使用了以下抗体：鼠标单克隆抗HA（Biolegend ，901503，稀释1：600用于免疫荧光（IF）和1：1,500的western blot（WB））
，兔多克隆抗HA，Sigma-Aldrich ，Sigma-Aldrich
，H6908，H6908 ，h6908
，h6908，for for for for for for for）A190-138A, dilution 1:600 for IF), rabbit polyclonal anti-actin (Sigma-Aldrich, A2066, dilution 1:10,000 for WB), rabbit polyclonal anti-NSP6 (ProSci, 9177, dilution 1:200 for IF and 1:1,000 for WB), sheep anti-NSP3 (The University of Dundee, DA126, dilution 1:100 for如果WB） ，兔多克隆ADRP/Perilipin 2（ProteIntech
，15294-1-AP，稀释1：200） ，兔单克隆抗DFCP1（细胞信号传导
，38419，38419 ，38419，稀释1：1,000
，WB），WB） ，小鼠抗flag（小鼠单声道抗frutive forifution for ifution for ifutive ifutive ifrifutif for 1;1:1,500 for WB), goat polyclonal anti-Flag (Bethyl, A190-101A, dilution 1:200 for IF), mouse monoclonal anti-c-Myc (Santa Cruz, sc-40, dilution 1:200 for IF), mouse monoclonal anti-GAPDH (Santa Cruz, sc-32233, dilution 1:1,000 for WB), mouse单克隆抗LAMP1（杂交瘤库
，H4A3，稀释1：200） ，兔子单克隆抗EA1（BD Biosciences
，610456，稀释1：1,000 ，如果是稀释）
，如果），if） ，绵羊抗人类抗-tgn46（Biorad
，Ahp500Gt，AHP500GT ，AHP500GT，ABCIN 1：750
，IF），IFP（IF） ，IFP（IFP）
，则为IFP（IFP）（IFP）（IFP）。ab6556, dilution 1:250 for IF), mouse monoclonal anti-GFP (Santa Cruz, sc-9996, dilution 1:2,000 for WB), mouse monoclonal anti-mCherry (Abcam, ab125096, dilution 1:2,000 for WB), mouse monoclonal anti-V5 (Thermo Fisher Scientific, R960-25, dilution 1:200 for IF and1：1,000用于WB），兔多克隆抗LC3（Novus Biologicals ，NB100-2220
，稀释1：200用于IF），小鼠单克隆抗DSRNA（Scicons ，10010500
，稀释1:10，用于IF） ，DAPI
，DAPI（SIGMA-ALDRICH，D9542 ，d9542，dimatif 1：if）if if inf inf inf）
，if If if 1：10,000 ravit for in If if）碎片（纳米探针，2004年 ，稀释1：50）
，鼠标1.4 nm金偶联的Fab'片段（Nanoprobes，2002 ，稀释1：50）
，Alexa Fluor-546 Fluoronanogold抗小鼠Fab’（7402，7402 ，7402
，7402， ， 稀释1:50）和Alexa Fluor-488-568-647（Invitrogen
，稀释1：400），辣根过氧化物酶（HRP）偶联的山羊抗小鼠或抗兔IgG IgG IgG抗体（1：8,000 ，Merck Millipore，401215或401215或4011313115.） 。如前所述31,32 　　Bodipy 493/503（4,4-Difluoro-1,3,5,7,8-戊甲基-4-Bora-​​3A
，4A-DIAZA-S-氨基烷），β-Bodipy fl C12-HPC（2-（4,4-二氟-5,7-二甲基-4-bora-3a ，4a-diaza-s-s-incenacene-3-dodecanoyl）-1-hexadecanoyl-sn-sn-glycero-3磷胆碱和BODIPIPY）和BODIPIPY 558/568/568-DA-DA-C12（4,4-二氟-5-（2-硫烯基）-4-bora-3a
，4a-diaza-s-incenacene-3-dodecanoic酸购自Thermo Fisher Scientific（分别为D3922，d3792 ，d3792和d3835）。（n- [（1z）-1-- [[4-（4-溴苯基）-4-羟基-1-二磷酸]羰基] - 2-苯基乙烯基] -benzamide] -benzamide] -benzamide）购自DGAT-1抑制剂A922500（A1737）
，沃尔特（A1737）（A1737）（S544）（S544）（S544）（S544）（S544）来自Sigma-Aldrich的强力霉菌（8D3447）和VPS34特异性抑制剂SAR405（HY-112481）从CalbioChem购买了35s-Methionine Labine labine for 35s-calbiochem
。（772007MC）从Perkinelmer购买。 　　All NSP constructs were made with the Gateway system (Thermo Fisher Scientific) using a modified pCDNA3.1 vector (containing a HA, Flag, Myc, GFP or mCherry tag) for amino-terminal tagging, a modified pCDNA5/FRT/TO vector (containing 3×Flag) for carboxy-terminal tagging, unmodified pCDNA5/FRT/TO to clone untagged NSP6, and用于稳定的强力霉素诱导NSP6细胞系的PLTD-FLAG或PLTD-HA 。所有网关矢量均由P. grumati提供
。供体质粒是PDONR207 SARS-COV-2 NSP3，PDONR223 SARS-COV-2 NSP4和PDONR223 SARS-COV-2 NSP6 NSP6 NSP6 NSP6 NSP6 NSP6（来自F. Roth的礼物 ，来自F. Roth
，Addgene Plasmids 141257，141257 ，141258和141258和1411260
，相应地）。对于NSP6的羧基末端标记，使用Agilent Quikchange套件的Oligo对NSP6 NS（+）/NSP6 NS（+）/NSP6 NS（ - ）（补充表2）除去终止密码子 。补充表2中描述的敏捷Quikchange套件和寡素套件用于使以下NSP6 N末端标记的突变体构建体：NSP6（1-157）（氨基酸1-157）；NSP6-C80（氨基酸211–290）;两亲α螺旋NSP6（F220Q/T222W）和NSP6-C80（F220Q/T222W）中的突变体;VOC突变体构建NSP6（ΔSGF）和NSP6（ΔSGF）–NSP7
。 　　NSP6 – NSP7序列由Thermo Fisher Scientific（补充表1）与侧翼ATTB序列合成（补充表1） ，PCR将V5 TAG添加到NSP7中，并将扩增子克隆到Gateway Vector PDONR223中
，并重新构成含有目的地Vector vector pcdna3.1含有pha-nsp6-sp7-sp7-sp7-sp7-v5。 　　IBV（鸟类感染性支气管炎病毒，M41菌株）NSP6序列（对应于从3089到3381位置的Uniprot P0C6Y3） ，用于人体表达优化
，并通过Thermo Fisher Scientifific GateRientific Taction in Tidention in Tidention in Tidention in Tidention in Tidention in Trake vector Vector Vector Vector Vector Vector Vector Vector Vector Vector Vector Vector Vector Vector Vector Vector Vector Vector pd2222在氨基或羧基终端 。寡核NSP6-IBV NS（+）/NSP6-IBV NS（ - ）（补充表2）用于删除羧基终端标签构建体的终止密码子
。 　　MCHERRY-DFCP1是D.-H的礼物。Kim（addgene质粒86746） 。PEGFP-ATF6是R. Prywes（addgene质粒32955）的礼物
。MCHERRY-卡罗蛋白N-N-16（M. Davidson，Addgene质粒55006） ，plenti-X1-Neo-GFP-ATL2（J. Corn
，Addgene质粒109020），PEGFPC-DFCP1和Pruby-N1-KDEL由P. Gramati提供。PEGFP-RAB18是M. Scidmore（addgene质粒4955）的礼物 。 　　补充表2中描述的安捷伦Quikchange试剂盒和寡素套件用于制作以下MCHERRY – DFCP1突变体构建体：DFCP1（Δ1-416）（缺少氨基末端）；DFCP1（W543A）（ER结构域中的点突变）和DFCP1（C654S/C770S）（双FYVE域中的突变；无法结合PTDINS3P）。 　　通过将MCHERRY – DFCP1扩增与寡聚的DFCP1-P223（+）/DFCP1-P223（ - ）从MCHERRY – DFCP1扩增GST标记的DFCP1 ，并将其克隆到Gateway vector PDONR223中
，然后进入Gateway Vector Vector Pet60
。 　　PEYFPC3-CB5，如使用YFP而不是MCHERRY所述构建的PEYFPC3-CB5 ，在我们的实验室中制造了PEGFP-VAP-A。PEGFP-gergic53和p-kdelr-egfp是A. Luini的礼物 。 　　用于网关克隆的BP克隆酶和LR克隆酶购自Thermo Fisher Scientific
。所有其他用于分子生物学的试剂均购自新英格兰Biolabs。 　　从ATCC获得HeLa细胞
，并如前所述培养12 。在DMEM F-12（GIBCO）中培养了来自L. J. Galietta的礼物Calu-3细胞（人肺腺癌），并补充了10％胎牛血清（Euroclone）100 IU ML-1 Penicillin和100 µg Ml-1 µG ML-1链霉菌（Heplotific fishericific）（Thermo）科学（Thermo-glutific fisherific） -在37°C和5％CO2下加湿的孵化器
。常规测试细胞系的支原体（生物产业）。根据制造商的说明 ，使用Transit-LT1（Mirus Bio）（Mirus Bio）或Lipofectamine LTX转染质粒，并根据制造商的说明
，对Calu-3进行CALU-3的试剂（Thermo Fisher Scientific） 。除非另有说明，否则在处理之前将表达保持16-24小时
。对于RNA干扰 ，使用Lipofectamine rnaimax（Thermo Fisher Scientific）对DFCP1 siRNA（50 nm）进行模拟或DFCP1 siRNA（50 nm）的模拟或CALU-3细胞进行直接转染。补充表2列出了本研究中使用的siRNA序列 。 　　为了产生稳定的表达克隆
，用质粒PLTD-FLAG-NSP6，PLTD-FLAG-NSP6（ΔSGF） ，PLTD-HA-NSP6或PLTD-HA-NSP6或PLTD-HA-NSP6（ΔSGF）转染了HeLa细胞
，并使用包含3μgMl-1 Puromycin（Calbioshem）的完整培养基选择
。如所示，从混合种群中分离出单细胞培养物 ，并用1μgml-1强力霉素（Sigma-Aldrich）在不同时间点探测蛋白质表达。然后通过免疫荧光分析处理样品 。这项研究中产生的所有细胞系均通过蛋白质印迹和免疫荧光认证。 　　通过乳酸脱氢酶（LDH）的活性进行SARS-COV-2感染
，病毒滴定和细胞死亡测定法，如其他地方所述24
。对于免疫荧光实验 ，将Calu-3细胞在盖玻片上播种
，与K22或DGAT-1抑制剂A922500在不同浓度的情况下保持未处理或预先处理2小时，如图所示。通过Crystal Violet染色 ，细胞形态分析或LDH分析，评估用K22或A922500处理后的细胞数和细胞活力 。在所使用的浓度下未观察到药物的细胞抑制或细胞毒性作用
。为了进行免疫荧光实验和药物治疗
，将Calu-3细胞播种在盖玻片上，并用SARS-COV-2早期谱系感染（SARS-COV-2/HUMAN/BRA/BRA/RJ01/2020 ，GENBANK NO.MT710714）
，以48小时的0.01感染（MOI）多重感染（MOI）。如上所述，用3.7％甲醛固定感染的细胞并处理免疫荧光 。为了对NSP3 – NSP6接近度进行比较分析 ，细胞类似地感染了早期谱系和伽马变体（HCOV-19/BRAZIL/AM-L70-71-CD1739/2020
，GISAID ID：EPI_ISL_ISL_1060902）SARS-COV-sars-cov-2 at Moi of 0.01 for 48 H
。 　　对于EM实验，用早期谱系B.1（HCOV-19/ITALY/CAM-INMI-32803-66/2020 ，GISAID ID：EPI_ISL_4933333）或GAMMA变体（HCOV-19/hCOV-19/ITALY/ITALY/CAM-ISMIZSM-RD02020483D54/20221
，GISI）感染CALU-3细胞。SARS-COV-2菌株的MOI为10，持续24小时 。如下所述 ，对EM处理SARS-COV-2感染的Calu-3细胞
。根据世界卫生组织（WHO）指南
，所有与病毒培养的程序均在生物安全3（BSL3）多用户设施中处理。 　　FLAG-NSP6-和MCHERRY-DFCP1转染的细胞用100 nm WORTMANNIN或1 µM VPS34抑制剂SAR405处理3小时，然后处理以进行免疫荧光 。对于K22处理 ，将细胞转染，并在30分钟二甲基亚氧化二甲基（DMSO）或40 µM K22后进行转染
。 　　从大肠杆菌Rosetta De3细胞（Merck）中纯化所有重组蛋白。质粒PET60和GST的GST标记的DFCP1单独来自质粒GEX-4T2（GE Healthcare）
，如所述34 。对于下拉实验，将来自HA-NSP6转染的HELA细胞的3毫克细胞裂解物与GST – DFCP1或GST单独孵育 ，单独在4°C下在950μl的结合缓冲液中（25 mm Tris pH 7.4
，150 mm nacl，0.1％triton-triton-triton-0.1％）和0.1％triton-x-1％和0.1％和0.1％和0.1％和0.1％和0.1％和0.1％和0.1％和0.1％和0.1％和0.1％和0.1％和0.1％和0.1％和0.1％和0.1％和0.1％和0.1％和0.1％和0.1％和0.1％和0.1％和0.1％和0.1％和0.1％MM ，抑制剂）。加入谷胱甘肽珠
，在4°C下孵育1小时，用孵育缓冲液洗涤四次 ，并用没有洗涤剂的相似缓冲液进行两次洗涤
，并通过SDS -PAGE洗脱和分析
。 　　对于共免疫沉淀实验，与HA – NSP6与GFP – NSP6 ，FLAG-NSP6
，GFP-ergic53，GFP-aTlastin-2或GFP-atlastin-2或GFP-NSP6或GFP-NSP6（1-157）（或CO-157）和HAHASSP6（HAHASSP6）一起 ，与HA – NSP6模拟细胞的1.7 mg细胞裂解物与HA-NSP6，gFP-NSP6
，GFP-NSP6，GFP-ergic53和HA HA HA HA HA HA HA HASSPFRECT FRASSF。将GFP – NSP6（ΔSGF）与适当的抗体偶联珠（HA ，FLAG和GFP）孵育 。在4°C中在750μl结合缓冲液中过夜孵育后
，用结合缓冲液洗涤样品五次，一次用类似的没有洗涤剂的缓冲液洗脱 ，通过SDS -PAGE洗脱和分析
。为了评估共免疫沉淀效率
，总共分析了三个独立的实验。共免疫沉淀的GFP – NSP6信号由输入中的GFP – NSP6信号除外，并通过免疫沉淀的原代抗原（HA）的信号进行标准化 。据报道 ，共免疫沉淀效率为平均值±S.E.M.与GFP – NSP6相比
，共免疫沉淀的GFP – NSP6（ΔSGF） 　　HeLa cells transfected with Flag–NSP6, NSP6–Flag or Flag–NSP6(ΔSGF) were lysed in buffer (25 mM Tris pH 7.4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA with protease and phosphatase inhibitor cocktails) containing increasing concentrations of Triton-X-100 and NP-40 (1:1) and centrifuged at 13,200 rpm持续10分钟
。将沉淀重悬于与上清液相同的体积中，并使用抗FLAG抗体进行蛋白质印迹分析。 　　For metabolic labelling, wild-type HeLa cells or the pLTD-HA-NSP6 or pLTD-HA-NSP6-ΔSGF stable cell lines were induced with doxycycline (1 μg ml−1) for 13 h, incubated for 30 min with methionine/cysteine-free medium (21013024, Gibco), and then incubated for 1 h at 37 °C with在同一培养基中 ，50μCIML-1 35s-甲硫代/半胱氨酸（Perkyelmer） 。然后将细胞用完整的培养基洗涤3次
，并在37°C的完全培养基中进一步在不同时间孵育
。所有培养基包括强力霉素（1μgml -1）。细胞裂解后，用抗HA亲和力珠对蛋白质进行免疫沉淀 ，并通过SDS-PAGE凝胶自显影术（使用台风成像仪，图像Quonttool
，GE Healthcare）进行了免疫蛋白质稳定性的蛋白质稳定性，以测量蛋白质稳定性 ，然后使用抗抗蛋白质的蛋白质水平来测量蛋白质稳定性 。 　　如前所述34进行了蛋白质印迹分析和光密度法
。将含有NSP6的样品与样品缓冲液（100 mM Tris pH 6.8、25％甘油
，2％SDS，0.01％Bromophenol Blue和10％2-羟基乙醇）混合 ，但在加载前未煮沸。 　　如前所述进行免疫荧光分析 。 　　用FLAG -NSP6或NSP6 -FLAG转染的HeLa细胞在盖玻片上生长
，并用4％PFA固定10分钟，用缓冲液A（20 mm Pipes pH 6.8 、137 mm NaCl和2.7 mm KCl）洗涤3次 ，并用20 µm digitonin（CalbioChem）稀释液
，并用20 µm digitonin（CalbioChem）渗透。用阻塞溶液（5％FBS（V/V）和50 mM NH4CL a）在缓冲液中阻塞盖玻片30分钟，而无需任何额外的透化剂 ，并与一级抗FLAG和抗TGN46抗体一起孵育
。TGN46抗体是针对蛋白质的腔部分提出的
，因此在二核蛋白透化后无法获得。这代表了一个对照，因为只有质膜已透化 。用缓冲液A洗涤盖玻片 ，并在室温下用荧光组合的二级抗体（用于FLAG的Alexa Fluor-488）和Alexa Fluor 568孵育1小时
。孵育后，用2％PFA固定细胞5分钟
，并在PBS中用50 mM NH4CL洗涤一次。随后将盖玻片在PBS中用0.1％Triton-X-100透化5分钟 。然后将细胞用阻断溶液（0.05％皂苷，0.5％BSA和50 mM NH4CL）在PBS中阻塞 ，并与第一步中使用的相同主要抗体一起孵育
。然后将盖玻片用PBS洗涤
，并用荧光聚糖偶联的二级抗体（FLAG的Alexa Fluor 405，PBS中的TGN46的Alexa Fluor 633）在室温下孵育1小时。在这些条件下 ，原代抗体可以访问TGN46表位
，从而确认了选择性渗透性并识别腔内表位 。 　　通过将0.5μm的Bodipy 493/503（Thermo Fisher Scientific）染色，以染色为荧光偶联的二抗抗体混合物30分钟 ，并进行处理
，并进行免疫荧光分析
。 　　为了监视从LDS到DMV的脂质转移，我们遵循了前面描述的协议30。简而言之 ，将BODIPY 558/568-DA-C12在最终浓度为1μM的情况下
，将16小时添加到用GFP – NSP4/HA-NSP3或GFP-NSP4/HASP4/HA-NSP4/HA-NSP3/FLAG-NSP6转染的HeLa细胞的培养基中 。然后将细胞洗涤并与补充脱夹的血清（1％）的DMEM再孵育6小时
。盖玻片是固定的，并如上所述处理。通过使用斐济（ImageJ）软件的“分析颗粒 ”工具来鉴定NSP4点 ，并确定每个粒子的Bodipy-Da-C12的荧光平均强度 。值等于或高于ER的值的颗粒被定义为“正”颗粒。计算每个细胞的NSP4 Bodipy-Da-C12阳性颗粒的百分比
。 　　使用Zeiss LSM800或LSM880共聚焦系统上的Plan-Apochromat 100×/1.4油目标对细胞进行成像，该系统配备了Airyscan模块
，并由Zen Blue软件控制。提出的荧光图像代表了至少三个独立实验收集的图像，除非另有说明（有关更多详细信息 ，请参见“统计和可重复性
”） 。使用相同的参数（即数字增益
，激光功率和放大倍率）获取用于表型定量的图像，并使用斐济（Imagej； National Institues of Health（NIH））软件进行处理
。使用Adobe Photoshop调整了亮度和对比度 ，并用Adobe Illustrator组装了图形面板。 　　使用“分析粒子”函数分析NSP6
，NSP4，LC3和LD结构 ，以确定其每个单元的数量 。对于每个实验
，将图像获得以下饱和极限，并选择相同的阈值并应用于所有阈值
。为了计算结构的大小 ，使用了“分析粒子 ”功能
，将“区域
”定为测量。 　　为了计算每个单元中NSP4点的分布，使用“分析粒子”功能 ，考虑到粒径在0.1和无穷大之间，并选择质量中心作为测量的参考 。获得并绘制了每个NSP4点的X和Y坐标
。使用质量中心的XY坐标作为轴原点
，将四X骨的细分应用于图像。每个象限的NSP4点的相对丰度表示为每个单元的总识别结构的百分比 。 　　为了测量NSP6荧光的细胞分布，在整个细胞中总NSP6的综合密度上计算了NSP6​​中NSP6的整合密度
。 　　每个时间点分析具有可比水平的总荧光强度的细胞。结果表示为NSP6结构中总荧光中存在的荧光NSP6信号的百分比 。 　　测量与NSP6阳性结构相关的VAP-A或NSP6（1-157）的比例作为NSP6结构上每种蛋白的整合密度与整个细胞中的集成密度之间的比率。 　　使用JACOP插件计算NSP6和野生型或突变型DFCP1之间的共定位
。 　　对象之间的相对距离是用Diana插件中的36确定的。简而言之 ，通道是阈值
，然后分段 。对于距NSP4和NSP6的LD距离，在图4b所示的转染细胞中 ，在整个细胞中测量了粒子之间的边缘 - 边缘距离
。没有排除值。此外
，对于所选图像，包括图4A中的图像 ，我们应用了Shuffle函数36
，如图9F所示 。简而言之，此函数以随机方式将对象重新分布
。然后 ，测量了从原始图像的第二个通道中随机通道的对象之间的距离之间的距离。这些距离的分布表示为95％置信区间（绿线）的平均值（红线） 。绘制了从原始图像的两个通道中对象之间测量的距离的分布（蓝线）
。如果此分布不在洗牌图像获得的距离的置信区间之外
，则该距离被认为具有统计学意义（p <0.05）。 　　对于扩展数据中的LDS和DsRNA或NSP6之间的接近度，图9D以及扩展数据中dsRNA和NSP6之间的接近度图7i ，在受感染的细胞中，分析边缘距离
，结构被分析，并且在所有方向上（在所有方向上）将结构接近250 nm 。为了计算图3B中心 - 中心和边缘边缘距离中受感染细胞中NSP3-和NSP6阳性结构之间的距离
。 　　固定表达标志性NSP6的HeLa细胞并处理以进行免疫荧光。使用相同的参数获取具有相似表达的细胞 ，并使用斐济（ImageJ）软件进行处理 。测量每个细胞的集成密度。 　　对于预用IEM
，如前所述固定，透化并标记为37
。In brief, the cells were fixed with a mixture of 4% paraformaldehyde (PFA) and 0.05% glutaraldehyde prepared in 0.2 M HEPES buffer for 10 min (room temperature) and then with 4% PFA alone for 30 min (room temperature), followed by incubation with blocking/permeabilizing solution (0.5% bovine serum albumin (BSA), 0.1% saponin and 50 mMNH4CL在PBS中）持续30分钟。 　　将细胞与原代抗HA单克隆抗体（1：600 ，Biolegend）孵育过夜
，然后在封闭/通透性溶液中稀释过夜，然后将二次抗小鼠抗体（1.4 nm偶有的偶联Fab的片段稀释为1:50 ，纳米杆稀释2小时） 。Goldenhance EM Kit（来自纳米探针）用于增强超质金颗粒
。对于表达HA – NSP3
，MCHERRY – NSP4和GFP – NSP6的细胞的双重标记，对抗HA抗体的增强进行3分钟 ，然后将主要的抗GFP多克隆兔抗体（1：250
，ABCAM）添加并使用上述次级抗抗体抗体抗体（1：250，ABCAM）进行处理 ，并使用二级抗纤维抗体（1.4-nm-nm-nm-nm-nm-nm-nm-nm-nm-nm-nm-nm-nm-gong），fragn-conj。纳米探针）持续2小时
，然后再增强3分钟 。抗HA检测的较长增强时间会导致形成较大的金颗粒（簇），其形状将HA – NSP3与较小的GFP – NSP6信号区分开 ，并在双转染的细胞中区分较小的GFP – NSP6信号
。 　　对于常规EM
，用0.2 M HEPES缓冲液制备1％GA固定细胞30分钟（RT）。 　　将针对IEM或常规EM制备的细胞刮除，沉淀 ，将其固定在OSO4和乙酸铀酰中
，脱水，嵌入Epon中 ，并在60°C下聚合72小时 。对于每个样品
，使用Leica EM UC7超小办团（Leica Microsystems）切割薄部分
。使用配备Veletta CCD数码相机（软成像系统）的FEI Tecnai-12电子显微镜（FEI）从薄层中获取EM图像。使用项目软件（Olympus）对感兴趣的结构进行形态计量分析 。 　　用HA-NSP6或HA – NSP6（ΔSGF）转染HeLa细胞，或者与HA – NSP3/MCHERRY – NSP4/GFP – NSP6或HA-NSP3或HA-NSP3/MCHERRY – NSP3/MCHERRY – NSP4/MYC-NSP6共转染
。转染后30分钟30分钟 ，将转染的细胞处理或不处理。过夜表达后
，将细胞固定为IEM，然后用抗HA抗体标记 ，然后用次级Alexa Fluor-546 Fluoronanogold抗小鼠Fab检测 。使用Zeiss LSM800站和荧光图像记录了携带不同蛋白质的感兴趣结构。然后将细胞固定，脱水
，嵌入epon中并如上所述聚合
。使用FEI Tecnai-12电子显微镜切割和分析串行60 nm切片。使用Zen Connect软件（Zeiss）在EM图像上鉴定了通过共聚焦显微镜获得的相同细胞和感兴趣的结构 。 　　在Formvar碳涂层的插槽网格上收集EPON切片（250 nm厚），并使用配备有自动层析成像阶段的Tecnai G2 Spirit Biotwin Electron显微镜（FEI）进行分析
。除非另有说明 ，否则使用Xplore 3D TEM断层扫描软件（FEI）以40,000×放大倍率在-65°至 +65°（以1°的间隔）以40,000×放大倍率获取单个倾斜的图像。倾斜系列与开源IMOD软件一起生成断层图 。根据实验条件分析了至少10个断层图
。对于3D重建
，使用IMOD软件呈现DMV和周围ER膜的表面。 　　GFP – NSP6单独并与MCHERRY – NSP6，MCHERRY或MCHERRY – DFCP1和MCHERRY – NSP6组合使用GFP – NSP6（1-157） ，GFP-效能和GFP – Atlastin-2
，如先前所描述的那样，对GFP – NSP6的FLIM – FRER分析和MCHERRY – NSP6 ，MCHERRY或MCHERRY – DFCP1和MCHERRY-NSP6进行了分析 。使用Symphotime 64（PicoQuant）进行FLIM数据分析
。对于NSP6结构的活细胞成像
，将细胞铺在玻璃底（Mattek）中，并用荧光标记的蛋白质构建体转染或用β-前生的FL C12-HPC（1μm）孵育16小时 ，并用LSM800 Microscope（Zeiss）fif a 4888-Nmerson和561-Nmand和561-Nmers和561-Nmmers和561-NM63×Plan-Apochromat NA 1.4 DIC油浸入物镜。在成像过程中
，将细胞保持在完整的培养基中，在37°C的加湿气氛中 。提出的荧光图像代表了至少三个独立实验中成像的细胞 ，并使用斐济（Imagej; NIH）软件处理
。 　　如下所述，进行了FRAP实验和延时激光共聚焦显微镜。简而言之
，在漂白之前获得了五个框架（每帧6 s） 。用488激光的100％功率进行10次迭代进行漂白。漂白事件后，对恢复进行了600秒的监测
。在三个不同的实验中 ，对每种条件进行了至少30个独立的结构。使用ZEN软件（Zeiss）导出数据
，并通过将漂白区域的荧光强度除以未漂白区域的荧光强度来纠正进行漂白 。在恢复时间（0到10％之间），漂白量很少：在漂白超过10％的情况下 ，恢复序列被丢弃
。通过翻转在活细胞中测量了GFP – NSP6和GFP – NSP6（ΔSGF）与膜的分离的定量。通过迭代（框架之间的间隔为100次
，间隔为6 s）在表达每个GFP标记蛋白的细胞中进行FLIP 。在整个细胞区域中与GFP相关的荧光除外（ROI）（ROI）（ROI）（ROI）（含有NSP6结构）
。ROI通常占总细胞面积的10-15％。单个结构的相对荧光强度表示为一定百分比的前荧光，被绘制为平均值±S.D 。观察到了从结构的GFP – NSP6（ΔSGF）的翻转诱导的衰减曲线的放缓 ，表明GFP – NSP6（ΔSGF）与膜的关联增加
。 　　使用Item软件（Olympus SIS）的形态计量学网格（Olympus SIS）
，将正常和拉链ER（或NE）表面的百分比定量在NSP6转染的HeLa细胞的随机薄切片中进行定量。使用项目软件的触摸计数工具对HELA细胞的薄切片中的金颗粒进行定量，并标记为HA的免疫金 。在每个分析的细胞中 ，该定量进一步用作HA – NSP6或HA – NSP6（ΔSGF）表达的量度
，以使Zippered ER的表面积标准化相应HA标记的NSP6蛋白的表达水平
。To assess the effect of NSP6 or NSP6(ΔSGF) on the organization of DMVs, tomograms of DMV clusters were used to quantify the following parameters: DMV diameter, shape factor (ratio between long and short axes), density (number per DMV cluster area), length of ER–DMV connections, number of DMVs per connection and overall number of ER–DMV connections per DMV cluster.DMV簇定义为一组DMV，其与最近的邻居的距离不超过两个平均DMV直径。横线图中的所有测量均使用开源斐济软件的3D Manager插件进行 。使用相同的工具来量化来自SARS-COV-2的早期谱系B.1或伽马变体的CALU-3细胞中的拉链DMV连接器的长度。 　　使用约束共识拓扑预测服务器（CCTOP ，酶学研究所）进行NSP6拓扑建模
。使用Heliquest（http://heliquest.ipmc.cnrs.fr）确定α-螺旋的两亲性特征16，并在基于遗传算法的模块后引入突变。图2A和扩展数据中所示的图像和漫画图11是用Biorender.com创建的 。 　　在GISAID数据库（https://www.gisaid.org/）中沉积的SARS-COV-2基因组的系统发育分析是在2019年12月至2021年7月采样的3,508套代表性基因组中进行的
，由NextStrain18（https://neblextps://nextstrain.org/ncav/ncov/ncov/ncov/ncov/ncov/）进行了
。在2021年7月16日沉积的样品中评估了NSP6​​蛋白中携带SGF缺失的基因组的百分比。 　　使用GraphPad Prism7（GraphPad软件）或用于统计计算的R软件环境（RSTATIX R软件包）进行统计分析 。 　　为了测试数据的正态分布和跨组方差的均匀性，在ANOVA残差上使用了Shapiro -Wilk测试和Levene的测试
。当测得的变量正态分布时 ，通过t检验或ANOVA确定对照组和处理组之间测量变量差异的统计显着性
，然后根据实验进行适当的多重比较后测试。当测量的变量未正态分布时，进行非参数Mann – Whitney或Kruskal-Wallis测试 ，然后根据实验进行适当的多重比较后测试 。 　　衍生统计的所有实验均进行了三次
，结果相似
。n表示实验数量和n总测量或观测值的数量。所执行的所有重复均为生物学，而不是技术 。下面提供了每个实验的详细信息
。 　　扩展数据图中显示的实验。1A ，E
，3H，6A和9C重复两次 。 　　图2所示的实验。1b ，c
，g – i，2i ，j，3d
，e，f ，i
，n和4c以及扩展数据图
。1f – j，2a – c ，3a
，d，4c – i ，5k
，l，6d ，i
，i，i ，j，l
，m，7c – e ，8a
，b，b ，f – h
，9a，9a ，b
，b，f – h和10a ，b
，重复3次。 　　扩展数据图中显示的实验 。1C，D ，2D，E
，5C，M和6C ，F重复四次
。图2所示的实验。1A
，3A和4D以及扩展数据图2 。重复6G，9i和10c五次
。扩展数据中显示的实验重复了六次。 　　图2所示的实验 。1E ，F和3C以及扩展数据图2
。5J和6B重复了十次。 　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然研究报告摘要中获得 。