MUMT - / - （C57BL/6J），CD3E - / - （C57BL/6J）38 RAG1 - / - （C57BL/6J）和WT小鼠在Riken Integrative Medical Medical Sciences的Riken Center在无特定Pathogen的条件下进行繁殖和维持 。MB1CRE/+（C57BL/6J）39和GAD1FL/+（C57BL/6J）分别由M. Reth（Freiburg大学）和Y. Yanagawa（Gunma大学医学院）提供了40只小鼠
。男性mb1cre/+;将GAD1FL/+和雌性GAD1FL/+小鼠交叉以生成B细胞特异性GAD1敲除（MB1CRE/+; GAD1FL/FL）或对照小鼠（MB1CRE/+; GAD1FL/+）的小鼠。使用窝窝或适当的年龄和性别匹配的小鼠进行分析 。所有动物实验均根据Riken机构动物护理和使用委员会批准的方案进行
。 　　扁桃体样本是从捐助者那里收集的 ，这些捐助者（或父母（如果是儿童）提供了有关该研究的知情同意
，该研究已获得京都大学IRB董事会的批准（IRB编号：G-1250）。肾脏癌样本是从捐助者那里收集的，这些捐助者已获得该研究的知情同意书 ，该研究已获得京都大学IRB委员会的批准（IRB编号：G-1012） 。 　　用左脚垫中的CFA乳化（1：1）OVA免疫小鼠（大约20μl的每只小鼠20μg）。七天后
，分离了CLN和ILN以进行进一步分析
。 　　如先前所述41进行了代谢组分析。简而言之，将冷冻的组织或细胞在甲醇中匀浆 ，然后加入氯仿和超纯水 。离心和过滤后（Ultrafree-MC，UFC3 LCC NB
，人类代谢组技术），使用真空浓缩器（SpeedVac ，Thermo）去除溶剂
。浓缩滤液用于代谢产物分析。为了定量GABA
，在样品裂解之前，将600 nm的4-氨基丁酸-2,3,3,4,4,4--D6酸（Sigma-Aldrich）溶于甲醇中 。Metaboanalystr 5.0用于统计分析（自动缩放） ，富集分析和代谢途径分析
，以计算途径影响值（https://www.metaboanalyst.ca/home.xhtml）
。 　　如前所述41进行了谷氨酰胺和GABA的组织衍生物。简而言之，进行基质辅助激光解吸/电离（MALDI）MS成像的氨基酸成像 ，5 mg Ml – 1的P-N
，N，N ，N-三甲基氨基甲硅烷基N'-羟基二氧合糖酰二酰胺二酰胺酰胺甲酸氨基甲酸酯（TAHS）在乙酰溶解中使用乙糖液在乙糖液中的稀薄均匀溶质溶剂均匀溶于0.2毫米喷嘴口径（Procon Boy FWA Platinum
，Hobby先生） 。将组织切片在55°C下孵育15分钟，然后施用2,5-二羟基苯甲酸 ，溶解在含有0.2％甲酸的乙腈中
。使用MALDI离子陷阱质谱仪（Maldi LTQ XL，Thermo Scientific）进行IMS
，配备了337 nm的60 Hz N2激光器。激光扫描螺距设置为40 µm，每个像素的激光器以20 Hz的速度辐照50次 。与连续反应监测模式结合使用 ，以正离子模式获得质谱
。M/Z 323.2> 177.1和M​​/Z 280.2> 177.1（质量窗口
，0.75 U）分别用于检测TAHS衍生化的谷氨酰胺和GABA的特定信号。分析获得的数据，并使用ImageQuest（1.0.1 ，Thermo Fisher Scientific）构建离子图像 。 　　2018年
，京都大学类风湿关节炎管理联盟（Kurama）队列的类风湿关节炎患者被招募。SDAI和DAS28-CRP评分用于评估疾病的严重程度
。检查了血浆中抗CCP抗体和GABA的水平。这项研究符合赫尔辛基宣言及其程序和方案的原则，得到了京都大学研究生院医学伦理委员会和医学院的批准（批准号R0357） 。所有参与者获得了知情同意
。 　　用以下抗体对细胞进行染色 ，然后在BD FACSARIA II流式细胞仪系统（BD Biosciences）上进行流式细胞术：抗CD8A（Biologend
，Clone 53-6.7），抗TCRβ（生物学 ，clone h57-597）
，抗抗CD4，抗C-CD4 ，抗C-CD4，抗C-CD4
，抗C-CD4。克隆104），抗晶酶B（生物学 ，克隆QA16A02）
，抗佩尔福林（生物学，克隆S16009B） ，抗F4/80（生物学
，克隆BM8），抗CKIT（Biology ogologyEnd ，clone 2B8）
，clone 2B8），抗SCA-1（抗SCA-1CAologice ，Clone
，Clone D7），Anti-CD48 。 
。 Anti-Foxp3 (Ebioscience, Clone FJK-16S), Anti-CD25 (BD Biosciences, Clone PC61), Anti-Tcrβ (BD Biosciences, Clone H57-597), Anti-il-2 (BD Biosciences, Clone Jes6-5h4), Anti-CD23 (BD Biosciences, Clone B3B4), Anti-CD43 （BD Biosciences ，Clone S7），抗CD16/32（BD Biosciences
，Clone 2.4G2），抗CD19（BD Biosciences ，Clone 1d3）
，抗CD5（BD Biosciences 53-7.3），抗CD95（BD Biosciences ，bd Biosciences
，clone JOSCCR），Cld 2） ，BD 2）
，BD 2），BD 2） ，BD 2）
，ti-cl 2 tif 2） GL3），抗IGM（Southernbiotech ，多克隆）和抗IIGA（SouthernBiotech，多克隆）。使用FITC膜联蛋白V凋亡检测试剂盒I（BD Biosciences）对凋亡细胞进行染色 。使用Cellrace-Violet细胞增殖试剂盒（Thermo Fisher Scientific）分析增殖细胞
。在存在Golgistop（BD Biosciences）（BD Biosciences）（BD Biosciences）（BD Biosciences）的情况下
，用12-yistate 13-乙酸盐（PMA; 50 ng ML-1）和离子霉素（500 ng ML-1）重新刺激细胞（500 ng ml-1）（BD Biosciences） 持续4小时。使用固定/透化溶液试剂盒（BD Biosciences）进行细胞内染色 。使用FlowJo软件（树星）分析数据
。 　　CD4+或CD8+ T细胞（CD11C – CD11B – B220–和CD4+或CD8+），幼稚的CD4+ T细胞（CD11C – CD11B – CD11B – B211B – CD8 – CD4+ CD44LOWCD62L+） ，B细胞（CD11C – CD11B – CD11B – CD4 – CD8 – CD8 – CD8 – CD8 – CD11B）和/或CD11b+）细胞是从LNS（合并的腋窝
，肱和腹股沟LNS）中分选的；从脾脏中对卵泡（FO）B细胞（CD19+CD21MIDCD23+）进行分类；Peyer的斑块B细胞（B220+IgDhi）和固有椎板IgA+等离子体细胞（B220 – IGA+）从小肠中分类；从WT小鼠的骨髓中分选了骨髓B细胞（B220HITCRβ-）（补充图1）。在与MC38细胞接种后，将肿瘤浸入肿瘤浸润的CD8+T细胞（CD45+TCRβ+CD8+） ，单核细胞（CD45+CD11B+F4/80 – LY6CHI）和巨噬细胞（CD45+CD11B+F4/80HI）进行了分类
，与MC38细胞接种后7 d分类（补充图2） 。通过FICOLL梯度离心分离新鲜的人外周血单核细胞（PBMC）。将新鲜的PBMC，冷冻PBMC（LONZA）或冷冻的人扁桃体细胞用生物素标记的抗CD20（Biolegend ，Clone 2H7）和抗CD19（Biolegend
，Clone，克隆Hib19）染色 ，并使用抗抗Biotin Microbeads（MiLobec）（Milebotec）捕获Bi Mirobec（Biolegend
，Clone Hib19），并通过磁性捕获B细胞
。T细胞用人Pan-T细胞阴性分离试剂盒（Miltenyi Biotec）富集。 　　使用Trizol试剂（Invitrogen）纯化总RNA 。DNase I处理（Invitrogen）后使用Superscript II逆转录酶（Invitrogen）进行cDNA合成 ，然后使用Thunderbird Sybr绿色QPCR混合（TOYOBO）进行实时PCR，并使用LightCycler 96 SW 1.1软件（ROCHE）分析结果
。将mRNA的相对表达水平标准化为ACTB（小鼠）或18S rRNA（人）的表达
，并相对于对照细胞表示。使用了以下底漆 。小鼠引物：GAD1（参考42）：F，5'-aggcagtcctcccaagaAcct-3';R ，5'-CCGTTCTTAGCTGGAAGCAG-3';GAD2（参考43）：F
，5'-TCAACTAAGTCCCCCCCTAAG-3';R，5'-CCCTGTAGAGTCAATACCTGC-3';IL10（参考44）：F ，5'-CaaggagcatttgaAttCCC-3';R
，5'-GGCCTTGTAGACCTTGGTC-3';ACTB：F，5'-CACCCTGTGCTGCTCACCGA-3';R ，5'-agtgtgggtgtgaCcccgtctcc-3'
。人类底漆：18S rRNA45：F
，5'-GGCCCTGTAATTGGAATGAATGAGTC-3';R，5'-CCAAGATCCAACTACACTACGAGCTT-3';GAD1（参考文献46）：F ，5'-cgagtccctggagcagatcctggtt-3';R
，5'-GTCAGCCATTCCAGCTCAGCTAGGCCAATAATA-3';GAD2（参考46）：F，5'-Caaccaaatgcatgcctcctcctctctttca-3';R ，5'-TGCCAACTCCAACATTTATATATATATATGCGCTTCA-3'。 　　Mouse T or B cells were purified from LNs with B cell (positive selection) or T cell (negative selection) magnetic beads (Miltenyi Biotec) and cultured for 24 or 72 h in RPMI-1640 (Wako) supplemented with 10% (vol/vol) dialysed FBS (Thermo Fisher Scientific), 1× MEM NEAA, 10 mM HEPES, 50 µM of 2-mercaptoethanol,1 mM丙酮酸钠，100 U ML – 1青霉素和100 U ML – 1链霉素 。在存在抗CD28（2 µg ML – 1; 37.51; 37.51
，BD Biosciences）和IL-2（20 ng ml-2; r＆d＆r＆d Systemp）的情况下，用抗CD3（2.5 µg ML – 1; 145-2C11 ，BD Biosciences）刺激T细胞
。单独使用抗IGM（8 µg ML – 1； Jackson Immuno研究）刺激B细胞
，抗IGM（8 µg ML – 1）加抗CD40（10 µg ML – ML – 1; BD Biosciences）或LPS（100 ng ML – 1; Sigma-Aldrich）。对于[13C5,15N2]谷氨酰胺跟踪，补充了无谷氨酰胺的培养基 ，并补充了2 mm的13c5,15n2标记的-Glutamine（Taiyo Nippon Sanso） 。 　　对于人类B细胞培养
，用人IL-21（50 ng ml – 1; biolegend），人CD40L（100 ng ML – 1; Biolegend）和人IL-2（10 ng ml – 1; r＆＆＆＆＆＆d Systems）或F（Ab''Ab'ant antig ant antig antig antig ，（1 µg ML – 1; Invitrogen）
，CpG寡核苷酸（ODN 2006; 4 µg ML – 1; Invivogen），人IFNα（1,000 U ML – 1; R＆D Systems）和人IL-2（人类IL-2）和人IL-2（10 ng ml – 1; r＆＆＆＆＆＆＆＆d Systems）先前所述的47 d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d ，含量为13c5,15,152
。 　　从小鼠股骨中分离出骨髓细胞。用裂解缓冲液（0.15 M NH4CL
，1 mM KHCO3，0.1 mM Na2Edta）去除红细胞 。使用EasySep小鼠单核细胞分离试剂盒（Stemcell Technologies）从骨髓细胞中进一步纯化单核细胞。Total bone marrow cells (2 × 106 cells per ml) or purified monocytes (0.5 × 106 cells per ml) were suspended in complete RPMI-1640 (supplemented with 10% (vol/vol) dialysed FBS (Thermo Fisher Scientific), 1× MEM NEAA, 10 mM HEPES, 50 µM of 2-mercaptoethanol, 1 mM sodium pyruvate,100 U ML – 1青霉素 ，100 U ML – 1链霉素），含有20 ng ML – 1 M-CSF（R＆D系统）
，并在24孔或48孔板上播种
。在第3天，将非粘附细胞丢弃 ，并在补充20 ng ML – 1 M-CSF的新鲜培养基中再培养三天。确认为CD11b+ F4/80+的粘附细胞被认为是成熟的BMDM（M-0） 。 　　为了极化
，用10 ng ML – 1 IL-10（R＆D系统）刺激M-0细胞6小时（M-IL-10）
。对于GABA调节，从培养物的开头添加了1 mM GABA（Sigma-Aldrich） ，在第3天（称为M-0和GABA M-0）以及在极化期（称为M-IL-10和GABA M-IL-10）进行刷新。 　　For culture of human monocyte-derived macrophages, human peripheral blood CD14+ monocytes (Lonza) were cultured in RPMI-1640 (supplemented with 20% (vol/vol) dialysed FBS (Thermo Fisher Scientific), 1× MEM NEAA, 10 mM HEPES, 50 µM of 2-mercaptoethanol, 1 mM sodium pyruvate,100 U ML – 1青霉素
，100 U ML – 1链霉素），有100 ng ML – ML – 1人M-CSF（R＆D系统） ，并用GABA（1 mM）剩余未经处理或处理7 d 。通过流式细胞仪分析粘附细胞
。 　　对于巨噬细胞-T细胞共培养
，将在上述条件下区分的2×104 BMDM与5×104排序的CD8+ T细胞一起播种，并用抗CD3（1 µg ML – 1; 145-2C11 ，BD Biosciences）和抗CD28（0.5 µg cd28（0.5 µg Ml – 1; 3.37.37.5.51; 37.51; 37.51; 37.51; 37.51; 37.5.51; 37; BD刺激3 d抗IL-10阻断抗体（4或10μgml– 1; JES5-2A5
，Ebioscience）的抗体。 　　对于用B细胞进行巨噬细胞调节，然后是T细胞共培养 ，用抗IGM（8 µg ML – 1）加抗CD40（10 µg ML – ML – 1; BD Biosciences）刺激纯化的LN B细胞3 d 。将骨髓细胞与M-CSF分化1 d，然后在M-CSF存在下再用有或没有活化的B细胞（1×105细胞）的粘附细胞培养五天
，并用IL-10（10 ng ML – 1）进一步极化6小时
。如上所述，进行了巨噬细胞-T细胞共培养。共培养3 d后 ，通过流式细胞仪分析CD8+ T细胞
，并使用细胞仪阵列（CBA）小鼠TH1/TH2/TH2/TH17细胞因子KIT（BD Biosciences）对上清液中IFNγ和TNF的浓度进行定量 。 　　对单核细胞（CD45.2+CD11b+Ly6Chif4/80–）浸润到MC38肿瘤组织（第7天）进行分类并在体外进行分化，并在体外进行6 d（1 mm）的体外分化 ，持续6 d
，然后播种到35mm玻璃玻璃Bottom Dish（Iwaki）上，并通过不经inmmunococytoChemtoChemtoChemChemChemChemChemChemChemChemChemChemChemChemChemChemChemChemChemChemChemChemChemChemtorChemistrys分析
。用重组小鼠TNF（100 ng ML – 1）或重组小鼠IL-1β（100 ng ML – 1）刺激细胞30分钟。然后将它们用4％多聚甲醛（Nacalai）固定15分钟 ，并进行免疫细胞化学处理
，以检查总NF-κBp65的细胞内定位 。通过与0.2％Triton X-100（Sigma-Aldrich）在25°C下孵育15分钟，将固定细胞透化15分钟。然后将细胞与兔抗人总P65抗体（1：200;克隆D14E12 ，细胞信号技术）一起孵育90分钟
。用含有0.2％多氧乙烯（20）山梨糖酸酯单层的PBS洗涤后
，将细胞与Alexa Fluor 594偶联的F（AB'）2片段孵育，2山羊抗兔IgG（H+L）（1：1,000; Thermo Fisher Scientific）在25°C的黑暗中60分钟。将样品用含有0.2％多氧乙烯（20）山梨糖酸盐单龙酸盐的PBS洗涤3次 ，并与TO-PRO-3-碘化物（1：1,000; Thermo Fisher Scientific）一起孵育15分钟 。然后将它们安装在延长的金抗剂试剂中，并使用共聚焦激光扫描显微镜（LSM-510
，Carl Zeiss）可视化
。使用ZEN软件（Carl Zeiss）进行共定位分析。 　　对于免疫荧光，立即分离组织 ，将4％多聚甲醛在4°C的PBS中固定2小时
，并在4°C中浸泡在PBS中的30％蔗糖中，在4°C下过夜 。然后将组织嵌入组织 - 技术OCT块（Sakura）中 ，并冷冻在液氮中
。通过低温恒温器（Leica
，CM3050S）以10μm的厚度将冷冻样品截面。使用了以下抗体：抗小鼠CD3ε（Biolegend，克隆145-2C11） ，抗小鼠B220（EBISoscience
，clone RA3-6B2）和抗小鼠CD11C（SouthernBiotech，polyclonal） 。将组织切片用DAPI（Sigma-Aldrich）对染色 ，并用荧光素-G抗FANTIFADE试剂（SouthernBiotech）安装
。 　　对于人体组织染色
，将组织新鲜分离，嵌入在组织软件中的OCT块（Sakura）或SCEM（分段）中 ，并冷冻在液氮中。通过低温恒温器（Leica，CM3050S）以10μm的厚度将冷冻样品截面 。以下抗体用于免疫组织化学染色：抗人CD68（Ebioscience
，克隆815CU17），抗人类CD19（ABCAM ，克隆EPR5906）和抗人类IGA（SouthernBiotech
，Polyclonal）
。使用BZ-X700荧光显微镜（钥匙）获得荧光图像。 　　BMDMs differentiated as described above were seeded on Seahorse XF poly(-lysine)-coated microplates (Agilent) at 1 × 105 cells per well in Seahorse XFp RPMI medium containing 1 mM XFp sodium pyruvate, 2 mM XFp -glutamine and 10 mM XFp glucose (Agilent) and incubated for 45 min at 37 °C in使用Seahorse XFP分析仪（Agilent）开始测定之前，非CO2孵化器 。依次添加寡霉素（1.5μM） ，FCCP（2μM）和烤烤霉素A（0.5μM）
，并实时测量氧气消耗率（OCR）和细胞外酸化速率（ECAR）。将最大呼吸能力计算为（注射FCCP后的最大OCR） - （烤面包酮/抗霉素A注射后OCR）
。 　　Cells were incubated with 2 µM Fluo-3-AM in RPMI supplemented with 10% FBS for 30 min at 37 °C in the dark, washed in PBS and seeded on 35-mm glass-base dishes with Ca2+ imaging buffer (120 mM NaCl, 5 mM KCl, 0.96 mM NaH2PO4, 1 mM MgCl2, 11.1 mM glu​​cose, 1 mMCaCl2, 1 mg ml–1 BSA and 10 mM HEPES (pH 7.4)) or Ca2+-free imaging buffer (120 mM NaCl, 5 mM KCl, 0.96 mM NaH2PO4, 1 mM MgCl2, 11.1 mM glu​​cose, 0.5 mM EGTA, 1 mg ml–1 BSA and 10 mM HEPES (pH 7.4)).共聚焦激光扫描显微镜（LSM510）每1 s捕获图像。基线图采集后，用抗CD3/CD28 Dynabeads（Thermo Fisher Scientific）或5μMThapsigargin（TG）刺激细胞 。为了检查拮抗剂对GABA能受体的作用 ，将细胞用100μMPICROTOXIN预处理5分钟
。随着时间的流逝
，细胞内Ca2+浓度（n = 60个细胞）的相对变化表示为相对于基线荧光的变化。 　　MC38（小鼠结肠腺癌）细胞系最初由J. P. Allison（纪念Sloan Kettering Cancer Center）提供 。Mice were implanted subcutaneously with placebo or GABA pellets designed to release GABA over 21 d (31.5 mg per pellet; Innovative Research) or injected intraperitoneally (i.p.) with DMSO or picrotoxin (40 μg per mouse; Abcam) 1 d before intradermal inoculation with 5 × 105 tumour cells in the right flank.每隔一天进行200μl盐水中的DMSO或野毒素注射
。对于巨噬细胞耗尽，将对照脂质体或脂质体氯膦酸盐（Hygieia Bioscience）注入小鼠腹腔注射。1 d之前（每只小鼠50 µL）和第6天（每只小鼠25 µL）接种 。为了进行共同注射实验 ，将MC38细胞（每只小鼠5×105个细胞）与M-IL-10或GABA M-IL-10细胞（每只小鼠2.5×105细胞）一起注入小鼠
，如上所述
。在第7天或第15天收集肿瘤组织，并用胶原酶（1.5 mg ML – 1; WAKO）消化 ，以进行流式细胞仪或测序分析。根据以下公式，用卡尺测量肿瘤体积：肿瘤体积=π×（长度×宽度×高度）/6 。 　　使用FACSARIA III细胞分类器（BD Biosciences）在肿瘤注射后的第7天纯化了100个肿瘤内CD45.2+TCRβ+CD8+T细胞和CD45.2+CD11b+F4/80HI巨噬细胞
。将细胞收集在单细胞保护单细胞稳定溶液（Avidin）中
，并在液氮中冷冻用于数字RNA测序50。使用Miseq平台上的索引合并方法（150个周期； Illumina套件）对每个库（每只鼠标）进行测序 。使用Star v.2.5.4B50，将测序数据映射到小鼠基因组（来自UCSC基因组浏览器的MM10组装；来自UCSC基因组浏览器的注释Refflat）。使用DESEQ2（1.30.1）计算归一数量的分子
。表达显着不同的基因（DEG；双面Wald检验 ，P< 0.05; average value of normalized number of molecules for all samples >1;log2（折叠更改）> 0或 <0) were analysed by Ingenuity Pathway Analysis (IPA; Qiagen). DAVID was used for annotation analysis of DEGs (https://david.ncifcrf.gov/home.jsp). Principal-component analysis (average value of normalized number of molecules of all samples >1）通过clustvis（https://biit.cs.ut.ee/clustvis/）进行。测序数据集已在登录代码GSE169543和GSE183246下沉积在基因表达综合中 。 　　使用Trizol（Invitrogen）纯化总细胞RNA
，并使用Agilent RNA 6000 Pico试剂（Agilent Technologies）确认质量
。Clariom S阵列（Thermo Fisher Scientific）用于分析转录组轮廓（Takara），并使用转录组分析控制台软件（Thermo Fisher Scientific）（补充表1和2）分析数据。使用IPA（Qiagen）进行途径分析 。 　　为了制备MS的胰蛋白酶样品样品 ，Ref的相转换表面活性剂方法
。51,52用于为MS准备BMDM样品
，并进行了较小的修改。简而言之，将100,000个细胞的细胞颗粒裂解在20 µL裂解缓冲液中（100 mM Tris-Cl pH 9.0 ，12 mM脱氧乙酸钠
，12 mM N-二烷酰基酸钠，具有完整的EDTA无EDTA无蛋白酶抑制剂（ROCHE）） 。使用Pierce BCA蛋白测定试剂盒（Thermo Fisher Scientific）确定每个样品的蛋白质浓度
。蛋白质量因样品而异（3.2–10.0 µg） ，并且为MS准备了每个样品的全部量。在50°C下用10 mM DL-二硫苏糖醇还原样品
，持续30分钟，在室温下在黑暗中用40 mm iodoacetamide烷基烷基烷基烷基烷基 ，然后在室温下30分钟，然后在室温下加入55 mm半胱氨酸
，持续10分钟，以淬灭反应 。将样品用50 mM碳酸氢铵稀释1：2.76
。在200 ng下添加赖氨酸内肽酶（Fujifilm Wako Pure Chemical）和改性胰蛋白酶（Promega） ，并在37°C下消化蛋白质14小时。胰蛋白酶消化反应用1.83量的乙酸乙酯处理
，然后用三氟乙酸（TFA）酸性为0.5％（VOL/vol）TFA 。在12,000克离心5分钟后，丢弃了含有洗涤剂的上部有机相 ，并使用真空离心机干燥含有消化的胰蛋白酶肽的较低水相。将样品用Ziptip移液器尖端脱盐
，并用0.6μl的C18树脂（Milliporesigma）脱盐并干燥
。之后，将样品溶于10 µL的0.1％（体积/体积）甲酸和3％（体积/体积）乙腈中。使用Pierce定量色素测定试剂盒（Thermo Fisher Scientific）确定肽浓度 。从每个样品中 ，用MS测量了600 ng的胰蛋白酶肽
。 　　为了生成光谱库
，根据制造商的说明（Thermo Fisher Scientific），根据制造商的说明（Thormo Fisher Scientific） ，将每个样品中的胰蛋白酶肽的等分试样合并为10μg胰蛋白酶肽样品
，该样品使用Pierce High PH反向反相肽分馏（HPRP）试剂盒进行分级。对于MS，将每个馏分溶于6.5 µl的0.1％（体积/体积）甲酸 ，并测量3％（体积/体积）乙腈在水中和5.0 µL中 。 　　液相色谱和串联MS（LC – MS/MS）测量是使用Q-耗一加Orbitrap质谱仪以及纳米喷雾flex ION源（Thermo Fisher Scientific）进行的
。对于LC，使用了易于使用的NLC 1200系统（Thermo Fisher Scientific）。溶剂A由水和溶剂B中的MS级0.1％（体积/体积）组成
，由80％（体积/体积）乙腈组成0.1％（体积/体积）甲酸 。用2小时梯度和300 nl min – 1的流量测量样品：该梯度从2％溶剂B从0–108分钟从0–108分钟增加到34％的溶剂B，然后从34％的溶剂B到95％的溶剂B到95％的溶剂B ，从108-110分钟
，最终从110-120分钟升至95％的溶剂b，从110-120分钟到洗涤
。使用具有3 µm C18颗粒的分析柱分离肽 ，内径为75 µm
，长度为12.5 cm（Nikkyo Technos），其前面是一个受赞誉的Pepmap 100陷阱柱 ，带有3 µm C18颗粒
，内部直径为75 µm，内部直径为75 µm和2 cm fishercic fishercity（填充法）。离子转移毛细管温度为250°C ，在样品测量过程中施加2.0 kV的喷雾电压 。 　　为了生成光谱库
，用数据依赖性采集（DDA）测量了相应的样品
。以70,000分辨率从380至1,500 m/z获取完整的MS光谱。自动增益控制（AGC）目标为3×106，最大注射时间（IT）为100 ms 。将MS2扫描记录为以17,500分辨率的前20个前体记录 ，并将动态排除设置为20 s，默认电荷状态设置为2。AGC目标为1×105
，最大值为60毫米
。HCD碎片化的归一化碰撞能量为27％。强度阈值为1.3×104，包括电荷状态2-5 。 　　为了量化样品跨样品的蛋白质 ，它们是通过数据独立的获取（DIA）测量的
。使用一个完整的MS扫描和32个重叠的隔离窗口
，覆盖400–1,200 m/z的前体质量范围。对于完整的MS扫描，分辨率为70,000 ，为AGC目标为5×106
，最大值设置为120毫秒 。以35,000的分辨率，3×106的AGC目标和自动最大值以下分辨率获取DIA段
。第一个质量固定为150 m/z。HCD碎片化的归一化碰撞能量为27％ 。 　　为了生成光谱库 ，使用Proteome Discoverer 2.4版本（Thermo Fisher Scientific）以及从八个HPRP-Fracticated-Fracticated-Fracticated Protiptic肽分数获得的DDA获得了八个原始数据文件
，分析了从HPRP乘型肽馏分的DDA获得的八个原始数据文件
。使用Uniprot评审的Mus Musculus（分类单元10090）数据库来处理数据文件以生成单个结果文件。消化酶特异性设置为胰蛋白酶（完整） 。前体的质量公差设置为10 p.p.，而对于片段 ，公差为0.02 da
。半胱氨酸的氨基甲基化是作为静态修饰的。将蛋氨酸氧化
，N末端蛋白乙酰化，蛋氨酸损失和N端蛋白乙酰化的甲基化丧失量设置为动态修饰 。为了计算错误的发现率（FDR） ，使用了串联的诱饵数据库。在肽水平和蛋白质水平上，使用0.01的FDR来过滤搜索结果
。为了生成特定的光谱库
，然后将来自蛋白质组发现器的结果文件导入到Spectronaut软件（Biogognosys）中。 　　为了量化蛋白质，使用Spectronaut软件（Biogognosys） ，使用DIA测量的原始数据文件用生成的光谱库来提取蛋白质量 。用Mprophet近近53估计了FDR
，并将肽前体和蛋白质级别的FDR设置为0.01
。用于定量的数据滤波参数为Q值百分位分数为0.5，全局插入和交叉归一化 ，并在中位数上进行全局归一化。进行基于IPA（QIAGEN）的途径分析以分析明显差异表达的蛋白质（两尾未配对的t检验
，p <0.05） 。MS蛋白质组学数据已通过数据集标识符PXD028403通过Pride55合作库来存放到ProteOmeXchange联盟中
。 　　使用PRISM（GraphPad）或DESEQ2进行统计分析。使用Pearson和Spearman的相关测试，WALD测试 ，两尾未配对的学生的t检验或反复测量ANOVA进行了分析 。P值小于0.05被认为具有统计学意义
。 　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然研究报告摘要中获得。