所有实验程序均根据柏林动物福利要求和欧洲动物福利法进行。在循环的光阶段进行的实验 ，在12:12 h的光线周期中保持了2个月以上的雄性和雌性小鼠 。除非另有说明
，否则在22±2°C温度下以22±2°C的温度和55±10％的湿度饲养小鼠，除非另有说明
。THY1-GCAMP6S（C57BL/6J-TG（THY1-GCAMP6S）GP4.3DKIM/J）小鼠用于钙成像和行为实验（杰克逊实验室 ，库存
，第024275号库存）39,40。VGAT-CHR2（B6.CG-TG（SLC32A1-COP4*H134R/EYFP）8GFNG/J）小鼠用于行为实验（杰克逊实验室，库存 ，第014548号）41 。为了进行清醒实验
，小鼠逐渐习惯于头部和爪子固定，并倾斜以获得PIC或S1
。 　　对小鼠进行深度麻醉（氯胺酮120 mg kg -1和甲基嗪10 mg kg -1） ，并皮下向磷酸磷酸钠（2 mg kg -1）皮下注射以防止脑水肿，以及Metamizol（200 mg kg -kg -1）。用鼻子夹固定麻醉的小鼠
，将眼凝胶（Vidisic，Bausch + Lomb）施加到眼睛上 ，并用加热垫和直肠探针将体温保持在37°C 。手术后
，小鼠在皮下注射了温暖的无菌盐水溶液，并将其放在温暖的毯子上 ，直到他们从麻醉中醒来
。为避免术后疼痛
，将元唑溶于饮用水后三天。 　　为了植入图片上的窗户，将小鼠的小鼠如上所述 ，然后将左半球的顶叶和颞骨骨头暴露
，左颞肌与颞骨小心分离并部分去除 。如局部解剖学地标（Rhinal静脉，中大脑中动脉 ，zy骨）所确定的
，大约3×3 mM的颅骨切开术进行了PIC进行。为了将窗口植入原发性体感上的前透皮皮层（S1），在左半球S1上进行了3毫米直径的颅骨切开术 ，该左半球S1由解剖位置鉴定出对Bregma（1.5-2.5 mm横向和0.5-1 mm前部）
。要在同一鼠标中植入PIC和S1上的窗户，我们进行了两个3毫米的颅骨。然后用林格的溶液冲洗皮质表面
，并将两个玻璃盖板放在皮层表面 。下玻璃（直径为3毫米或3×3 mm）和上玻璃（直径4或5 mm）与光学粘合剂（NOA 61，Norland产品）粘合在一起
。使用牙齿水泥和氰基丙烯酸酯胶将金属头柱和上盖玻片连接到头骨上。PIC手术后 ，缝合了颞肌上的皮肤 。 　　为了同时获得对S1和PIC的光学访问
，我们使用了通过kull的制备（图1F，G）
。在深度紫罗兰麻醉下 ，部分去除左颞肌
，并清除颅骨的背面皮肤和骨膜。最后，裸露的头骨用氰基丙烯酸酯胶密封 。 　　对于药理学灭活 ，在S1的冷却（32-22°C）响应区域中钻了约500μm直径的颅骨
，而在用异氟烷（O2中为1.5-2％）切除的小鼠中的PIC钻了PIC
。使用对热刺激的广场钙成像响应在功能上鉴定了两个区域。开裂后，硬脑膜上覆盖着透明的硅胶凝胶（3-4680 ，道尔•康宁） 。使用拉动玻璃移液管和液压注射系统（MO-10
，Narashige），以100 nl min-1 300–500μm的速度（MO-10 ，Narashige）以100 nl min-1 300–500μm的速度注入300 nl体积的肌酚或林格溶液
。将麝香酚（ABCAM，AB120094）溶解在林格的溶液中
，浓度为5 mm。林格溶液或麝香酚注射结束后，进行了成像会议> 10分钟（图1F ，G） 。 　　对于广场成像
，行为和电生理实验，由8×8 mm的毛皮元件通过反馈控制的刺激剂（耶鲁大学医学院或定制设备 ，ESYS GMBH Berlin）进行了热刺激。随机交织不同的热刺激（2-S持续时间为20°C S-1）
，并每30或60 s递送每30或60 s
。在PAW刺激期间，我们小心翼翼地将前爪或后爪垫的无毛皮肤与Peltier元件的中心直接接触。在面部刺激期间 ，将毛发表面放在鼻子的口面区域 。对于单细胞的两光子实验
，使用基于毛孔的热刺激器（QST-LAB）进行热刺激
。将不同持续时间（2 、5
、10 s）或不同发作坡道速度（约130、10 、3.3
、2、1°C S -1）的热刺激被随机交织，并每30或60 s传递。 　　每60 s的声音刺激为8 kHz ，≈65dB的声压水平和1秒钟的持续时间
，使用一个响亮的扬声器（Visaton）位于距对侧耳朵10厘米的扬声器（Visaton） 。选择了8 kHz的频率，因为它在PIC听觉字段中很好地表示
。对于行为训练 ，选择了14-kHz音调（≈65dB，1-s持续时间）
，因为它在PIC听觉字段中弱表示。 　　通过装备有5厘米玻璃杆在尖端弯曲的压电执行器（PL127，PI）生成纤维状刺激（100 Hz） 。将对侧的前爪或后爪束缚在用孔（直径为5 mm）的刚性支撑上 ，以使玻璃杆的弯头尖端刺激爪子的棕榈的中心
。在某些实验中
，使用位于毛线上的爪子顶部的小电动机（8×3.4 mm）的小电动机（8×3.4 mm）生成颤振刺激。颤振刺激的持续时间为0.5 s，每30-60 s递送一次 。 　　成像是用Leica MZ10F立体显微镜进行的
。蓝色激发灯（470 nm）是从LED（PE-300 ，COOLLED）和带通滤波（470/40 nm）发出的。发射光进行带通滤波（525/50 nm）
，然后使用科学互补的金属 - 氧化物 - 氧化摄像头（Orca-flash4.o lt，hamamatsu）记录 。以20 Hz和35 ms的曝光时间获得图像。框架尺寸为1,024×1,024像素（2×2 binning）；对于颅窗准备 ，视场约为2.7×2.7毫米
，对于清除的头骨准备，视场约为6.7×6.7毫米
。采集试验持续了10-15 s ，并且试验间间隔时间为30-60 s。在PIC成像期间
，动物倾斜以允许光学通道 。由于物理限制，在不同的动物和会议中进行了PIC和S1广场成像 ，除非在皮质药理灭活实验期间（图1F，G）
。在这种情况下
，我们同时使用了“清晰的头骨 ”准备并成像图片和S1。始终对设置进行调整，以使爪子与所有其他实验相似的位置 。数据采集​​通过自定义代码（Python）控制
。 　　校正了视频 ，并掩盖了大脑外部录音区域。我们将荧光的相对变化计算为ΔF/f =（f（t）-f0）/f0
，其中F0是试验中活性的第15个百分位 。从ΔF/f中减去刺激前的最后500毫秒的平均活性
。在计算ΔF/f之前，通过平均感兴趣区域（ROI；直径15像素）中的荧光来量化给定区域的活性。放置ROI时 ，我们避免了可见的血管
，但在峰值刺激驱动的反应下，将ROI定位在该区域 。通过比较相对于血管的位置 ，将ROI位置保持不变
，并记录会话
。听觉刺激激活了听觉皮层中的几个领域，而在图片（Insular听觉领域）中激活了一个区域。 　　对PIC的感觉输入的体体图（图1）和S1（扩展数据图2）是小鼠和试验的宏伟平均值 。并非所有刺激都递送给所有小鼠。使用热前响应响应的ROI作为参考位置 ，通过翻译对所有试验的ΔF/F视频进行对齐
。用高斯滤光片（σ= 20像素）平滑平均值
，并仅显示峰值活性（>热活动的85％> 85％的热活动，触觉刺激的> 90％）。对于PIC ，由于在听觉岛上的同时响应和对声刺激的听觉皮层的同时响应，因此独立分析了响应 。我们仅对平均峰值响应幅度> 3％ΔF/f的数据进行了此分析
。 　　我们将广场响应的发作定义为从刺激开始到第一个衍生物峰的时间窗口中宽场信号的第二个衍生物的峰。如果刺激启动后第一衍生物的负值出现
，则时间窗口来自此类负值的最后一个 。我们仅对具有峰值响应幅度> 3％ΔF/f的数据进行了此分析
。 　　使用两光子显微镜（Thorlabs Bergamo II，12 kHz扫描仪）记录荧光信号 ，具有16×16×水下物镜（NA 0.8）的荧光信号
，可提供540×540 µm的视野。使用Thorimagels软件（v4.0.2019.8191，Thorlabs）进行范围 。在大多数实验中 ，显微镜从垂直方向旋转45°
。由于物理限制
，PIC和S1两光子成像是在不同的动物和会议中进行的。激发激光器（洞察力深看到，光谱物理学）被调整为940 nm ，功率从未超过100兆瓦 。发射的光子被带到带通滤波的525/50（绿色）到GAASP光电层管上
。多平面（512×512像素）采集由快速的压电物镜扫描仪控制
，平面间隔为45μm，深度为45μm。依次获得了七个平面 ，并在约5 Hz处重复进行整个堆栈的扫描 。图像边缘处的光束周转被遮挡。采集试验持续了26 s
，审判间隔为30-60 s
。刺激生成和硬件同步是在计算机上使用定制写入Python代码的国家仪器卡进行的。 　　使用python42中的Suite2p软件包（v0.9.3）进行了数据校正，数据鉴定 ，推定神经元的鉴定以及ΔF/F的计算 。通过目视检查神经元的痕迹和空间足迹，可以手动验证已识别的神经元
。仅出于视觉目的而将Savitzky – Golay滤波器应用于图中显示的痕迹。 　　包括活性显着增加至10°C冷却和变暖刺激的神经元以进行进一步分析 。凉爽和温暖的神经元被定义为对10°C冷却或变暖刺激的响应显着响应的神经元
。广泛调节的神经元对冷却和变暖刺激都有显着反应。为了确定响应幅度的增加
，将刺激发作之前的时间窗口中的活性与刺激过程中的时间窗口中的活性进行了比较 。如果活性的变化明显大（通过自举的估计）是刺激前通过四分之一的活性范围测得的神经元的噪声水平的两倍，则将神经元确定为反应性
。 　　热响应神经元的热偏置指数（图2D ，E）是其凉爽和温暖响应（温暖 - 酷）/（温暖+酷）之间的归一化差异
，其中“温暖
”是对32-42°C的平均峰值响应，而“冷却”是对32-22°C的平均峰值响应。平均水平（图3B ，C）根据图2所示的所有显着响应的神经元计算得出
，其中包括470个神经元，对冷却和401对变暖有显着响应 。其中 ，125对两者都做出了回应
。持续时间指数（图3D）测量了2-S热刺激的初始峰值（有限）和末端（fend）之间的荧光水平的变化
，（fend-fend）/有限。适应指数（图3G）被计算为在快速热刺激（约130°C s -1; ffast）和缓慢的热刺激（≈1°C s -1; fslow）期间（fast -ffast -fslow）/ffast期间最大荧光水平的差异 。 　　将头部固定的小鼠（VGAT-CHR2和THY1-GCAMP6S）植入PIC上的玻璃窗，并在GO/No-Go刺激检测范式上训练。如果小鼠在机会窗口内（从热刺激的开始到偏移坡道的开始） ，则用水滴（约2 µL）进行水滴（约2 µL）奖励
，至少有一个水喷口（电容传感器）的随机定时刺激（电容传感器）
。正确的拒绝没有得到奖励，也没有惩罚不正确的反应 ，尽管在刺激发作之前的5 s中过早舔，这会推迟下一次试验5 s。小鼠受到水的限制
，每天监测其体重 。对于行为训练，将200μm直径为0.22-NA光纤（ThorLABS）耦合到LED（470个PLEXON LED源） ，并使用血管模式放置在PIC或S1的热区域的盖玻片表面正交上
。在小鼠的一部分中
，颅窗被植入了S1和PIC上方，LED置于两个区域上方（扩展数据图7）。使用定制写入LabView软件（16.0F5 ，美国国家仪器
，美国）或BPOD系统（1.8.2，美国Sanworks ，美国）进行了行为培训和数据收集的控制 。 　　热感知（图5）培训涉及几个阶段：（1）从水喷嘴中自由获得水奖励；（2）自动水奖励与在32°C下的10°C
，2-S冷却和变暖刺激配对；（3）训练从刺激的高原阶段开始到2 s的窗口内在2 s的窗口内舔水奖励，以报告10°C的冷却和变暖刺激；提出了热刺激试验和捕获试验的比例为1：1 ，刺激间间隔为15-20 s；（4）一次命中率> 70％和虚假警报率 <30% had been reached, 4 randomized stimulus amplitudes were used from AT 32 °C (cooling, 22 °C, 30 °C, 31 °C and 31.5 °C; warming 42 °C, 40 °C, 38 °C and 34 °C) with a 4:2 ratio of stimulus trials to catch trials; (5) once a hit rate of >70％和虚假警报率 <30% had been achieved for at least 1 amplitude, in the next session we presented the same 4 thermal stimuli with 1 catch trial with LED on or off (on/off trials) with a ratio of 2:1 (randomized). The LED was on for the entire duration of the stimulus and delivered at 20 Hz, 50% duty cycle with a power of 12.5 mW (measured at tip of fibre). Before the start of stage (4) or (5) sessions, mice were exposed to a brief session of the stage (3) protocol to quench initial thirst. 　　The thermal discrimination task training (Extended Data Fig. 8) involved several stages: (1) free access to water rewards from the water spout; (2) automatic water rewards paired to the presentation of 14-kHz, ≈65-dB, 0.5-s acoustic stimulus; (3) training to report 14-kHz stimulus by licking for a water reward within a 1.4-s window from the start of the stimulus (go trial); acoustic stimuli (14 kHz, about 65 dB) delivered 0.6 s after the beginning of a 2-s thermal stimulus (either cooling or warming) (no-go trial) and catch trials (no stimuli) were not rewarded; go, no-go and catch trials were presented with a ratio of 1:1:1 with an inter-stimulus-interval of 15–20 s; training was continued until go trial hit rate >70％
，无需虚假警报率约50％，虚假警报接收率<30％；（4）一旦一只小鼠学会了单独区分单独的声刺激（GO）和与热刺激一起呈现的声刺激（NO-GO） ，在下一个会话中，我们以2：1的比例呈现了相同的刺激
，以2：1的比例与LED OFF（OFF）进行试验，并与LED进行了试验
。LED在整个热刺激的持续时间内启用 ，并以20 Hz的占50％占空比的效率为12.5 MW（在纤维尖端测量）。在阶段开始（4）会议开始之前
，将小鼠暴露于阶段（3）方案的简短会议上，以淬灭初始口渴 。 　　报告声刺激的行为训练（扩展数据图8）具有与上面的热训练相同的结构 ，但使用了14-kHz
，≈65-DB，2-S 2-S声学刺激
。 　　为了监测PIC光学遗传操作对舔行为的影响 ，允许受限制的小鼠自由舔些舔嘴
，并连续奖励。在光刺激开始之前2 s期间的舔速（OFF）与光刺激发作后2 s期间的舔率进行了比较（ON） 。在12.5 MW，20 Hz和50％占空比的情况下 ，将光刺激传递5 s（扩展数据图8）
。 　　将小鼠随机分配以进行训练
，以报告冷却或变暖。在第二轮训练中，他们接受了培训以报告相反的刺激 。在光遗传操作中使用的相同小鼠（图5E ，F），在光遗传学测试的前一天
，生成了相同的小鼠（图5b – d），测量没有光遗传操作的小鼠的热感知能力的数据（图5b – d）。光遗传操作的影响（图5E ，F和扩展数据图7的底部面板）通过舔试验百分比的平均变化来量化
。 　　在用头部植入的VGAT-CHR2小鼠中进行了测量光遗传学抑制对热反应的影响的电生理记录。小鼠习惯于头部和爪子固定 。在录制的那天
，将小鼠短暂地麻醉（约30分钟，1％异氟烷） ，并在PIC上进行了大约2 mm的颅骨切开术
。在颅骨切开术的腹侧部分去除硬脑膜
，并用kwik-cast硅（世界精密仪器）覆盖。将动物放在家用笼中，从麻醉中恢复至少2-3小时 ，然后在录音设置中固定头部 。 　　我们使用32通道硅探针（Neuronexus）在线性或四个旋转的“ buzsaki32 ”配置中进行了7次录音
。在某些实验中
，探针的尖端被DII（Sigma）覆盖。将探针与1-2 µM s -1的微型操纵器（Luigs＆Neumann）插入PIC正交 。使用Neuralynx系统（Cheetah）以30 kHz获取录音
。使用Kilosort（版本2）43对细胞外录音进行尖峰。收集数据以评估CHR2对神经活动的影响，因此我们进行了有限的手动分类以排除明显的噪声 ，但没有采取任何步骤来排除多单元活动 。在刺激表示过程中具有平均活性的单位超过2 s.d的阈值
。背景上方被认为是热响应的。 　　将10°C冷却和变暖的两秒长的热刺激随机交织
，并每30 s递送一次 。将LED纤维（直径200μm，0.22-Na视频纤维 ，Thorlabs）稍微倾斜以容纳有机硅探针。LED在整个热刺激的持续时间内启用，并以20 Hz的占50％占空比的效率为12.5 MW（在纤维尖端测量）
。 　　为了标记热皮质代表
，通过腹膜内注射氯胺酮和甲基嗪深度麻醉动物。响应区域的中心用玻璃移液管标记，上面涂有荧光染料（DII ，5 mg ml -1） 。然后使用冷磷酸盐缓冲盐水（PBS; 0.1 M
，pH 7.4）对心灌注小鼠，并用多甲醛（PFA； 2％；在0.1 M PBS中）固定
。去除大脑并在2％PFA中保持1-5小时。用PBS洗涤后 ，将半球分离
，将皮层除去，并在两个玻璃载玻片之间通过1-2 mm的垫片分离 。在2％PFA中 ，将载玻片在4°C下重约3–8 h
。用PBS洗涤后
，将70-80-μm切片切成纤维状态（Leica VT1000）。将切片染色以用于细胞色素氧化酶活性（2 mg细胞色素C，6 mg二氨基苯胺） 。染色过程后 ，将切片安装在带有Mowiol安装介质的载玻片上
。使用5倍物镜使用Zeiss显微镜（AX10）获取图像
，并使用fiji（ImageJ，NIH ，美国）处理。在细胞色素氧化酶染色的对比后，手动描绘了面积边界
，并且与先前报道的数据44相当 。将50μm的冠状切片染色为50μm，PFA固定小鼠大脑染色48小时 ，使用以下主要抗体：小鼠抗GAD67（目录号MAB5406;克隆1G10.2; Millipore; Millipore; Millipore; 1：800; 1：800）;鸡抗GFP（目录号AB13970; ABCAM; 1：250）;小鼠抗neun（目录编号MAB377；克隆A60; Millipore; 1：100）
。在室温下孵育了几个小时
，二级抗体CY3山羊抗小鼠（A-21422; Invitrogen; Invitrogen; 1：250）和A488山羊抗鸡（A-111039; Invitrogen; Invitrogen; Invitrogen; 1：250）在室温下孵育几个小时。使用Zeiss显微镜（AX10）使用10倍物镜，使用细胞计数器插件在斐济中手动进行细胞计数 。 　　没有使用统计方法来预先确定样本量 ，但我们的样本量与以前出版物中使用的样本相似。实验者对试验顺序并不视而不见
，但是试验顺序是在实验过程中随机分组的
。所有数据分析均使用Python进行。均值的不确定性报告为平均值的标准误差 。Boottapping用于使用5,000个重塑估算中央95％置信区间
。图3和扩展数据中的一些直方图图4没有显示离群数据点。在图1F，G中 ，我们使用了双面配对t检验 。对于图1F：酷S1
，t = -3.78，p = 0.0323;温暖的S1 ，t = -0.17
，p = 0.8767;酷图，t = 0.44 ，p = 0.6929;温暖的图片，t = -0.45
，p = 0.6839
。对于图1G：酷S1，t = 0.55 ，p = 0.6182;温暖的S1
，t = -0.68，p = 0.5454;酷图片 ，t = -3.61
，p = 0.0366;温暖的图片，t = -8.52 ，p = 0.0034。 　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得 。