没有使用统计方法来预先确定样本量 。在实验和结果评估中 ，研究人员并未对分配视而不见，除非指定以下规定。实验不是随机的
。 　　患者的肺样本来自对6例在意大利特里斯特大学医院死于Covid-19的患者的验尸分析
，在重症监护支持后。这些来自更广泛的共有41例连续患者，他们全都死于19岁 。其中25个是男性 ，而16名是女性
。男性的平均年龄为77
，女性为84岁。在住院期间，所有患者在鼻咽拭子上均为SARS-COV-2呈阳性 ，并提供了与Covid-19-199疾病有关的症状和成像数据 。以前已经报道了这些患者的广泛表征15
。在这些患者中
，有20例患者（50％）的肺部存在畸形和合成性肺细胞，包括所有需要重症监护的所有6例患者 ，偶尔还有16例患者（39％）。这些后验尸样本进行调查的使用已由意大利弗里利·弗里利（Friuli）吉利亚（Re.0019072/p/per/gen/arcs）的主管联合道德委员会批准 。 　　Vero（WHO）克隆118个细胞（ECACC 88020401）在DMEM（Life Technologies）中培养
，其中1 G L-1葡萄糖（生命技术）补充了10％热灭活的胎儿牛血清（FBS）（FBS）（FBS）（Life Technologies）（Life Technologies）（生命技术）以及最终浓度不含100 iu ml-1 penibib and-1 pen-111，而100 pen-11111转染
。将细胞在37°C下孵育5％CO2。 　　Vero E6细胞由A. Davidson和D. Matthews提供 。细胞在含有10％FBS ，1％非必需氨基酸（Gibco）和1％青霉素 - 链霉素（Thermo Fisher Scientific）的DMEM（Gibco）中生长
。将细胞在37°C下孵育5％CO2。 　　U-2 OS (U2OS; ATCC HTB-96), HEK293T (ATCC CRL-3216) and Calu-3 cells (ATCC HTB-55) were cultured in DMEM with 1 g l−1 glucose (Life Technologies) supplemented with 10% FBS (Life Technologies) plus a final concentration of 100 IU ml−1 penicillin and 100 μg ml−1 streptomycin或在需要转染所需的情况下没有抗生素 。 　　稳定的U2OS细胞克隆通过用慢病毒颗粒转导麦克隆获得麦克隆（RLV.EF1.MCHERRY-9
，TAKARARY-9，TAKARA 0037VCT）的本组成表达 ，该表达在4μgml-1的ML-1多甲氧烯（Sigma-Aldrich Tr-1003-g）下以10 MOI的形式获得。4小时后更换培养基
。从转导后48小时，对转导细胞的选择添加了1μgml-1嘌呤霉素（Invivogen ant-Pr-1）。通过荧光显微镜验证了转基因的表达 。 　　原发性支气管人气道上皮细胞购自上皮
，并保持在粘膜细胞培养基（上皮）中
。 　　所有细胞系对支原体污染均为阴性。细胞系未经认证 。 　　使用了针对以下蛋白的抗体：TMEM16A（ABCAM，AB64085） ，TMEM16F（ABCAM AB234422和Sigma-Aldrich HPA038958-100UL）
，ACE2，ACE2 ，ACE2
，ACE2（ABCAM AB87436和AB87436和AB15348），V5-8（Thermo Scientific v5）（Thermo Scientifific v5-n966025-(Thermo Fisher Scientific 377500A488), mouse-HRP (Abcam ab6789), rabbit-HRP (Abcam ab205718), β-actin-HRP (Sigma-Aldrich A5316), napsin (Roche 760-4867), surfactant B (Thermo Fisher Scientific MS-704-P0), mouse-biotin (Vector实验室BA-9200） ，SARS-COV-2尖峰蛋白（Genetex GTX632604）
，SARS-COV-2核蛋白酶抗体（Sino Biological 40143-R001）
。 　　将“供体” U2OS细胞种在10厘米的培养皿中（每道菜200万细胞），以达到70–80％的汇合。使用10μg的PEC117-Spike-V5（表达V5标记的尖峰蛋白 ，优化的密码子优化）或使用35μLFugeneHD Traftection试剂（Promega E2311）在500μL的Opti-Mem培养基（Life Lifeolies）中进行转染 。过夜转染后
，将细胞在5％CO2的37°C下在1 mL培养基中加载10 nm Qtracker 525细胞标记试剂盒（Invitrogen Q25041MP），在37°C下1 h
。在用PBS大量洗涤后 ，将细胞与Versene脱离（Thermo Fisher Scientific 15040066）。“受体 ” Vero细胞如下制备 。测定前一天，将细胞播种在10厘米的培养皿（每盘120万细胞）中
。然后将细胞在5％CO2的37°C下在1 ml培养基中加入10 nm Qtracker 800细胞标记试剂盒（Invitrogen Q25071MP）
，在37°C下1 h。在用PBS进行大量洗涤后，将细胞用0.05％胰蛋白酶-EDTA（Sigma-Aldrich T4049）脱离 。将Vero和U2OS细胞以5：4的最终比率混合 ，并以DMEM中的20×103细胞Ml-1稀释
，并补充1 G L-1葡萄糖（Life Technologies），并补充了10％的热灭活FBS（Life Technologies）。将稀释的细胞（每孔50μL ，每孔1,000个细胞）用多乘分配器播种在12 384孔微板岩（Cellcarrierultra 384
，Perkin Elmer）中
。播种后三个小时，频谱收集的药物 ，MS发现系统（2,545种不同的药物）和Prestwick Chemical Library
，Prestwick Chemical（1,280种药物）以10μM的最终浓度（1％DMSO最终）在细胞的顶部分发。二十四小时后，将板以每孔PBS50μL洗涤 ，并在40μL4％多聚甲醛（PFA）中固定在室温（RT）下10分钟 。固定后
，将细胞在每孔PBS50μL中洗涤两次，并在0.1％Triton X-100（Sigma-Aldrich 1086431000）中透化 在室温下10分钟
。根据制造商的说明 ，将细胞洗涤两次，每孔的PBS50μL
，并用HCS Cellmask Blue（Thermo Fisher Scientific H32720）和Hoechst（H3570）染色。 　　使用Operetta CLS高含量筛选显微镜（Perkin Elmer）进行图像采集，具有20×（Na 0.80）物镜 。在三个不同的波长下 ，每孔总共成像25个场：（1）激发365–385 nm
，发射430–500 nm（核和细胞质“蓝色”）；（2）激发460–490 nm，发射500–550 nm（供体量子点“绿色
”）；（3）激发615–645 nm ，发射655–750 nm（受体量子点“红色”）
。随后使用Harmony软件包（V.4.9; Perkinelmer）分析了图像。首先通过平地校正图像
，并使用“查找核 ”分析模块（Harmony）对核进行了分割 。根据信噪比的比率调整图像分割的阈值
。设置了分裂系数以避免分裂重叠的核（融合细胞）。使用“查找细胞质
”分析模块（Harmony）定义了由HCS细胞面膜蓝色染色的细胞质区域，并使用“查找点”分析模块（Harmony）计数绿色或红点的数量 。所有具有核面积的细胞大于单个核的平均面积的四倍 ，并且至少两个红色和两个绿色点同时呈阳性
。数据通过计算每个孔总细胞总数的平均融合细胞数量来表示为融合细胞的百分比。 　　将Vero细胞在10厘米的培养皿（每盘120万细胞）中播种
，以达到70–80％的融合 。使用30μL和Fugene HD转染试剂（Promega E2311）在500μL的Opti-Mem培养基（Life Technologies）中使用10μgPec117-Spike-V5进行转染。转染后十二小时，将细胞分离 ，用PBS洗涤
，并用1 g L-1葡萄糖（生命技术）在DMEM中稀释至12×103细胞ML-2的最终浓度，并补充了10％热灭活的FBS（生命技术）
。使用多螺旋分配器将五十微升稀释的细胞悬浮液（每孔600个细胞）播种在12 384孔微板（Cellcarrierultra 384 ，Perkin Elmer）中。播种后三个小时，谱系收集的药物
，MS发现系统（2,545种不同的药物）和Prestwick Chemical文库，Prestwick Chemical（1,280种药物） ，以10μM的最终浓度（1％DMSO最终）在细胞的顶部分发 。药物治疗后24小时
，将板用每孔50μl洗涤，并在室温下固定40μl4％PFA 10分钟
。固定后 ，根据制造商的说明
，使用抗V5，Hoechst（H3570）和HCS Cellmask Red（Thermo Fisher Scientific H32712）处理细胞进行免疫荧光。 　　使用Operetta CLS高含量筛选显微镜（Perkin Elmer）进行图像采集 ，具有20×（Na 0.80）物镜 。在三个不同的波长下
，每孔总共25个域：（1）激发365–385 nm，发射430–500 nm（核“蓝色 ”）；（2）激发460–490 nm ，发射500–550 nm（尖峰蛋白“绿色
”）；（3）激发615–645 nm发射655–750 nm（HCS细胞面膜“红色”）
。随后使用Harmony软件（Perkinelmer）分析了图像。首先通过平地校正图像
，并使用“查找核 ”分析模块（Harmony）对核进行了分割 。根据信噪比的比率调整图像分割的阈值
。设置了分裂系数以避免分裂重叠的核（融合细胞）。使用“查找细胞质
”分析模块（Harmony）定义了由HCS细胞面膜红色染色的细胞质区域，并使用“计算强度特性”模块（Harmony）计算了绿色荧光的强度 。所有具有核面积的细胞大于单个核的平均面积的五倍 ，并且在细胞质区域的绿色信号同时呈阳性
。数据通过计算每个孔总细胞总数的平均融合细胞数量来表示为融合细胞的百分比。 　　将4％PFA固定在室温下10分钟后，将细胞以每孔50μl（384个固定板）或100μl的PBS（96孔板）的PBS洗涤两次
，然后在相同体积的0.1％Triton X-100（Sigma-Aldrich 1086431000）中以相同的体积透化10分钟 。然后将细胞在PBS中洗涤两次，并在室温下在1％BSA中阻塞1小时。阻塞后 ，除去上清液
，并根据染色类型对细胞进行染色，如下所示
。 　　For V5 epitope staining, after blocking the supernatant was removed and 20 μl per well (384 well-plate) or 40 μl per well (96-well plate) of diluted (1:1,000 in 1% BSA) V5 Tag Alexa Fluor 488 Monoclonal Antibody (Thermo Fisher Scientific 37-7500-A488) was added to each well and incubated at room temperature for 2 h.然后在PBS中将细胞洗涤两次。根据制造商的指示 ，Hoechst 33342进行了核染色 。 　　为了染色SARS-COV-2尖峰和核胶囊和细胞TMEM16F的染色
，去除上清液后，去除上清液 ，每孔（96孔板）稀释的原代抗体（1％BSA SARS-SARS-COV-2峰值-2峰值抗体中的1：500）
，Genetex gtx6333332263263263263263263226322633322632633226322632263226322632263226326322632263263226322633226333344; tmmaich；HPA038958，1：3,000在BSA和SARS-COV-2 Nucleocapsid抗体中 ，将Sino生物学40143-R001）添加到每个井中
，并在4°C下孵育过夜
。然后将细胞在PBS中洗涤两次，去除上清液 ，并将相同体积的稀释液（1：500在1％BSA中）添加到每个孔中并孵育2小时。然后在PBS中将细胞洗涤两次 。根据制造商的指示，Hoechst 33342进行了核染色
。 　　根据制造商的说明
，通过HCS细胞口罩深红色染色（Invitrogen H32721）或HCS细胞口罩蓝色染色（H32720）进行细胞质染色。 　　来自COVID-19的样品在10％福尔马林中固定至少50小时，然后嵌入石蜡中 。在二甲苯中将四微米切片脱蜡 ，并加水并加工成赤道蛋白 - 欧洲蛋白酶或免疫组织化学染色
。在煮沸的柠檬酸钠溶液（0.01 m
，pH 6.0）中进行20分钟。使切片在PBS中的1％Triton X-100中冷却并透化10分钟，然后在2％BSA（Roche）中阻塞 ，并在4°C下用在阻断溶液中稀释的主要抗体在4°C下过夜染色 。在用3％H2O2抑制内源性过氧化物酶后
，将切片与适当的生物素偶联物二抗在室温下孵育1小时
。在用Avidin-Biotin-complex-HRP（Vectastain）进行信号扩增后，将DAB溶液（载体）施加2-3分钟。血久毒素（Bioptica）被进一步用于染色核 ，并将蓝光试剂用于Ventana自动染色 。使用Leica ICC50W光显微镜获取图像。 　　使用U6 SNRNA47和SARS-COV-2 RNA的锁定核酸（LNA）探针进行原位杂交
，旨在针对病毒基因组的ORF1AB和Spike区域的感觉链
。炒序列用作对照。根据制造商的协议，使用专用的原位杂交试剂盒（FFPE）组织（Qiagen）进行实验 。简而言之 ，将FFPE组织载玻片在二甲苯中脱蜡
，在37°C下用蛋白酶K（15μgml-1）处理5分钟5分钟，并在54°C的卫生剂中与SARS-COV-2（40 nm）或U6探针（40 nm）或U6探针（40 nm）或U6探针（2 nm）一起孵育
。用SSC缓冲液洗涤后 ，使用抗硫酸碱磷酸酶（AP）抗体（1：500）（Roche诊断）检测到SARS-COV-2 RNA的存在，该抗体（Roche诊断）补充了绵羊血清（Jackson Immunoresearch）和牛血清白蛋白（BSA）。通过添加NBT-BCIP底物（Roche Diagnostics）检测到杂交 。核用核快红对染色
。 　　产生了表达质粒PEC117-Spike-V5如下：SARS-COV-2野生型蛋白（NCBI登录号NC_045512.2
，位置21563-25384位置）被密码子进行了分析和合成的两个片段，并在两个片段中与gblock dna的两个片段合成（IDTNA）。在C末端标记 ，然后在巨细胞病毒（CMV）IE启动子的控制下克隆到PZAC 2.1主链中 。通过Sanger测序验证了构建体DNA序列
。The following expression vectors were used: hTMEM16A (GenScript OHu26085D), hTMEM16F (GenScript OHu26351D), hACE2 (Addgene 1786), pGCaMP6s (Addgene 40753), pMERS-CoV-S and pSARS-CoV-1-S (W. Barclay laboratory), pCMV-eGFP and pmCherry-NLS (the last从L. Zentilin获得了两个。 　　针对ACE2（M-005755-00-0005）的siRNAS（Dharmacon Sigenome Smartpools
，每个基因靶标四个SIRNA），TMEM16A（也称为ANO1）（M-027200-00-0005） ，TMEM16A（也称为ANO1）（M-026787-00-0005）
，TMEM16F（ANO6）（M-003867-01-0005）和XKR8（M-015745-01-0005）分配在96孔微板（CellCarrierltra 96​​，Perkinelmer）的底部；将siRNA缓冲液和非靶向siRNA用作对照 。简而言之 ，将转染试剂（Lipofectamine rnaimax
，Life Technologies）在Opti-Mem（Life Technologies）中稀释，并在微板阵列中添加到每个siRNA中
。30分钟后 ，将6.5×103个Vero细胞或8×103 HEK293T细胞播种在每个孔中。所有siRNA均以6 nm至50 nm的不同浓度进行测试 。siRNA转染后二十四小时
，使用标准的正向转染方案转染了100 ng的PEC117-Spike-V5或PCMV-EGFP表达质粒。简而言之，使用以下比例将pDNA与转染试剂（Fugene HD ，Promega）混合在Opti-MEM（Life Technologies）中：1μgPDNA：3μlFugenehd
。将混合物在室温下孵育20分钟，并添加到siRNA转染的板中。24小时后
，将细胞固定在4％多聚甲醛中，并处理以进行免疫荧光 。对于基因沉默实验 ，使用标准的反向转染方案（最终浓度为25 nm）将指示的siRNA转染到VERO或HEK细胞中
。简而言之
，在Opti-Mem（Life Technologies）中稀释了转染试剂（Lipofectamine rnaimax，Life Technologies） ，并将其添加到12孔板中的siRNA中；30分钟后
，将大约1×105–2×105的细胞播种。48–72小时后，通过QPCR和/或Western印迹分析细胞裂解物 ，如稍后所述 。 　　用PEC117-Spike-V5和PMCherry-NLS或空的PZAC 2.1矢量转染Vero细胞
，或如上所述用指示的siRNA反向转染
。在测试当天，将细胞在96孔微板中播种 ，底部平坦
，透明的底部（Cellcarrierultra 96​​，Perkin Elmer）的密度为6,500个细胞 ，持续2小时。然后用不同的药物浓度处理细胞1小时 。在室温下用不含FB的培养基洗涤一次后，将细胞与100μL1：100膜联蛋白XII（PSIVA ABCAM AB129817）一起孵育
，有或没有5-10μM离子霉素
。然后使用插入20×Na1.1镜头的操作CLS显微镜立即通过荧光显微镜成像细胞。每孔的九个图像在不同的波长下自动获取：（1）激发460–490 nm，发射500–550nm（附毒素XII XII“绿色 ”）；（2）激发530–560 ，发射570–650 nm（MCHERRY-NLS“红色
”）；（3）布莱特菲尔德；（4）数字阶段对比度 。 　　将细胞在10厘米的培养皿（每盘120万细胞）中播种
，在随后的一天达到70–80％的汇合，并用siRNAS反向转染
。使用5μgPGCAMP6S和5μg进行共转染 ，并使用30μLFugeneHD转染试剂（Promega E2311）在500μL的Opti-Mem培养基中使用30μlFugeneHD转染试剂（Promega E2311）进行共转染。转染后十六小时
，将细胞分离，用PBS洗涤 ，并用1 g L-1葡萄糖（生命技术）在DMEM中稀释至每毫升6×104个细胞
，并补充了10％的热灭活FBS（Life Technologies） 。将每孔（100μl）总共6,000个细胞在96孔的微板中播种，底部平坦 ，底部（Cellcarrierultra 96​​
，Perkin Elmer）。对于药物治疗实验，用1μM烟酰胺（EP N0560000） ，5μM氯富齐胺（EP Y0000313），5μM盐霉素（Sigma S4526-5）或1％DMSO处理
，对细胞进行三个小时的治疗
。对于钙排泄测定，将细胞保存在无钙培养基中或用10μM环皮二唑酸（Tocris 1235） ，500 nm Thapsigargin（Tocris 1138）或0.1％DMSO处理。 　　使用Operetta CLS高含量筛选显微镜（Perkin Elmer）进行图像采集
，在37°C和5％CO2下具有Zeiss 20×（Na 0.80）物镜 。每2分钟以460–490 nm的激发为500–550 nm（GCAMP6S传感器“绿色”），每2分钟每2分钟进行每孔总共三个场
。随后使用ImageJ软件分析图像。对于每个帧 ，从前一个采集中的同一框架中减去荧光强度（F）
，以删除背景信号并计算ΔF/F0指数，其中F0是中位基线荧光和ΔF= f -f0 。为了进行强度分析 ，考虑了每个条件的12个以上的感兴趣区域（ROI）
，每条条件总共汇总了至少50个GCAMP6S阳性细胞
。对于每个ROI，用“查找峰 ”的条脚本考虑了正ΔF值（即增加）。其中 ，上四分位数上方的四分位数范围的1.5倍以外的值被认为是“尖峰” 。然后在整个观察期内对单细胞尖峰频率进行计数
。 　　使用标准的TRIZOL RNA提取方案从HEK293T或VERO细胞中分离总mRNA或VERO细胞48-72小时。按照制造商的说明
，使用20μl反应中，使用MLV-RT（Invitrogen）用随机六聚体引物（10μM）对获得的RNA（0.5-1μg）进行反向转录 。TMEM16A（HS00216121_M1） ，TMEM16B（HS00220570_M1），TMEM16E（HS01381106_M1）和TMEM16F（HS03805835_M1）的基因表达的定量（HS00220570_M1）
，使用Quccr（HS01381106_M1）和TMER Forne for Nirers pre（Qpcr）
。分析。管家基因GAPDH（HS02786624_G1）的表达用于归一化 。 　　使用Taqman基因表达主混合使用QuantStudio3机器（Applied Biosystems 4369016）进行扩增。根据制造商的说明，对QPCR配置文件进行了标准协议
。有关QPCR分析中使用的引物序列 ，请参见补充表3。 　　After siRNA transfections for 48–72 h, HEK293 cells were collected and homogenized in RIPA lysis buffer (20 mM Tris-HCl, pH 7.4, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl, 0.5% Nonidet P-40, 0.1% SDS, 0.5% sodium deoxycholate supplemented with protease inhibitors (Roche)) for 10 min at 4 °C and通过使用Bioruptor（Diagodode）超声处理30分钟 。用Bradford试剂（Biorad）测量的相等量的总细胞蛋白（15–20μg）通过电泳在4–20％梯度聚丙烯酰胺凝胶（微型prototean
，Biorad）中分辨出来，并转移到硝基纤维素蛋白酶/PVDF膜（GE Healthcare）中
。用PBST（PBS + 0.1％Tween-20）在室温下用5％脱脂奶粉（Cell Signaling ，9999）阻断膜60分钟。Blots were then incubated (4 °C, overnight) with primary antibodies against ACE2 (diluted 1:1,000), TMEM16F (1:1,000), β-actin (diluted 1:5,000), V5 (diluted 1:5,000) or TMEM16F (diluted 1:500), TMEM16A (diluted 1:500) and TMEM16B (diluted 1:1,000).用PBST洗涤印迹三次（每个5分钟） 。对于标准的蛋白质印迹检测
，将印迹与抗兔HRP偶联抗体（1：5,000）或抗小鼠HRP偶联抗体（1：10,000）一起孵育1小时
。用PBST（每个10分钟）在室温下洗涤3次后，用ECL（Amersham）开发印迹。 　　在涂有聚赖氨酸的玻璃盖滑板上生长的HEK293细胞上进行了全细胞贴片夹记录 。电镀后 ，第二天用EGFP或EGFP
，Spike蛋白和ACE2的组合转染了细胞
。转染后通常进行12-36小时记录。TMEM16F敲低实验是通过用对照siRNA（NT1）或靶向TMEM16F的siRNA转染HEK293细胞进行的 。通过将500×103 HEK293细胞与12.5 nm siRNA一起使用12孔板，通过将siRNA的递送完成
。如所述 ，在siRNA转染后二十四小时用PCMV-EGFP表达质粒转染细胞。转染后六个小时
，将细胞铺在每直径18 mm的直径玻璃盖上，这些玻璃覆盖层涂有每孔10×103个细胞的聚生物 ，并在电镀后记录12至36小时 。 　　全细胞记录在包含（MM）的HBS外溶液（pH 7.3，315 MOSM）中进行：139 NaCl
，2.5 kCl，10 HEPES ，10 HEPES
，10葡萄糖，1.3 MGCL2和2 CaCl2。修补电极由厚壁的硼硅酸盐玻璃（外径：1.5毫米：内径为0.86 um ，Sutter Instruments）
，可在3至4MΩ之间获得电阻，并填充含有（In mm）的细胞内溶液：130 cscl ，10 cscl
，10 hepes，10 hpe ，10 egta
，1 mgta，1 mgatp ，1 mgmgmmgmgmgmgmgmgmgmgmgmgmgmgmgmgmgmgmgmgmgmgmgcl2 and cccl2 car 2 ccl2 and cccl2和1 mgmgcl2 and ccl2 and ccl2 and ccl 2使用MaxChelator CA-MG-ATP-EGTA计算器V.1.0软件进行计算
。使用CSOH和渗透压将溶液调节至7.4的pH值为290 MOSM。使用多灯700B放大器（分子设备）获得记录，并用Digidata 1440A数字化器（分子设备）进行数字化 。使用软件夹具V.10.3.1.5（分子设备）和Axon Multiclamp 700B指挥官软件（分子设备）获取数据
。以5 kHz采样信号
，并以2.5 kHz过滤。在获得密封形成之前，将移液器偏移无效 ，并在获得GIGA-SEL后
，在细胞连接的配置中补偿移液器电容 。我们使用对超极化和去极化步骤的响应来估计记录的串联电阻（RS），膜电阻（RM；从新电压处的稳定保持电流）和膜电容（CM；从峰值到峰值到峰值的衰减电流下的面积）
。如果访问电阻超过15MΩ ，并且输入电阻低于150MΩ
，则将排除记录。所有记录均在室温下进行 。 　　我们的策略是靶向单核的细胞（尚未融合的细胞），因为我们发现我们无法从大型合成中获得稳定的记录
。尽管表达尖峰细胞的某些记录可能包括早期合成症 ，但它们不太可能包含2个以上的核。实际上
，不同实验组之间的平均膜电容是细胞大小的间接度量，并没有显着差异 。然而 ，为了避免细胞尺寸的任何问题
，所有电流均表示为当前密度
。将细胞保持在0 mV，坡道由短步骤到-80 mV ，然后是500 ms的坡道，从-80到+80 mV
，或更长的300 ms步长至-80 mV，然后从-80到+80 mV。由于目前的响应没有显着差异 ，因此将数据汇总在一起 。为了从坡道协议中删除泄漏电流
，将一条线拟合到从-80到-20 mV中测量的电流，并从整个曲线中减去。所得的坡道显示出在0 mV时逆转的向外整流电流清晰可识别的
。使用Matlabv。R2019A和Prism v.9.0.1（GraphPad）中的自定义书面例程进行分析 。 　　SARS-COV-2/ENGLAND/IC19/2020（IC19） ，在从伦敦的圣玛丽医院（英国）的Star Mary医院收集的临床样本中分离出的CACO2细胞
，用于细胞保护测定
。通过使用DPC（数字相对比）成像，使用高含量显微镜将细胞在4％PFA中固定在4％PFA中 ，然后使用高含量显微镜（数字相对比）来测量病毒感染后的细胞存活。 　　SARS-COV-2 England England 02/2020/407073用来研究药物抗病毒药效应
，由英格兰公共卫生提供（M. Zambon和H. McGregor48,49） 。对于药物抑制测定，将药物在DMSO中稀释 ，并添加到96孔E6细胞中2小时
。将病毒在MOI 0.05中加入1小时
，用PBS洗涤，然后在含新鲜药物的培养基中培养48小时。使用Vero E6细胞通过斑块测定法对培养上清液中的病毒产生 。IC50值定义为上清液滴度降低50％的药物浓度
。使用Prism 8.0（GraphPad）分析数据 ，并使用剂量 - 反应（可变斜率）方程来通过非线性回归分析计算IC50值。 　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然研究报告摘要中获得 。