使用先前研究中描述的方法对本研究中使用的臀部细胞系进行了验证 。全基因组全基因组的单核苷酸多态性（SNP）基因分型是使用费城儿童医院的Illumina全基因组GSAMD-24V2-0 SNP微阵列进行的
。对培养物进行了测试并保持不含支原体。总共使用了从五个健康参与者收集的成纤维细胞衍生的五个对照髋部细胞系进行实验13（补充表1） 。其中两个对照髋关节细胞系用于生成SCN9A KO髋关节细胞系 ，并使用一个对照髋部细胞系生成SCN9A功能获得的臀部细胞系。实验的批准是从斯坦福大学的机构审查委员会小组获得的
。所有参与者获得了知情同意。 　　根据斯坦福大学研究合规办公室批准的协议
，获得了人类脑组织样品 。PCW15组织在冰上输送，到达后立即解剖DRG
。 　　为了进行神经分化 ，将臀部细胞培养在涂有玻璃纤维素涂层的板（A14700； Life Technologies）中的8培养基（A1517001； Life Technologies）中。每4-5天用Ultrapure 0.5 mm EDTA，pH 8.0（15575; Thermo Fisher Scientific）每4-5天传递细胞 。为了生成区域化的神经器官
，将臀部细胞与ACCUTASE（AT104；创新细胞技术）在37°C下孵育7分钟，并分离为单个细胞
。可选的是 ，在器官形成前1-2天
，将臀部细胞暴露于1％的二甲基硫氧化物（472301; Sigma-Aldrich）中，在Essential 8培养基中。为了聚集到类器官中 ，将约3×106个单个髋关节细胞在每根胶800板中播种在必需的8个培养基中
，并补充了含有Rho相关的含有激酶（岩石）抑制剂Y27632（10 µm; S1049; S1049; SELECKCHEM），在100g时以3分钟和3分钟为37°C°C的固定型抑制剂Y27632（10 µm; S1049; SERCHECKCHEM）的播种 。在第二天（第1天） ，收集了大约10,000个细胞的类器官
，并将其转移到Essential 6培养基（A1516401; Thermo Fisher Scientific）中的超低附件（3262; Corning）中，并补充了图案分子 ，如图1所示
。 　　如先前所述
，生成HCO 10,55。在第1-6天，每天更改必需的6个培养基 ，并补充背酚（2.5 µm； P5499； Sigma-Aldrich）和SB-431542（10 µM; 1614; R＆D系统），并每天更改 。在第7天
，将器官转移到含有神经质A培养基（10888022; Thermo Fisher Scientific）的神经培养基中，B-27补充剂 ，减去维生素A（12587010; Thermo Fisher Scientific）
，谷氨酸glutamax补充剂（1：100; 35050079; 35050079; Thermo Fishericific），1000 70 000（1000 70; 1000; 1000; 1000;Thermo Fisher Scientific） ，补充了FGF2（20 ng ML-1; 233-FB; R＆D系统）和EGF（20 ng ML-1; 236-EG; R＆D系统）直到第22天
。450-03; peprotech）
， - 抗甲酸2-磷酸三孢子盐（200 µm; 323-44822; wako），N6 ，2'-o--o-二甲苯丙酰胺3'''
，5'-cycycliclyladenosine 3'，5'-cyclicclin16 ，19-二甲己己烯酸（10μM； D2534; milliporesigma）。从第47天开始
，使用含有神经A培养基的神经培养基进行培养基的变化（每4天） 。 　　如先前所述，生成HDIO11。在第1-6天 ，每天更改必需的6个培养基，并补充背酚和SB-431542
。在第5天
，该培养基还用1μMCHIR（S1263; SelleckChem）补充。在第7天，在补充CHIR的神经培养基中维持了类器官 。在分化的第9天 ，除了CHIR外
，神经培养基被补充了100 nm的下垂（第9-15天； 566660-1mg； Milliporesigma）
。此外，除了上述化合物外 ，在分化的第12-18天分化的第12-18天还补充了30 ng ml-1的BMP7（120-03p; peprotech）。从第19天到46天
，神经培养基添加了BDNF，NT3 ， - 2-磷酸三磷酸三硫酸盐
，CAMP和CIS-4 、7
、10、10 、13、16
、19-二角己烯酸 。在第19-25天，添加了DAPT（2.5μm ，72082； Stemcell Technologies）
。从第47天开始
，使用含有神经A培养基的神经培养基进行培养基的变化（每4天）。 　　为了产生HDSPO，从第1天到第6天 ，在补充了SB-431542和背酚的基本的6培养基中，类器官被维持 。从第5天到第6天
，添加了CHIR（3μm）
。在第7天，将类器官转移到补充EGF ，视黄酸（0.1μM； R2625; Sigma-Aldrich）和Chir（3μM； S1263; Selleckchem）的神经培养基中。在第22天
，该培养基添加了BDNF，CAMP ， - 抗甲酸2-磷酸三硫酸盐盐
，胰岛素样生长因子1（IGF-1）（10 ng ml-1; 100-11; peprotech），直到实验结束 。从第22天到第28天 ，添加了DAPT
。 　　为了产生HSEO
，从悬浮液中的第1天到第6天，在补充了SB-431542的基本培养基中 ，类器官被维持。从第1天到第4天
，添加了BMP4（5 ng mL; 120-05et; peprotech） 。从第3天到第5天，添加了Chir（600 nm）。在第6天的悬浮液中 ，将类器官转移到补充SB-431542的神经培养基中
。从第9天开始，对BDNF
，GDNF（25 ng ml-1; 450-10; peprotech）和NGF（25 ng ml-1; 450-01; peprotech）进行了补充，直到实验结束。从第9天到第14天 ，培养基补充了SB-431542 。从第15天到第20天
，包括DAPT
。 　　在4°C的4％多聚甲醛/磷酸盐缓冲盐水（PBS）中固定器官和组合物。然后将它们在PBS中洗涤，并将其转移至30％的蔗糖/PBS 2-3天 ，直到器官/组装量沉入溶液中 。随后
，它们被用最佳切割温度（OCT）化合物（Tissue-Tek Oct Compound 4583; Sakura Finetek）和30％的蔗糖/PBS（1：1）冲洗，使用干冰嵌入并冻干
。对于免疫荧光染色 ，使用Leica CM1860低温恒温器切割30 µm厚的部分。用PBS洗涤冷冻切片
，以从切片中去除多余的OCT化合物，并以10％的正常驴血清（NDS ，S30-100ML; Milliporesigma）
，0.3％Triton X-100（T9284-100ML; Milliporesigma）和1％BSA在室温下稀释1 h，在室温下稀释1％BSA 。然后将切片与在含有2％NDS和0.1％Triton X-100的PBS中稀释的原代抗体一起在4°C下孵育过夜
。PBS用于洗涤初级抗体 ，并将冷冻切片与PBS中的二级抗体与含有2％NDS的PBS和0.1％Triton X-100孵育1小时。The following primary antibodies were used for staining: anti-FOXG1 (rabbit; M227; 1:400 dilution; Takara), anti-TCF7L2 (rabbit; 2569S; 1:200 dilution; Cell Signaling Technology), anti-PHOX2A (rabbit; ab155084; 1:200 dilution; Abcam), anti-BRN3A (mouse; MAB1585; 1:200 dilution;SIGMA），抗MCHERRY（山羊； ORB153320; 1：1,000稀释； Biorbyt）
，抗NK1R（兔子； S8305; S8305; 1：200稀释; Sigma; Sigma; Sigma），抗VGLUT2 ，鼠标（山羊; AF3364; 1：200稀释； R＆D） 。使用以下二级抗体进行染色：Alexa Fluor 647辅助驴抗兔IgG（H＆L）（711-605-152; 1：1,000稀释; Jackson Immunoresearch）
，Alexa Fluor 568 Donkey Antike Anti-Goat Goat Igg（H＆l）（H＆L）（A11057; 1：1,000;568驴抗兔IgG（H＆L）（A10042; 1：200稀释； Thermo Fisher Scientific），Alexa Fluor 647驴抗小鼠IgG（H＆L）（A31571; 1：200稀释； Thermo Fisher Scientific）和Alexa Fluor 568 Donkey Antike Anti抗小鼠IgG（H＆l）（H＆L）（A10037; 1：1,000 DiLution; Thermo dialution; Thermo dielution; Thermo Fishericific）
。用Hoechst 33258染料（H3549; 1：10,000稀释;生命技术）可视化细胞核。使用Aqua-Poly/Mount（18606; Polysciences）或Vectashield（H-1000； Vector Laboratories）安装冷冻切片以在载玻片上进行显微镜 ，并在共聚焦显微镜上成像 。使用斐济（V.2.14.0）和Imaris（牛津仪器）处理和分析图像。 　　在同一管中收集了三到五个类器官
，并被视为一个样品
。使用Rneasy Plus迷你试剂盒（74136; Qiagen）分离样品中的RNA。通过使用上述III的第一链合成超级词QRT-PCR（11752250; Thermo Fisher Scientific）的逆转录来制备模板cDNA 。使用SYBR Green PCR Master Mix（4312704; Thermo Fisher Scientific）在QuantStudio 6 Flex实时PCR系统（4485689; Thermo Fisher Scientific）上进行QPCR
。补充表2列出了本研究中使用的引物。 　　如先前所述的10,49,56,57，进行了类器官 ，组装和人DRG的解离 。对于类器官解离
，将四到五个随机选择的类器官汇总以获得单细胞悬浮液
。对于组装小组，将一到两个组合物汇总进行解离。为了匹配不同区域之间的相对细胞数 ，仅在比较器官与组合物进行比较时
，才将四个区域中每个区域的一到两个类器官（总计四到八个器官）合并 。对于人类原代组织，将一到两个DRG汇总进行解离
。将样品在30 U ML -1的木瓜蛋白酶溶液（LS003126 ，Worthington Biochemical）和0.4％DNase（12,500 U ML -1; LS2007，Worthington Biochemical）37°C下孵育45分钟。酶解离后
，用含有蛋白酶抑制剂的溶液洗涤器官，并轻轻进行三杆以获得单细胞悬浮液 。将细胞重悬于0.04％BSA/PBS（B6917-25mg ，Milliporesigma）中
，并通过70μm流量细胞过滤器（H13680-0070，BEL-ART）过滤 ，并计数细胞数量
。为了恢复靶向7,000个细胞
，每条车道上每条车道上加载了约11,600个单元3'芯片（铬铬芯片芯片芯片G单细胞盒； PN-1000127、10X基因组学），cDNA库是由铬铬库产生的基因组学）根据制造商的说明。使用Illumina Novaseq S4 2×150 bp（Admera Health）和Novaseq X 28+90 BP（CZ BioHub）对每个库进行测序 。使用“计数”函数（–include-Introns = true）进行唯一的分子标识符（UMI）计数（v.7.0.1.1和7.1.0 for Oranoids; V.7.2.0; V.7.2.0 v.7.2.0 v.7.2.0 for Human Drg和Organoid vers-Organoid verstus versus versus versus versus versus versus inters versus versus insemboloid comportish（可用于GRCH38/ENSEMBL 98参考）https://cf.10xgenomics.com/supp/cell-exp/refdata-gex-gex-grch38-2020-a.tar.gz）。使用R软件包Seurat（V.4.3.0）进行了进一步的下游分析
。从计数基质中除去X或Y染色体上的基因 ，以避免由于臀部细胞系的性别而导致聚类的偏见。 　　为了在四个区域器官之间进行比较
，本研究中的HSEO样品（n = 4）和HDSPO样品（n = 5）以及HDIO样品11（n = 3; GSE224766）和HCO Samples13（n = 2; GSE145122）使用“ AGGR ”函数（–Normant function（–Normate）infactect in -normal alime = m- m- m- m- m- m- m- m-normipe = m- m，排除了超过2,000个UMI计数或线粒体含量高于15％的7,500多个或少于2,000个基因的细胞 。分析中未包括至少三个细胞中未表达的基因
。使用全局尺度归一化方法（归一化方法；“ logNormization
”；比例因子10,000）进行标准化基因表达 ，并选择了2,000个最大的基因（选择方法；'VST'）和缩放（平均= 0
，而差异为每个基因）。使用“ Findneighbors”和“ Findclusters ”功能以及使用UMAP可视化的前50个主要组件（PC）用于聚类（1.0分辨率） 。根据已知标记基因的表达对簇进行注释
。 　　为了分析HSEO和HDSPO，排除了超过2,500个检测到的基因 ，少于2,000个UMI计数或线粒体含量高于15％的细胞的细胞被排除在外。不包括在每个文库中至少三个细胞中未表达的基因 。如上所述，进行了归一化和可变基因检测
。使用默认参数的“ FindIntegrationancher”和“ IntegratedAta
”函数分别集成了HSEO样品（n = 4）和HDSPO样品（n = 5）。前10个PC用于使用“ Findneighbors”和“ Findclusters ”功能的聚类（分辨率为1.0）
，并使用UMAP可视化 。The classification of dorsoventral neuronal cell types of hdSpO was performed based on the combinatorial expression of known markers, as described previously38,39, by using ‘doCellPartition’ function (cell_level_min_step1 = 2, cell_level_min_step2 = 1; available at github.com/juliendelile/MouseSpinalCordAtlas). 　　对于类器官与组合的比较，排除了超过10,000个或小于1,000个检测到的基因或线粒体含量高于15％的细胞的细胞
。不包括在每个文库中至少三个细胞中未表达的基因。归一化和可变基因检测后 ，整合并聚集了单个器官样品（n = 4）和集成样品（n = 4）（30 pcs;分辨率= 1） 。 　　对于人类DRG数据
，排除了超过10,000或少于500个基因或线粒体含量高于10％的细胞的细胞。不包括在每个文库中至少三个细胞中未表达的基因
。归一化和可变基因检测后，整合了人DRG样品（n = 7）。进行UMAP可视化和聚类（30个PC；分辨率= 1） 。还集成了人类DRG样品（n = 7）和HSEO样品（n = 4）
。使用Gruffi58去除推定的应力细胞后 ，进行了额外的集成
，UMAP可视化和聚类（30 PC；分辨率= 2）。 　　作为标签从人体组织数据集转移到四个区域特异性器官数据集的参考，Braun等人的参考（可在https://github.com/linnarsson-lab/linnarsson-lab/developing-human-brain）中被降低 ，如我们先前的研究59中所述
，并与人类Dr don donor一起使用，如上所述 。在Braun等人中
。将后脑 ，PON和髓质的数据
，后区域标记分为后脑。为了将背腹亚域信息的标签转移到HDSPO上，Rayon等人 。开发脊髓数据38（GSE171892）是用相同标准（如原始论文中描述的相同标准）过滤的质量控制（QC） ，并使用每个供体作为批量进行了集成
。每个子区域的预测得分是使用50个PC的“ Findtransferanchor
”和“ TransferData”函数计算的。对于每个单元，将最高预测评分的子区域分配为其预测子区域 。如果最高分数小于0.5
，则预测的子区域被标记为不确定的
。通过将每个类器官条件中的细胞数量除以给定的子区域预测的细胞总数除以该子区域预测的细胞总数来计算预测比例。 　　为了产生组合物，区域化的类器官分别分化 ，然后通过将它们放置在近距离的位置来组装 。对于两部分组合物
，通过将其放入1.5 ml的Eppendorf管中融合了感兴趣的类器官，将其放入孵化器内2-3天。对于三部分或四部分组合体 ，通过将它们放入倾斜的六孔超低附着板（第3471号；康宁）中1周来整合感兴趣的类器官
。组装后
，将组合物保持在超低附着板（24孔或六孔板）中，每4-7天进行中等变化。对于三部分或四部分的组合物 ，将六孔超低附着板保持在孵化器中 。用于四部分组合物的神经培养基补充了BDNF（20 ng ml-1; 450-02; peprotech）
，GDNF（25 ng ml-1; 450-10; peprotech），ngf（25 ng ml; 450-01; peprotech; peprotech） ， - cascorbic 2--盐盐（25 ng ml; peprotech;323-44822;在体外发育的过程中
，神经元成熟的时机沿rostro-audal轴差异
。已经考虑了这种梯度，特别是在产生由类似于空间分离大脑区域的器官组成的组装物（例如HCO和HSPO8）。沿着同一条线 ，我们通常将更先进的HCO和HDIO（第90-120天）与更早的HDSPO和HSEO（第40-70天）集成在一起 。 　　如先前所述，进行了类器官的病毒感染60
。简而言之
，将两个或三个类器官放在1.5 mL的Eppendorf管中，该管子中含有200μl病毒的200μl培养基 ，并在37°C和5％CO2下孵育过夜。第二天
，加入了800 µL新鲜培养基 。第二天，将神经器官转移到超低附着板中的新鲜培养基中
。对于狂犬病病毒逆行追踪 ，用AAV-DIO-TDOMATO标记了代表“突触前 ”部分的类器官
，代表“突触后
”部分的类器可以用Rabies-ΔG-CRE-GFP和AAV-EF1α和AAV-EF1α:::::::: cvs-G分别标记。病毒感染两天后，组装了器官 。整合3周后 ，用4％多聚甲醛固定组装量并进行免疫细胞化学处理
。对于狂犬病病毒追踪和钙成像实验
，将HDSPO用AAV-EF1α:: FDIO-GCAMP6F标记，并且HDIO用Rabies-ΔG-FLPO-DSREDEXPRESS和AAV-FLPOSS和AAV-EF1α:: cvs-g分别标记了HDIO。对于四部分组合物的GCAMP病毒感染 ，将一个单个组合物在37°C和5％CO2的200μl培养基中培养过夜 。第二天
，增加了4毫升新鲜培养基。 　　这项研究中使用的病毒是AAV-DJ-HSYN1 :: EYFP（GVC-AAV-16; Stanford University neuroscience Gene基因载体和病毒核心），AAV-DJ-EF1α:: CVS-G（由斯坦福大学神经科学基因载体和病毒核心使用添加剂质子质质子质子质子质子化
。（GVVC-AAV-169;斯坦福大学神经科学基因载体和病毒核心） ，AAV-DJ-HSYN1 :: mturquoise2（由斯坦福大学神经科学基因载体和病毒使用addgene质粒编号和病毒核心生产载体和病毒核心），狂犬病 - ΔG-CRE-GFP（SALK）
，RABIES-ΔG-FLPO-DSREDEXPRESS（使用Addgene质粒编号32650），AAV1-EF1α:: FDIO-GCAMP6F（NO。128315-AAVEN） ，lenti-Hsyn1 :: jgcamp 8VectorBuilder）
，AAV1-HSYN1 :: CRE（编号105553； Addgene）和AAV-DJ-EF1α:: Dio-GCAMP6S（GVVC-AAV-91； Stanford University neuroscience Gene vector and Virus Core） 。 　　为了在化学注射过程中实现完整的3D器官或组件中没有明显样品运动的单细胞实时钙成像，我们在成像之前将样品急剧连接到乙烯亚胺聚合物（PEI）聚合物（PEI）涂层的盖玻片上
。将高压灭菌的12毫米盖玻片在水中用0.01875％PEI（第03880名； Sigma编号）涂覆 ，在37°C下至少1小时
，然后在使用前用水清洗3次。小心地将类器官或组件放在PEI涂层的盖玻片上，并组装了L形管型Chamlide CMB室（CM-B12-1PB； Live Cell仪器） 。该腔室连接到蠕动泵（第702027号；哈佛设备） ，以通过出口孔建立连续的吸力
。为了防止样品干燥
，组装后立即应用车辆溶液。有机形和组合物具有可检测的遗传编码钙指标和表现基线活性的表达 。 　　将实时成像室转移到共聚焦显微镜阶段（Leica Stellaris 5或SP8），并在受控的环境条件下（37°C和5％CO2）使用×5或×10物镜在受控的环境条件下使用LAS X软件（Leica）对样品进行成像
。我们等待5-10分钟 ，然后以每帧约0.436 s的速度开始延时活成像
，每个样品进行调整。对于成像自发活性模式，记录了钙活性3-5分钟 。为了捕获化学注射后的钙反应 ，我们记录了60 s基线活性
。此后，以慢速（约2 ml min-1）的速度注入了30 s以上
，以最大程度地减少样品的任何潜在运动，将溶解在车辆中的αβ-meatp或辣椒素（第0462号； 　　为了进行分析 ，手动绘制了感兴趣的区域（ROI）
，并使用斐济（V.2.14.0）出口原始荧光强度。使用MATLAB（V.R2023A），将原始的荧光强度转化为荧光的相对变化：ΔF/fbase =（f（t） - fbase）/fbase ，其中FBase是会话的较低的第五百分点值 。在化学注射前后
，比较了每个细胞中ΔF/FBase的平均幅度幅度。 　　如图2G所示，将补充BDNF（20 ng mL -1） ，GDNF（25 ng ml -1）和NGF（25 ng mL -1）的神经介质用作车辆溶液
。基线成像1分钟后
，将30μM的αβ-摄氏度或3μM辣椒素注入腔室。 　　如图2K所示，使用了补充BDNF（20 ng mL -1） ，GDNF（25 ng ml -1）和NGF（25 ng ml -1）的神经培养基 。将HSEO与溶解在车辆溶液中的各种浓度的TNP -ATP（10 、100或100,000 nm）一起孵育
。基线成像1分钟后
，将30μM的αβ-摄氏度注入腔室中。 　　如图3Q所示，R组装物在成像之前急性连接到PEI涂层的12孔细胞培养板上 。将板移到显微镜阶段 ，并在打开板的盖子时进行成像
。补充BDNF，GDNF和NGF的神经介质被用作车辆溶液。在1 mL载体溶液中的基线成像1分钟后
，在成像过程中添加了500μl的αβ-摄氏度（90μm），以使30μμμμμμmEATP 。成像6分钟后 ，将样品与NBQX（50μm；No
。0373; Tocris）和APV（50μm；No。0106; Tocris）在孵化器中孵育30分钟 。如上所述
，在NBQX和APV的存在下进行了αβ-meatp的钙反应
。 　　As shown in Fig. 4e,f, Dulbecco’s phosphate-buffered saline (DPBS) with calcium, magnesium (SH30264.01; Cytiva) or artificial cerebrospinal fluid (aCSF; containing 124 mM NaCl, 3 mM KCl, 1.25 mM NaH2PO4, 1.2 mM MgSO4, 1.5 mM CaCl2, 26 mM NaHCO3添加谷氨酸（35050061; Gibco）和10毫米 - （+） - 葡萄糖）用作车辆溶液。基线成像1分钟后，将3μM的αβ-meatp注入腔室中 。 　　如图2所示。4K ，L和5F
，G，ACSF用作车辆溶液
。 　　使用SCA42定量钙迹线之间的相关性。首先将痕迹在1秒的间隔上平均 ，并分为20 s长的段 。Pearson相关系数（R）是在相应的段之间计算的
，并且在所有段中平均
。对于在[-20，20] s范围内的每对钙迹线的范围内重复多个时间滞后 ，并以1秒的移动步骤重复该分析。跨时间滞后的峰值相关值被视为钙信号之间同步的量度 。这种方法在短时间内的信号之间产生了准确的相关性估计
，而不论较长时间的共同激活如何
。 　　使用共聚焦显微镜（Leica SP8）中的×5物镜在环境控制条件下（37°C）成像αSSEMBLOIS。对于谷氨酸分离实验，在ACSF中使用了2.5 mm的最终浓度 ，将MNI叶片 - 谷氨酸（1490; Tocris）使用 。Leica SP8共聚焦显微镜的FRAP软件模块用于使用紫外线（405 nm）进行谷氨酸脉冲
。在每秒2.3帧的帧速率下，一个试验由50帧用于刺激前
，三个紫外线刺激（指定的ROI）和100帧用于刺激后刺激；对一个样本应用了三个试验。如上所述，通过比较紫外线照明之前和之后的50帧（21.8 s）中ΔF/FBase的平均值 ，如上所述
，每个样品使用三个试验的平均值 。 　　在同一管中收集了三到五个类器官，并被视为一个样品
。使用RIPA缓冲系统（SC-24948； Santa Cruz Biotechnology）制备样品的全细胞蛋白裂解物。使用二氨酸酸测定法（Pierce; CatalogNo 。23225; Thermo Fisher Scientific）对蛋白浓度进行定量。对于电泳 ，将每条车道的30 µg蛋白质加载
，并在4–12％的Bis-Tris Page凝胶上运行（螺栓4–12％Bis-Tris蛋白凝胶；目录NO.NW04122Box; Invitrogen）并转移到聚乙烯基二氟二氟化物膜（Immbrane-Fore）上（Immbilon-fore）
。Membranes were blocked with 5% BSA in tris-buffered saline with Tween (TBST) for 1 h at room temperature and incubated with primary antibodies: anti-glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (mouse; 1:5,000; GTX627408; GeneTex) for 1 day and anti-NaV1.7 (rabbit; 1:1,000, ASC-008; Alomone实验室）持续6天。Membranes were washed three times with TBST and then incubated with near-infrared fluorophore-conjugated species-specific secondary antibodies (Goat Anti-Mouse IgG Polyclonal Antibody (IRDye 680RD; 1:10,000; 926-68070; LI-COR Biosciences) or Goat Anti-Rabbit IgG Polyclonal Antibody (IRDye800cw; 1：10,000;二级抗体应用后，用TBST将膜洗涤3次 ，然后用TBS洗涤一次
，然后使用Image Studio软件（V.5.2; Li-Cor）使用Li-Cor Odyssey CLX成像系统成像 。使用Image Studio软件或斐济（V.2.14.0）分析蛋白质印迹（有关完整印迹）
。 　　使用Leica TCS SP8或Leica Stellaris 5共聚焦显微镜，在环境控制的条件下 ，目标区域中的EYFP+投影成像。将组合物转移到细胞培养基中24孔玻璃底板（P24-0-N； Cellvis）中的井中
，并在成像之前在环境控制的室内孵育15-30分钟 。使用×10目标拍摄图像，以100μm的深度捕获整个目标区域
。使用斐济（V.2.14.0）对预测进行了量化。手动绘制ROI ，以覆盖以最大投影共聚焦堆栈测量的目标区域 。在二元图像中计算了目标区域上荧光阳性像素的百分比
。 　　使用斯坦福大学的实验室动物护理行政小组批准的方案获得了小鼠组织样品。从查尔斯河实验室获得了妊娠11天的定时怀孕CD1小鼠，并保持在12小时的光线周期
，环境温度为20-26°C，湿度为30-70％ 。我们在妊娠的第13天用异氟烷麻醉了怀孕小鼠 ，在本研究中使用E13.5胚胎而不知道它们的性别
。将DRG从E13.5胚胎中解剖
，将En Bloc放在PEI涂层的12孔板上，并在DRG培养基（补充BDNF ，GDNF
，NGF和10％FBS的神经培养基中培养）。解剖后第二天进行钙成像 。 　　如扩展数据所示，将小鼠DRG与Calbryte 520 AM（10 µm;No。20653; AAT BioQuest）一起孵育
。45分钟后 ，将培养基更改为1 mL DRG培养基。为了成像小鼠DRG的钙活性
，将包含小鼠DRG的全细胞培养板移至环境控制的共聚焦显微镜阶段 。打开板的盖子时进行成像
。基线成像1分钟后，将溶解在DRG培养基中的500μLα-meatp（90μm）或辣椒素（10μM）通过移植而无需接触细胞培养板（以防止XYZ运动） ，将溶解在DRG培养基中的糖苷（10μM）添加到井中。成像进行6分钟 。激动剂的最终浓度为30μM（αβ-摄氏度）和3.3μm（辣椒素）
。 　　如图2L
，M，小鼠DRG与上述520 AM一起孵育 ，并与各种浓度的TNP -ATP（10
、100或100,000 nm;NO。2464; Tocris）一起孵育，溶解在孵化器中30分钟的DRG培养基中 。用TNP – ATP进行基线成像1分钟后
，将DRG培养基中的500μLα-Meatp（90μM）添加到井中
。成像进行6分钟。 　　如前所述，进行了细胞外记录 。将组合物嵌入3％的低融化凝胶琼脂糖（IB70056； IBI Scientific）中
。将嵌入的样品置于脑切片室2（S-BSC2；科学系统设计）上 ，并在37°C下用ACSF灌注（用95％O2和5％CO2冒泡）。通过连接到比例温度控制器PTC03（S-PTC03； Automate Scientific）来控制温度并保留在37°C下 。急性32通道P-1探针
，带有两个柄（Assy-37 P-1； Cambridge Neurotech），连接到急性探针适配器；32-通道SAMTEC到Omnetics（ADPT A32-OM32； Cambridge Neurotech）。使用INTAN 1024CH记录控制器（Intan Technologies）以30,000 Hz的速度使用RHX软件（v.3.1.0）获取基线活动5分钟
。使用Intan Technologies代码处理原始记录数据 ，并使用MATLAB（V.R2022A; MathWorks）进行分析。 　　为了分析细胞外记录数据
，进行带通滤波（350-2,000 Hz），然后进行常见的中位参考 。每个通道的阈值（乘以S.D.的六倍）用于计数神经元活动
。HDSPO ，HDIO或HCO的活性的计数为HSEO通道的每种活性±500 ms。基本面积（B）/（P+B）中峰面积（P） - 活性计数周围的活性计数用作共激活指数44 。参数（bin尺寸
，5 ms；地块大小，±500 ms）用于绘制代表性的跨绩效图
。 　　为了生成SCN9A KO细胞 ，由Synthego设计和合成了三个单个指导RNA（SGRNA）
，以诱导一个或多个片段缺失。SGRNA序列如下：5'-Agcucuguagugccauauca-3'，5'-cguguguguagucucucuccag-3'和5'-ucucuuguguguguguguguguguguguguguguguguguguguguguguguguguguguguguguguguguguguguccugucaccugu-3' 。将臀部细胞与ACCUTASE分离 ，并将50万细胞与300 pmol SGRNA和40 pmol Cas9蛋白（SPCAS9 2NLS核酸酶（1,000 pmol）； Synthego）混合
。使用P3主要细胞4D-核型X试剂盒（V4XP-3032; Lonza），4D-核对象核心单元和X单元（程序CA-137; Lonza）进行核能。然后将细胞在补充岩石抑制剂Y27632（10 µm）的必需的8培养基中
，将细胞播种到玻璃蛋白包被的六孔板上 。必需的8培养基用于每日培养基
。合并细胞的基因型由PCR用底漆集FW，5'-CGAGAACTACCCATATTATTATATTAGTGATGG-3'确定；RV ，5'-CCAAGAACTATCACAAAAACGTCTGT-3'和SANGER测序（Genewiz）用反向引物进行。 　　SCN9A功能获得的细胞是使用两步无疤的基因组编辑来通过Bayspair生成的 。62。使用PCR与引物集FW
，5'-GTGTTTGGACCCCATGTTTC-3'进行基因分型；RV，5'-GAAGTAGTGTCTCTGAGGGGAGATC-3'和SANGER测序（Genewiz）用反向引物进行
。 　　如先前所述 ，进行了贴片钳记录。简而言之
，HSEO首先在组装前被Lenti-Hsyn1 :: Chr2-eyfp感染，然后与HDSPO集成以创建HSEO-HDSPO组装 。随后将这些组装物感染了AAV-DJ-HSYN1 :: MCHERRY ，并将其放置在六孔板中的细胞培养插入物（0.4 µm孔径； 353090; Corning）上
，形成扁平的组合体
。录音通常在第148-164天（DAF 99-110）进行。使用直立显微镜鉴定了HDSPO中的麦克利阳性神经元 。为了进行光遗传学刺激，通过一个×40物镜应用了全场发光二极管照明（460 nm; 5–20 ms持续时间；最大功率； COOLLED） ，并以-70 mV的持有潜力记录OEPSC
。 　　在室温下
，使用配备了Infinity2电荷耦合的设备摄像头和Infinity Capture Software（Teledyne Lumenera）的直立显微镜（Scientifica）对全细胞配置中的贴片钳记录进行了可视化。外部ACSF记录解决方案包含124 mM NaCl，3 mM KCl ，1.25 mm NAH2PO4、1 mM MGSO4 、2 mM CaCl2
、26 mM NaHCO3和10 mm - （+） - 葡萄糖 。在记录过程中，用ACSF记录溶液（用95％O2和5％CO2冒泡）将组合物灌注
。厚壁的硼硅酸盐移液（6-9MΩ的电阻）装有内部溶液
，该溶液由135 mm k-葡萄糖酸盐，20 mm KCl ，0.1 mM EGTA
，2 mM MGCL2，2 mM MM MMGCL2 ，2 mM钠-ATP
，10 mm HEPES，10 mm HEPES和0.3 mm-GTP（pH pH摩托）（pH pH调节）（koh）; 7.28 to 7.28；使用多机灯700B放大器（夹具10.7;分子设备）和Digidata 1550b数字化器（分子设备） ，在2 kHz下进行低通滤波
，在20 kHz数字化并用夹具（V.10.7; Molecular Devices; Molecular Devices）分析数据。 　　数据表示为平均值±S.E.M.除非另有描述 。测试了原始数据的分布正态性，并通过两尾未配对的t检验 ，两尾的Mann-Whitney测试进行统计分析
，两尾配对的t检验，两尾tailed Wilcoxon匹配的签名股票测试 ，Wilcoxon签名测试，单向Anova和Kruskal-Wallis-Wallis tests and Moultess tests and Moultess Tests and Moultess tests and Bultese tests underiests and Bultese Tests
。样本量通过经验估计。GraphPad Prism V.10.0.0或MATLAB（V.R2023A; MATHWORKS）用于统计分析 。在多个独立的实验中重复了代表性实验中显示的数据。 　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得
。