cysa Syne censa Syne cen and Sysa Syne censa Syne censa cyay plule 3 cyay plule 3 3 。信号检测后 ，通过抗原检索剥离抗体，并用其他抗体进一步染色 。对于使用兔抗RFP ，兔抗PLZF和兔抗MYC抗体的三重染色 ，使用TSA Plus Cyanine 3系统用抗RFP抗体对切片进行染色，并用抗原检测将抗体剥离。然后 ，将这些切片用TSA加荧光素系统（Akoya Biosciences）的抗MYC抗体染色 ，然后进行抗原检索以去除抗体 。最后，将切片用抗PLZF抗体和Cy5偶联的抗兔IgG进一步染色 。将幻灯片与DAPI一起安装在Vectashield。用于TDTOMATO的色彩染色 ， 将切片与抗RFP抗体一起孵育 ，然后用HRP偶联的抗体孵育。使用DAB底物试剂盒（向量实验室）检测信号 。切片用血久毒素染色，用乙醇和二甲苯脱水 ，然后安装在Clearmount（American Mastertech）中 。为了量化PLZF+细胞 ，从分析中排除了VII – VIII期中的生精小管，以防止纳入PLZF+早期DS细胞。图像在荧光显微镜上捕获，并在Photoshop中进行处理 。用imageJ定量MYC和PLZF的信号强度 。使用Leica Application Suite AF捕获免疫荧光数据 ，并使用Leica LAS 4.2捕获免疫组织化学数据。使用以下抗体：抗RFP（ABCAM ，AB124754，兔多克隆 ，1：500无TSA的免疫荧光稀释或1：3,000稀释的TSA免疫荧光）；抗Brdu（Bio-Rad ，MCA2483，小鼠单克隆BU201 ，1：500稀释）;抗GFRA1（R＆D系统 ，AF560，山羊多克隆 ，1：200稀释）；抗PLZF（Santa Cruz ，SC-22839，兔单克隆H-300 ，1：200无带TSA的免疫荧光稀释或1：5,000稀释的TSA免疫荧光）；抗切断的PARP（细胞信号技术 ，9548，小鼠单克隆7C9，1：500稀释）;抗γH2AX（EMD Millipore ，05-636 ，小鼠单克隆JBW301，1：2,000稀释）;和抗MYC（细胞信号技术 ，13987 ，兔单克隆D3N8F，1：500稀释） 。
如先前报道的51 ，进行了两步陷阱（端粒重复扩增协议）程序 。将整个睾丸中提取的馏分在三周后或将荧光激活的细胞分选（FACS）与端粒引物在PCR机中在30°C下在30分钟的初始扩展步骤中孵育 ，然后在72°C下灭活5分钟。在没有纯化的情况下，在存在32p端端标记的端粒引物的情况下 ，将1μl扩展反应放大（在94°C下的循环为30 s ，然后在59°C下为30 s） 。通过在室温下通过9％聚丙烯酰胺凝胶电泳解决PCR反应，并将凝胶暴露于磷光液成像仪中 ，并被台风扫描仪扫描 。使用Totallab Quant软件对扫描的图像进行量化。在至少两个重复中介绍了代表性的凝胶图像 。原始的未编工图像在补充图2中提供 。1和2。
将睾丸解散 ，在PBS中轻轻解离，并在含有1 mM EDTA，1 mg ML -1胶原酶I（沃辛顿）和DNase I（Worthington）的PBS中孵育8分钟。将细胞以250克离心5分钟 ，然后去除上清液 。重复胶原酶I处理后 ，将睾丸细胞在32°C下用Tryple Express（Gibco）进一步消化15分钟 。在酶促消化过程中，每5分钟将剧烈的移液器机械碎片进行机械碎片。将细胞用70μm和40μm滤网依次过滤 ，并重悬于冷FACS缓冲液（2％FBS和PBS中的1 mM EDTA）中 ，并在冰上与抗体在冰上孵育30分钟 。用PBS洗涤后，将细胞重悬于含DAPI的冷FACS缓冲液中 ，并用BD ARIA II（BD Biosciences）进行分析和分类 。使用BD FACSDIVA软件v.8.0获取流式细胞仪数据。使用FlowJo V.9软件分析数据 。使用以下抗体；带有PE/CY7的抗α6整合素（Biolegend ，313622，大鼠单克隆GOH3 ，1：150稀释）;与APC的抗MCAM（Biolegend ，134712，大鼠单克隆ME-9F1 ，1：200稀释）；和BB515（BD Biosciences ，564481，小鼠单克隆2B8，1：200稀释）的反量 。补充图3提供了门控策略。
为了制备睾丸细胞的细胞素玻片 ，如上所述制备单细胞悬浮液 ，并重悬于PBS中 。然后在室温下用4％PFA固定细胞10分钟 。洗涤后，将细胞重悬于PBS中 ，并在250克的细胞传播中重悬于5分钟。将载玻片在4°C下储存在70％乙醇中 。对于与TDTOMATO的抗体染色结合的端粒鱼 ，将载玻片在PBS中进行水合，并用含有0.5％BSA的PBST阻塞 ，然后在4°C下与抗RFP抗体一起孵育过夜 。用PBST洗涤后 ，将载玻片与HRP偶联的抗兔二抗在室温下孵育30分钟，并用PBST洗涤。使用TSA Plus Cyanine 3系统检测信号。对于端粒鱼类 ，用PBS洗涤抗体染色后的载玻片 ，并通过浸入70％，90％和100％乙醇中脱水 。After drying, slides were incubated in hybridization buffer (70% formamide, 10 mM Tris-HCl pH 7.4 and 0.5% blocking reagent (Roche)) containing 0.2 μM Alexa 488-conjugated telomere probes (PNA Bio) and 0.2 μM Cy5-conjugated centromere probes (PNA Bio) at 80 °C for 10 min and then at 4 °C一夜之间 。用含有10 mM Tris-HCl pH 7.4的70％甲酰胺洗涤载玻片 ，持续两次 ，然后用PBS洗涤15分钟，然后用DAPI将其安装在Vectashield中。图像在荧光显微镜上捕获，并在Photoshop中进行处理 。端粒总和信号和中心总和信号使用触发仪v.3.0.5确定 。使用抗RFP抗体（ABCAM ，AB124754 ，兔多克隆，1：500稀释）。
在标记后的五天内收集睾丸并将TDTOMATO+ US进行FACS分组 ，并在200g的玻片上进行5分钟的细胞传输 。在室温下将载玻片固定在4％PFA中30分钟 ，并使用RNASCOPE 2.5 HD试剂套件（高级细胞诊断）和针对小鼠TERT或TRP53（高级细胞诊断）的探针处理单分子RNA FISH的载玻片，并根据制造商的说明进行处理 。
对于QRT -PCR ，FACS将细胞直接分为Trizol LS（Thermo Fisher Scientific）。使用Direct-Zol RNA MicroPREP试剂盒（Zymo Research）纯化RNA ，并使用Oligo-DT和Superscript IV第一链合成系统（Thermo Fisher Scientific）合成cDNA 。对于TERT外显子2，TERT外显子6和小鼠MYC的QRT – PCR ，使用了Taqman Fast Advanced Master Mix（Thermo Fisher Scientific） ，以及通用探针库探针：否 。66对于TERT EXON 2，没有。93对于TERT外显子6 ，没有 。77用于鼠标MYC（Roche） 。对于其他QRT -PCR ，根据产品手册使用了Powerup Sybr绿色主混合物（Thermo Fisher Scientific）。使用7900HT快速实时PCR系统机器（ABI）进行PCR分析。底漆信息可在补充表2中获得 。
将US-H细胞通过FACS直接分类为TRIZOL LS，并使用Direct-Zol RNA MicroPREP试剂盒纯化RNA 。通过柱上DNase处理消化基因组DNA。RNA质量由Bioanalyzer 2100（Agilent）检查 。使用较智能的总RNA-Seq Kit V2-PICO输入哺乳动物（Clontech）构建RNA-Seq库，从5 ng总RNA开始 。根据手册合成并放大cDNA。rRNA去除步骤后 ，用13个PCR反应循环扩增cDNA 。Bioanalyzer 2100证实了纯化的cDNA库的质量 。在Illumina NextSeq平台上测序了库 ，每个库中的读数约为1600万-2400万75亿英尺配对。每个样品分析了四个生物学重复 。原始读取由Trimgalore V.0.4.0（Babraham Bioinformatics）修剪，由Tophat v.2.0.13映射到MM10 ，并通过DESEQ2进行了分析 。
使用OMNI-ATAC协议如前所述进行ATAC-SEQ库。对协议进行了调整 ，以反映本工作中介绍的细胞类型的两个主要特征 。首先，调节在每个反应中添加的TN5转座酶的量与分析的细胞数量保持相称性 。例如 ，正常反应在50μl反应中使用50,000个细胞和2.5μlTN5转座酶。在稀有的SSC的情况下 ，只能获得5,000个细胞，因此仅在50μl反应中使用了0.25μlTN5转座酶。使用水调节体积的差异 。其次 ，考虑了每种细胞类型的倍数 ，并且也根据倍性调整了TN5的量 。例如，圆形的精子细胞是单倍体 ，因此50,000个细胞的转座将在50μl反应中需要1.25μlTN5转座酶。同样 ，精子细胞是4N减数分裂细胞，因此TN5转座酶的量增加了比例增加，并且反应中的水量减少 。在所有情况下 ，无论细胞数或倍性如何 ，在50μl下保持换位反应的反应体积均保持恒定 。所有ATAC-SEQ反应均使用自制TN5转座酶和标记DNA Buffer53进行。如先前所述34,52,54，进行了库的下游扩增和纯化 。
使用Pepatac Pipeline（https://pepatac.databio.org/）完成了ATAC-SEQ数据的预处理 。MM10基因组构建（https://github.com/databio/refgenie）用于对齐。简而言之 ，首先修剪所有FASTQ文件 ，以使用“ -f Sanger - T 20 –M PE –X ”选项使用Skewer删除Illumina Nextera适配器序列 。fastQC（https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/）用于验证正确的修剪并检查整体序列数据质量 。然后将Bowtie2用于预先对准，以删除将映射到CHRM（修订后的剑桥参考序列） ，Alpha卫星重复序列 ，ALU重复序列，核糖体DNA重复序列和其他重复区域的读数 ，并使用“ -K 1 -D 20 -R 3 -N 1 -N 1 -L 20 -L 20 -L 20 -I s ，1,0.50 -i s，1,0.50 -x 2000 -x 2000 -rg -rg -id ”选项。然后使用Bowtie2使用“ - 敏感-X 2000 -RG-ID”选项与MM10参考基因组保持一致 。Samtools用于使用“ -f 2 -Q 10 -B-@ 20 ”选项进行排序和隔离映射读取 。Picard（http://broadinstitute.github.io/picard/）用于删除重复项。然后按条件合并BAM文件 ，并使用MACS2调用参数为“ -Q 0.05-NOMODEL-SHIFT 0 ”的峰。然后 ，通过编码7 HG19黑名单以及延伸到染色体末端的峰进行过滤狭窄的峰 。使用Multicov模块，使用BedTools检索每个样品的读取峰 。所有样品都具有相似的测序深度，线粒体速率和重复速率。与所有其他样品相比 ，精子细胞和圆形精子样品具有相似的测序深度 ，但是线粒体速率略高，重复速率较低 ，因此在初始处理和过滤后具有更多的最终读数 。为了使所有样品用于统计分析 ， 我们将最终读数用作归一化因子 。R软件包DESEQ2用于统计分析，以确定不同条件之间的显着峰值。在US-H CRER/+和US-H CRER/FLOX样品之间称差异峰 。FDR <0.01且倍数变化大于2或小于-2的峰被认为是显着的 。R包奇普检查器用于峰值注释。R包NGSPLOT用于可视化累积峰信号 。
没有使用统计方法来预先确定样本量 。所有实验的复制都超过两次 ，并在本文中进行了统计分析和呈现。在比较两组时 ，通过双面未配对的t检验确定p值 。在比较两组以上时，通过单向方差分析和Tukey的测试确定P值 。值表示为平均值±S.E.M.将小鼠随机分配给每个实验或对照组。统计和图是由R和GraphPad Prism 8中的GGPLOT2生成的。
有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得 。
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文章不错《克隆灭活TERT会损害干细胞竞争》内容很有帮助