所有涉及动物的实验均根据VAUD广州（瑞士）Cantonal兽医办公室的准则和批准进行，许可证号VD3257 。所有小鼠均以22±1 c°的室温 ，55±10％的湿度和12h/12h的白天/夜间周期在洛桑大学的室温为22±1 c°
，在不含病原体的特定设施中饲养并容纳
。先前已经描述了缺乏GSDMD的小鼠18。Ninj1-deficient mice were generated on the C57BL/6 background at the Center for Transgenic model of the University of Basel as follows: an 8-kb large fragment comprising the entire Ninj1 locus on mouse chromosome 13 was deleted by CRISPR–Cas9 genome engineering using 2 guide RNAs (gRNAs) (CAGTGCCCGACTCCATGGTGCGG andninj1基因座的上游和下游结合的Aggccgagacccagtgcgg） 。在发布方案40后，将GRNA和Cas9蛋白注入C57BL/6胚胎中。进行基因分型活检在10-12天内进行
。根据制造商的说明 ，使用KAPA HOTSTART小鼠基因分型套件进行DNA提取。Genotyping PCR was done using Q5 Polymerase (NEB), carrying out three PCR reactions with three primer sets: PCR-A (GGGCCCGTTTGATCAACAAC and TCGCCGTTGAGCTCATACTC) covering the binding site of gRNA1, PCR-B (GTTCCCTAGCCACTTCCACC and GGCTGGAAGGGTGCTAAGTT) covering the bindingGRNA2和PCR-AB（GGGCCCGTTGATCAACAAC和GGCTGGAGGGTGCTA AGTT）的位点结合了已删除的基因座 。PCR-A的预期碎片尺寸为379 bp，具有野生型等位基因的动物的PCR-B为715 bp
，在带有已删除位点等位基因的小鼠中，PCR-AB为979 bp
。Sanger测序的PCR-AB的乘积以验证缺失的精确延伸 ，使用细胞裂解物上的抗MNINJ1抗体进一步证实了缺失。 　　通过从市售获得的质粒（Sinobiological
，hg17094-acg）中扩增HNNINJ1 – GFP编码序列，通过扩增HNINJ1 – GFP编码序列 ，通过扩增HNINJ1 – GFP编码序列
，通过扩增HNINJ1 – GFP编码序列，从（tacaccggtgccggcggcggcgcgcaCcAtggactcgggaAccgaggag; cagggggagggtgg tctggattcttcttaCtTaCagctcgtccatgccatg cc）并将其插入PLVX-PURO VECTOR（Clontech）的BAMHI站点 。编码野生型MnInj1的cDNA是从商业合成（Genscript）的商业合成的商业质粒（Sinobiological ，MG53796-NF）和编码不同MNINNJ1突变体的cDNA（Genscript）
。All mNINJ1 coding sequences were amplified by PCR and subcloned into the BamHI site of the pLVX-Puro vector (Clontech) to generate Dox-inducible plasmids (primers: CACCGGTGCCGGCGGATCGCCACCATGGAGTCGGGCACTGAGGAG; GGGGAGGTGGTCTGGATCTTACTGCTGGGGTGCCATGTC), or进入PMSCV2.2-IRES-GFP载体的NOTI位点
，用于逆转录病毒逆转（引物：Gagatcgatgcgcgcgcgccgccgccgccccaccaccatggagtcgg; cgttttaaaacgcggcggcggcgcgcgccttacttactgccggcggcgg）。通过扩增DMRB18（cagcctcgccaCcctccgcctt; ccctcgtaaagaattgagaagcctc）和caspase-4 p20/p20/p10片段（aggagggaggaggctggctggagggagggagggtcccaggtccaggtcca，TTGCCAGGAAAGAGGAGAAATATCTTGT）编码序列 ，使用重叠延伸PCR
，并将子链接到Fitrrox-Puro Vector（Clontech）的Ecori位点 。所有克隆均使用融合克隆技术（Clontech）进行，并通过测序验证质粒
。 　　在Dulbecco的修改后的Eagle的培养基（DMEM）（GIBCO）中收获并区分了野生型 ，GSDMD - / - ，NINJ1 - / - 和CASP11 - / - BMDMS
，含有20％L929上午（作为巨噬细胞刺激因子（MCSSSSS），10％热量（10％） ，10％fetal ftrcs（10％）（Bioconcept）
，10 mM HEPES（Bioconcept）青霉素/链霉素和1％非必需氨基酸（Gibco），并在分化的第8至10天刺激。在含有10％FCS的DMEM中培养人上皮HeLa细胞（来自ATCC的克隆CCL-2）和人类胚胎肾细胞HEK 293T 。所有稳定的细胞系均如先前使用慢病毒转导方案41产生
。简而言之 ，使用LT-1（Mirus）转染试剂
，用1.25 µg所需的慢病毒表达载体与250 ng VSVG和1.25 µg PSPAX2一起瞬时转染1.5×106 HEK 293T细胞。接下来，使用慢病毒颗粒来传递稳定表达FLAG – GSDMD – V5的HeLa细胞（生成表达HELA FLAG-GSDMD – V5和DOX诱导的DMRB-CASP4）18 。使用嘌呤霉素（5 µg ml -1; Invivogen）选择稳定转导的细胞群至少5天。所有细胞在37°C ，5％CO2下生长
。 　　如先前所述42,43。如上所述
，将编码野生型或突变小鼠NINJ1的基因克隆到PMSCV2.2-IRES-GFP中 。为了在分化为BMDMS期间转导氮型小鼠的原代骨髓细胞，用凤凰eCO包装细胞产生逆转录病毒颗粒 ，并用于在培养基中以10％L929-MCSF超级骨髓收集培养基48 h和72 h培养后转导骨髓细胞
。通过显微镜检查转导效率以表达GFP。第一次转导后四天
，将完全分化和转导的BMDM播种以进行实验 。 　　野生型和NINJ1 - / - BMDM在4％PFA中固定20分钟，用PBS洗涤 ，用0.05％的皂苷透化，并用1％BSA封闭
。然后将细胞与抗小鼠NINJ1单克隆抗体（Rabbit IgG2B克隆25
，Genentech; 1：2,000），Alexa Fluor 488偶联的抗兔（Life Technologies ，1：500）和Hoechst（1：1,000）孵育。为了进行BMDM的延时成像
，将细胞接种到8孔µ-Slides（IBIDI）上，用小鼠IFNγ启动过夜 ，并用Ultrapure LPS转染
，如下所述 。为了可视化磷脂酰丝氨酸的暴露和膜通透性，成像培养基（Opti-MEM）补充了FITC – Annexin V（1 µg ml-1; Biolegend）和丙丙丙啶（5 µg ML-1； Thermo Fisher）
。将表达光电– CASP114的HELA细胞接种到8孔µ裂片上 ，并用编码DOX诱导的Hninj1 – GFP的质粒瞬时转染
，该质粒的表达被诱导16 h（1 µg mL-1 dox; Sigma; Sigma），e-cadherin – gfp或hatmd – gfp或hatmd – gfp。为了可视化膜通透性 ，成像介质补充了1 µM DRAQ7 。然后
，使用63×/1.4 Na油物镜，用Zeiss LSM800共聚焦激光扫描显微镜对样品进行成像
。使用具有自动对焦的电动XYZ阶段（Zeiss Distrite focus.2系统）在37°C下在37°C下进行延时显微镜检查 ，并使用Zeiss Zen 2软件获取数据。使用488 nm激光器，每60 s进行光电– CASP1和Z-stack采集（800 nm步长）的照片刺激 。通过手动分割核区域并测量所选区域的强度密度
，使用Z-stack的最大投影对单核DRAQ7强度进行定量。然后将每个时间点（ft）处的荧光强度标准化为实验初始时间点（FI）的强度，即（ft -fi）/fi
。然后 ，使用马赛克分割和在图像中的空间分布进行定量分析
，使用马赛克分割和双向参数优化在图像中，对HELA细胞的质膜上的分布模式进行了评估。每个时间点（DT）的分布不均匀性在实验的初始时间点（DI）（即dt -di 。当DRAQ7（FT - FI）/FI> 1时 ，定义时间t = 0
，这对应于DRAQ7核荧光强度的显着增加和质膜通透性的发作
。使用斐济软件分析并处理所有显微镜数据集。 　　HELA（稳定表达FLAG-GSDMD – V5和DMRB-CASP4）和HEK 293T细胞在96孔板中分别以8.5×103和1.2×104个细胞的密度分别每孔，每个孔的密度分别为1.2×104个细胞 。然后 ，根据制造商的指示
，使用X-三分二烯9型DNA转染试剂（Roche），用编码野生型或不同MNINJ1突变体的PLVX DNA质粒的50 ng瞬时转染细胞
。为了诱导转基因表达 ，将培养基补充了DOX（1μgml -1）16 h（HeLa）或48 h（HEK 293T）。在HeLa细胞中
，将培养基替换为Opti-MEM（Gibco），并将细胞与20 nm b/b同二聚体（Takara ，Clontech）孵育1.5 h，以激活DMRB – CASP4 。 　　在刺激前一天
，将BMDMS播种在96孔板中，密度为5×104
。首先将典型的炎性体细胞用PAM3CSK4（1 µg ml-1; Invivogen）启动4 h ，持续4 h
，然后用nigericin（5 µg ml-1; Sigma-Aldrich）在Opti-MEM中进行洗涤，然后使用Poly（DA：DT）（DA：DT）（DA：DT）（13 ng）转移；使用LIP; iST;（Thermo Fisher）或感染沙门氏菌肠孢子虫菌株SL1344。在含有链霉素（50 µg mL -1）的溶酶体肉汤（LB）培养基中的轨道振动液（LB）培养基中 ，在37°C下生长细菌过夜 。第二天
，沙门氏菌培养物以1/50培养，并生长至A600 = 1.5–1.8 ，通过离心收集
，洗涤并重悬于Opti-Mem中
。在感染的多种感染（MOI）中加入细菌，以用于感染BMDM ，并在37°C下孵育30分钟。接下来
，添加庆大霉素（30 µg ml -1; gibco）以杀死细胞外细菌，并在其余的实验中孵育细胞 。为了激活非人类的炎性体 ，首先将巨噬细胞与小鼠IFNγ（10 ng ml-1; peprotech）与PAM3CSK4结合使用4 h，在Opti-MEM中与超能力大肠杆菌O111：1.0 µg per pr pr fug; indge eggen（使用0.25％）
，使用PAM3CSK4相结合4 h，使用;描述45。所有治疗和感染时间均在图传说中指出
。 　　如上所述 ，在刺激前每天每天以2×105细胞的密度为2×105个细胞的密度将BMDMs接种在24孔板中。在粘霉素刺激（图中指示）之后
，将交联BS3（BIS（硫糖酰亚胺）suberate）添加到培养基（3 mm； Thermo Fisher）中，并在室温下孵育5分钟 。接下来 ，添加20 mM Tris pH 7.5的溶液以停止反应并在室温下孵育15分钟
。收集细胞上清液
，将蛋白质沉淀，并与细胞裂解物结合进行蛋白质印迹分析。 　　在黑暗中的室温下 ，将BMDM在PBS中用CFSE（5μM； Thermo Fisher）标记12分钟 。CFSE通过添加测定培养基淬灭
。然后
，将细胞颗粒，计数 ，与未标记的野生型或CASP11 - / - BMDMS以1：1的比例混合
，并在24孔板中以每个孔的密度为2.5×105个总细胞。然后，如上所述将细胞启动并用超纯LPS转染 ，用碘化丙啶（0.5 µg mL -1）染色，并在细胞中成像5成像板读取器 。 　　通过使用LDH细胞毒性试剂盒（Takara
，Clontech）根据制造商的说明来测量细胞上清液中的LDH量来量化细胞裂解，并根据制造商的说明表示为总LDH释放的百分比
。将LDH释放标准化为未经治疗的对照 ，100％裂解
，并且细胞裂解的百分比如下计算：（[[LDHSample] - [ldhnegative Control]））/（[[LDH100％裂解] - [LDHNegation Control] - [ldhnegation Control]）×100％。为了测量细胞通透性，将碘化丙啶添加到培养基（12.5μgml -1； Thermo Fisher Scientific）中 ，并使用荧光板读取器（Cytation 5; Biotek）测量其涌入 。通过将Triton X-100添加到0.05％的最终浓度
，并计算出碘化丙啶的百分比，从而获得了100％的透化对照
。根据制造商的说明（Thermo Fisher Scientific） ，通过酶联免疫吸附测定法（ELISA）来测量IL-1β在上清液中的释放。 　　为了进行蛋白质印迹分析
，将细胞在66 mM Tris-HCl pH 7.4、2％SDS，10 mM DTT ，Nupage LDS样品缓冲液（Thermo Fisher）中裂解 。当提到时
，使用标准方法将上清液与甲醇和氯仿沉淀，并与细胞裂解物结合。将蛋白质分离在4–15％聚丙烯酰胺凝胶（Bio-Rad）上 ，并使用传输涡轮（Bio-Rad）转移到硝酸纤维素膜上
。The antibodies used were: anti-mouse GSDMD (EPR19828; Abcam; 1:1,000), anti-mouse NINJ1 monoclonal antibody (rabbit IgG2b clone 25; a gift from Genentech; 1:8,000), anti-human caspase-4 (ADI-AAM-114-E; Enzo Life Sciences; 1:1,000), anti-V5（46-0705; Invitrogen; 1：2,000）和小鼠抗微管蛋白（AB40742; ABCAM; 1：2,000）。使用小鼠抗人类忍者（610777; BD转导实验室; 1：1,000）检测到纯化的人Ninj1 。用辣根过氧化物酶（HRP）偶联的山羊抗兔（4030-05;南部生物技术； 1：5,000），HRP共偶联的山羊抗小鼠（1034-05; Southern Biotech; Southern Biotech; 1：1：5,000或12–349; Milliporesig; Milliporesigma; 1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1： 　　将稳定表达DMRB – CASP4和GSDMD的HeLa细胞在25 mm玻璃盖夹（Menzel
，＃1.5）的六孔板中播种，每个孔的密度为2×105个细胞
。将细胞在DMEM（Thermo Fisher）中培养24小时 ，并在37°C和5％CO2的DMEM（Thermo Fisher）中补充了10％的胎牛血清（Thermo Fisher）。根据制造商协议
，使用使用Jetoptimus（Polyplus）转染试剂编码HNINJ1 -GFP的质粒转染细胞 。六个小时后，通过在1 µg ml -1的添加DOX诱导NINJ1 – GFP和DMRB -CASP4表达 ，并将细胞进一步孵育过夜
。通过在最终浓度为10 nm的B/B同二聚体（Takara）添加B/B同二聚体（Takara）诱导CASP4的二聚化
，并将细胞孵育3小时，然后再进行抗GFP免疫荧光染色。将细胞在PBS中洗涤两次 ，并在PBS中由4％多聚甲醛（PFA
，Alfaaesar）组成的预热固定溶液中固定15分钟 。再次将样品在PBS中再次洗涤，然后在PBS中与0.2％的牛血清白蛋白（BSA）和0.2％Triton X-100在PBS中进行透化并阻塞30分钟
。将细胞与Alexa Fluor 647偶联的抗GFP纳米结构（Fluotag-X4 ，纳米塔； 1：500稀释）孵育2小时。最终将样品在PBS中洗涤3次
，持续10分钟 。对于暴风雨成像，将玻璃盖滑板安装到attofluor（Thermo Fisher）成像室中
。除非另有说明 ，否则所有化学物质均购自Sigma。 　　配备了642 nm激光器（F-04306-113，MPB通信）的Nikon Ti Eclipse Nstorm显微镜用于风暴成像以将分子切换到OFF状态 。使用405 nm激光器（立方体
，相干）来控制荧光团对发射状态的返回率。使用F73-888 Quad波段二分色（Chroma）来反映样品上的激光光
。通过物镜（Apo Tirf 100×，Na 1.49油 ，尼康）收集样品中的发射光
，将二分色镜穿过EMCCD摄像头（IXON DU-897D，ANDOR）。方形摄像头像素的宽度对应于样品上的160 nm 。使用由50 mM Tris制成的已建立的光切换缓冲液 ，该缓冲液用10 mM NaCl制成
，并补充了10％葡萄糖，50 mM 2-甲基胺 ，0.5 mg Ml-1葡萄糖氧化酶和40 µg ML-1兆1催化酶
。所有化学品均购自Sigma。通常
，在30毫秒暴露时，每个视场记录了10,000帧 ，并连续激光曝光 。使用NIS元素（Nikon）控制显微镜
，使用DecoDe46进行了单分子定位分析
。使用自定义MATLAB（MATHWORKS）代码进一步处理本地化。使用雷暴47,48通过冗余互相关校正侧面样品漂移 。使用DBSCAN聚集了本地化，并使用MATLAB（MATHWORKS）49进行了处理
。使用Thunderstorm47和Fiji50渲染图像和裁剪以进行可视化。使用Prism（GraphPad）进行绘图和统计分析 。 　　具有全长野生型HnInj1（1-152）的质粒在PET28载体中订购的genescript ，其N末端为8×His-TAG，然后是烟草蚀刻病毒（TEV）裂解位点（ENLYFQGS）
。所有HNINJ1点突变均通过定点诱变产生
，并通过DNA测序验证。所有NINJ1构建体均在Rosetta2（De3）大肠杆菌中重组表达，在37°C下生长在自制的肉汤（TB）中 ，并补充了额外的葡萄糖（24 g L -1酵母提取物
，12 g L -1酵母提取物，12 g l -1 pryptone ，10 g l -1 glucose
，10 g l -1 glucose，pH 7.5） ，pH 7.5）
，pH 7.5），pH 7.5） ，1×khh2 raphospo lashospo lashoshate phoshate phospo（23.1×phospos ghospo plospo raphospo plospo（23） 。125.5 g l -1 k2hpo4）的吸光度为3.0
，并用0.1 mM IPTG诱导。诱导后，将细胞在18°C下生长16小时 ，并收集细胞颗粒并储存在–80°C下
。所有裂解和纯化步骤均在4°C下进行。将细胞颗粒重悬于裂解缓冲液（50 mM Tris-HCl pH 8.0，150 mM NaCl）中
，并补充了溶菌酶，DNase I和Roche Complete Complete蛋白酶抑制剂 ，并用细胞破坏者裂解 。裂解物以4,400克澄清35分钟
。通过在Ti45转子中以35,000 rpm的超速离心分离大肠杆菌膜。将膜轻轻地重悬于50 mM Tris-HCl pH 8.0 、150 mm NaCl缓冲液中
，并用20多笔手动匀浆 。将膜重悬在液氮中闪烁，并储存在–80°C下
。将膜重悬于50 mM Tris-HCl pH 8.0
、200 mM NaCl ，15％甘油
，20 mM咪唑和1％DDM> 2 h中溶解化，然后以30,000g离心30分钟。将上清液通过0.45 µm的膜过滤 ，然后加载到连接到äkta纯系统（Cytiva）的平衡的Ni-NTA柱（Cytiva）上 。用50 mm咪唑的10列体积洗涤该色谱柱
，并用含有400 mM咪唑的5列体积洗脱Hninj1
。然后使用Hiprep 26/10脱盐柱（Cytiva）在10 mm Tris-HCl pH 8.0，150 mm NaCl中进行脱盐 5％甘油和0.016％DDM ，并储存在–80°C。8×他的标签通过TEV裂解（在4°C时以1:10摩尔比的TEV为16小时）去除 。最后
，将样品加载在SEC缓冲液中的Superose 6增加10/300柱上（10 mM Tris-HCl，pH 8.0 ，150 mm NaCl，5％甘油和0.016％DDM）
，聚合物HNINJ1的峰值分数用于实验
。 　　对于HNINJ1单点突变体的负染色透射电子显微镜（TEM），我们在8×His TAG的TEV裂解后直接制备了负染色TEM样品。对于冷冻EM样品准备 ，在他的标签裂解后
，还包括了额外的Ni-NTA纯化步骤 。然后，流通量分为三个独立的SEC ，并在98深的井板中以小部分收集。汇总了跨收集板的相同高聚合物分数
，以产生适合冷冻EM的浓度，而无需其他集中步骤
。 　　野生型HNINJ1（1-81）构建体是从genecust购买的 ，它是在具有N端6×His – GB1标签的自定义矢量中购买的
，其次是TEV裂解位点（ENLYFQG）。The construct was recombinantly expressed in E. coli BL21(DE3) star cells grown at 37 °C in M9 minimal medium supplemented with 2 g l−1 -[13C]-glucose and 1 g l−1 [15N]-NH4Cl, to an absorbance of 0.7 and induced with 1 mM IPTG.诱导细胞在37°C生长3小时，然后收集并在–70°C下储存 。将细胞沉淀重悬于裂解缓冲液（20 mM Tris-HCl pH 8.0 ，300 mm NaCl）中
，并补充了Roche Complete蛋白酶抑制剂，并通过超声处理裂解
。将裂解物在4°C下以46,000克离心1小时 ，并在4°C下以6 m尿素为20 mm Tris-HCl pH 8.0，500 mm NaCl溶解16小时。在4°C下以46,000克离心溶解的包含体
，并在Ni2+ Sepharose亲和力柱（Cytiva）上加载上清液 。The column was washed with 5 column volumes with 20 mM imidazole, then refolded on column with 20 column volumes of refolding buffer (20 mM Tris-HCl pH 8.0, 500 mM NaCl), washed again with 5 column volumes with 20 mM imidazole and recombinant protein was eluted with 5 column volumes of elution buffer (20 mM Tris-HCl pH 7, 100 mM NaCl, 250MM咪唑）
。最后，将样品加载在SEC缓冲液（20 mM Tris-HCl pH 7 ，100 mm NaCl）的HiloAD 16/60 SuperDex S75 PG柱（Cytiva）上。将GB1 -NINJ1（1-81）的峰值分数合并
，补充20 mM胆汁钠，并浓缩在Amicon 4（MWCO 10 kDa）上 。典型的NMR样品的浓度为50 µM GB1 -NINJ1（1-81）（在没有洗涤剂的情况下）至500 µm（对于含有20 mM胆汁钠的样品的分配实验）
。使用每个洗涤剂浓度的单个样品（0、2 、5、10和20 mm巧克力）进行洗涤剂滴定。 　　所有NMR实验均以298 K的速度在800 MHz 1H Larmor频率的Bruker Avance光谱仪上进行 ，配备低温探针 。用CCPN分析所有NMR数据（版本3）
。For the resonance assignment of GB1–NINJ1(1–81), the following experiments were performed: 2D BEST-TROSY, 3D BEST-TROSY HNCO, 3D BEST-TROSY HNcaCO, 3D BEST-TROSY HNCACB, 3D BEST-TROSY HNcoCACB, 3D BEST-TROSY HNcacoNH, 3D BEST-TROSYHncocanh51。用0.6 mM [U-15N
，13C]标记的样品进行实验，该样品含有20 mM卫生钠和10％（v/v）D2O 。15N R2自旋弛豫测量测量在没有CPMG脉冲序列（10延迟值 ，总实验时间24小时）的50 µM GB1-NINJ1（1-81）样品上进行
，并用内部的Python脚本进行分析。 　　对于质量光度法测量值，在纯化后直接采集Hninj1样品 ，并使用SEC缓冲液稀释至纳摩尔浓度
。根据标准协议52进行了测量和数据分析。 　　对于HNINJ1的冷冻EM网格
，在SEC缓冲液（10 mM Tris-HCl，pH 8.0 ，150 mM NaCl，5％甘油和0.016％DDM）中
，蛋白质浓度为1.5 mg ml-1 。将4 µL的样品体积施加到排放的网格上（50 mA时30 s），并在液体乙烷中倒入5 s
。使用SeriaLem 3.8.353收集了在用K2峰顶检测器（GATAN）安装的Titan Krios（FEI）上收集冷冻EM数据。名义放大倍率为105,000× ，对应于每个像素的像素大小为0.82Å 。在多疗法中以40帧和4 s的总暴露量收集电影
，对应于47 e -2的电子剂量
。 　　HNINJ1数据集的所有电影都将导入到CryoSparc v3.2/v3.3.254中。最初，使用运动校正将电影对准 ，并使用贴片CTF测定确定对比度转移函数（CTF） 。使用细丝示踪剂进行初始粒子拾取
，其丝直径范围从30-60Å上的显微照片，然后用300个像素的盒子大小提取相应的颗粒
。经过几轮2D分类后 ，选择显示细丝的侧面或顶视图的类作为模板
，以在整个数据集中进行灯丝跟踪，总共获得3,900,041个提取的颗粒（框尺寸300像素）。经过额外的2D分类后 ，将1,085,837个颗粒用于从头开始生成 。通过检查从头算密度的检查与精确的2D类的功率谱分析
，我们估计了HNINJ1丝的螺旋参数
。通过进一步的2D分类进行了额外的颗粒清理，并通过针对低通滤波的灯丝密度进行异质改进后 ，我们能够进行最终的螺旋细化，产生冷冻EM密度
，该密度在校正了高阶畸变后，每次曝光的额外CTF校正和额外的CTF校正组导致了0.143 Gold-tastard Fourier shell shellial corluntial and corniality and corluntial a in 3.88 sh.88 88 88Å ，均为3.88Å
，均为3.8 8Å， ，均为3.8ÅÅ
，o异，均为3.8ÅÅ ，o异。-1.05° 。 　　使用UCSF CHIMERAX55提取单个螺旋亚基重复
，并使用COOT56进行了初始的De-Novo模型构建。初始模型构建由标准的聚丙氨酸螺旋和后来的Alphafold219结构预测在后来的一步中得到了帮助
。随后，将初始模型拟合到三个连续的HnInj1 frotomer密度的一个HNINJ1细丝 ，并在第二个相对的Hninj1丝中拟合了三个连续的HNINJ1 frotomer密度。然后使用UCSF Chimerax在原子坐标周围进行分区 。将六个-Protomer映射和模型放在带有P1空间组的新单元中
，用于随后的模型改进，使用phenix.Real_Space_refine6657中的默认设置 ，具有非结晶对称群的定义，限制了螺旋式亚基重复序列
。每一轮改进后
，使用Molprobity v4.5.2 Weberver58以及使用COOT手动调整了有问题或拟合不佳的区域的模型几何形状。重复此过程，直到模型的满意水平：MAP一致性和模型立体化学被实现（扩展数据表1） 。 　　使用EVCOPLINGS V2 WEBSERVER59进行进化耦合的计算分析
。选择了跨度33-144的HNINJ1（Uniprotid：Q92982）的查询顺序。采用了默认设置 ，除了“序列片段过滤器 ”选项增加到80％（默认值为50％）
，以便从多个序列比对中删除短片段序列 。在0.1 BITSCORE序列包含阈值下，选择进行进一步分析的结果
。基于HNINJ1细丝结构 ，进一步分析了EV耦合评分> 0.5的前100对。其中
，九个耦合的氨基酸对具有比分子内的分子间距离短 。不考虑Cα原子之间测得的距离以上12Å的距离对
。 　　将五个微量的0.02 mg ml-1纯化蛋白应用于发光的碳涂层铜网格。孵育1分钟后，将网格迅速在连续三滴去离子水中洗涤 ，并暴露于2％的2％乙酸铀酰溶液中 。图像记录在配备CCD摄像头的TEM（CM100
，飞利浦）上，像素大小为每个像素12Å ，而大型摄像机范围为18,000×至25,000×。 　　如前所述
，对蛋白脂质体进行了重组
。在由教皇（Avanti极性脂质）和POPG（Avanti Polar Pallipids）的3：1（wt：wt）脂质混合物制成的脂质体中重构纯化的NINJ1。使用0.4-μm聚碳酸酯过滤器通过挤出来制备脂质体 。通过与Bio-Beads SM-2（Bio-Rad）孵育，消除了重建过程中存在的洗涤剂
。通过超速离心回收蛋白脂质体 ，并将其重悬于缓冲液（20 mM Tris-HCl，pH 8.0
，150 mm NaCl，2 mMβ-巯基乙醇）中 ，浓度为120（OR 240）μm的蛋白质和20 mg Ml-Ml-Ml-1 ripid
，flas frozen n2 in 2 and in2 in 2，并使用了20 mg ml-ml。NINJ1突变蛋白脂质体以相同的方式制备 。 　　在测定缓冲液（20毫米HEPES ，pH 7.5
，150 mm NaCl）中稀释蛋白脂质体12.5次，并经过冷冻 - 透水周期以完全交换缓冲液
。硝基苯二唑 - 磷酸胆碱（NBD-PC）通过冻结周期掺入蛋白脂质体中 ，并使用0.4μm聚碳酸酯过滤器挤出。然后将蛋白脂质体用测定缓冲液稀释至0.5 mg Ml-1的脂质浓度
，并使用JASCO FP-6500光谱荧光计记录荧光（激发，470 nm;发射535 nm）在20°C下 。基线测量180 s ，然后加入5 mm的硫酸盐
，并记录荧光500 s直到高原
。最后，添加了0.5％的Triton X-100以破坏蛋白质体 ，并记录荧光60 s直到平稳。每样品通过三份测量 。将渗透率活性计算为渗透率= 100 - 200×（fdit - ftriton）/（有限 - ftriton），其中限制是起始荧光信号
，fdit是添加二硫代次结构后的高原值，而ftriton是添加triton x-100后的高原值
。 　　补充表1给出了所有模拟的概述。通过多刻度分子动力学模拟探测了HNINJ1聚合物的稳定性 。在多个复制品中 ，使用了多个数十µs的模拟时间
，采用了粗粒细粒的分子动力学模拟（马提尼分辨率）。使用CHARMM 36M力场进行了全原子分子动力学模拟，以补充这些长期模拟 ，并提供有关N端螺旋二级结构的适应性和灵活性的信息
。最近证明
，粗粒和全原子方法的相同组合对于由Gasdermin A326形成的膜穿孔聚合物的结构适应性和孔口开放很有用。HNINJ139-152的结构基于冷冻EM结构 。C末端负电荷，并且限制的N末端没有充电
。在一个对照模拟中 ，将α1和α2组合成单个螺旋中
，如AlphaFold2模型（螺旋包含残基40-70）19。在缺乏N末端螺旋的对照模拟中，使用了HNINJ176–152 。在用于研究N末端与膜表面相互作用的系统中 ，还包括N端粘附基序（NAM）
，从而导致HNINJ120-152
。质膜模型由1-甲状腺素-2-烯酰基-SN-甘油-3-磷酸胆碱（POPC），胆固醇 ，1-甲米酰基-2-烯酰基-SN--甘油-SN-甘油-3-磷酸乙醇胺（POPE）（POPE）和1-甲米酰基-2-烯酰基-2-烯酰基-SN-SN-SN-SN-SN-SN-SN-SN-SN-3-3-30：30：5 Momeryl-3-3：5 Momeyloylyliony（in 30：比率和脂质对称分布在两个传单中，从而模仿凋亡状态。在标记为“不对称
”的模拟中
，代表原源性状态，教皇和流行音乐在两个小叶之间不对称分布 ，其中POP仅位于细胞质中
，仅位于细胞外膜叶片中 。使用工具shane61和（在平衡或出于可视化目的之后）制备膜 - 蛋白质系统 使用向后62转换回原子分辨率
。 　　所有模拟均使用Gromacs 2020或202163,64在室温（293 K）进行。在全原子模拟中，CHARMM 36m65,66与TIP4P Water Model67结合使用 。有关模拟设置参数的详细信息 ，请参见我们最近的出版物68
。在“无尽”线性聚合物的情况下
，沿聚合物的盒子的可压缩性设置为4.5×10-7 bar -1。对于HNINJ1丝的粗粒胶模拟，尽管其计算效率较低 ，但使用了Martini2力场的两极分化变体69,70,71
，因为我们对双丝细丝的初始测试模拟和文献数据都表明，可偏振的Martini2能够维持纤维纤维或纤维结构72 。仿真参数取自De Jong等人 ，如Gromac 5或更新且可极化的Martini273所建议。我们使用Martini3来估计N末端与膜表面的相互作用
，因为Martini2高估了两亲性肽与脂质膜的膜结合74,75
。模拟参数可以在我们以前的工作26中找到。HNINJ120-152的残基特异性膜相互作用概率估计为每个模拟中脂质的接触中每个残基的概率（小于0.63 nm）（n = 10） 。 　　用配备三个平行二氧化硅涂层传感器的Biolin Scientific的QSENSE分析仪进行实验（QSX 303）
。在实验之前，将传感器在Zepto等离子体清洁器中清洁30 s ，并以耗散（QCM-D）检测室内安装在石英晶体微生物中。为了制备有支撑的脂质膜，由DOPC（18：1（Δ9-CIS）PC的氯仿储备溶液的混合物制备了小的单层囊泡； 1,2-二烯酰基-SN-甘油-3-甘油-3-3-磷酸磷酸）和DOPS（18：1磷酸磷脂； 1,2-sn-sn-sn-sn-sn-sn-sn-sn-sn-sn-sn-sn-sn-sn-sn-pyloseoyl-s-2-glyslosplosylsiployyl-s-2-磷酸甘油磷脂 - 磷酸甘油磷酸磷酸酯；在100：0：0
、80：20或60:40（DOPC：DOPS）的比率分别为250 µm的三个系列测量值 。小囊泡被破坏
，通过用氯化钙处理形成支撑的双层
。在传感器上形成双层后，注入缓冲溶液并记录信号 ，直到达到稳定的频率信号（设置为零）。随后
，在M9培养基中表达并如上所述纯化的GB1 -NINJ1（1-81）的溶液注入了浓度，并记录了频率的时间过程（第五声音谐波） 。频率变化是ΔF ，作为注射前频率的高原值与注射后达到平衡的频率之间的差异76
。所有实验中的流速为20 µl min -1
，温度设置为25°C。使用独立的蛋白质和独立制备的脂质双层的独立生产批次获得了重复的实验 。 　　如GSDMD孔形成测定方案77所述，进行了脂质体穿孔测定法
。DOPC和DOPS脂质购自Avanti Polar Lipids。将浓度为5 mg mL -1的氯仿脂质溶液轻轻干燥在氮气流动下的薄膜中 ，并将其放置在真空下过夜
，以进一步蒸发任何残留溶剂 。为了制备染料填充的脂质体，将干脂质膜用0.5 mL的50 mM HEPES ，50 mM NaCl
，70 mM 6-羧基氟氟烷素，pH 7.5在37°C摇动2小时。将脂质分散液进行10个冻融周期 ，并通过100 nm聚碳酸酯膜挤出了20次脂质体
。通过动态光散射（DLS）验证脂质体的平均尺寸直径。通过通过PD-10柱（GE Healthcare）的纯化步骤（GE Healthcare）实现了左右染料的去除 。所有脂质体均在4°C下储存，并在24小时内使用
。 　　使用含有由100％DOPC或80％DOPC和20％DOPS组成的脂质体的6-羧基氟菌素进行膜泄漏实验。通过在50 mM HEPES缓冲液
，150 mM NaCl，pH 7.5中稀释10毫米的总脂质浓度来制备样品 ，并补充了不同浓度的NINJ140-60肽
，或其拼凑型版本（IAAAAAAAMKMYLANSLENSLENHAKSLKSLKSLKV VLASLKV VLASTSE）或5％DM，通过测量染料稀释和随后的去Quence产生的终点荧光来检测膜泄漏 。实验是在Corning 96孔板中进行的 ，并使用带有激发和发射波长的Tecan火花板读取器记录荧光
，分别在485 nm和535 nm处记录
。通过将Triton X-100添加到脂质体溶液中导致的排放强度来计算染料释放的百分比。 　　使用SoftWares Gen5，GraphPad Prism V9和Microsoft Excel进行数据分析 。使用学生的两尾t检验（用于两组的比较）或单向方差分析（ANOVA）与Dunnett的多重比较测试进行比较时 ，对统计显着性进行了评估
。*p <0.05
，** p <0.01，*** p <0.001和**** p <0.0001。 　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得 。