所有实验程序均根据1986年的《英国动物（科学程序法》）进行。在适当的道德审查后，在伦敦大学学院进行了实验 。 　　对在12至15周之间保持在12小时的光周期 ，在20-24°C和湿度为45-65％的小鼠中进行实验
。为了在事后鉴定转录组亚型
，使用了四个（两名男性和两名女性）GAD2-T2A-NLS-MCHERRY转基因小鼠（股票号：023140，杰克逊实验室） ，表达了表达GAD2-Expent-Expent-Expent-Expent-Expent-Expent-Expent-Expent-Expent-Expent-Expection-Expection-Expection-Expection-Expectional Laboratory。为了与转基因小鼠系进行比较（扩展数据图5）
，如参考文献中进行了其他实验 。30使用一个雄性PVALBTM1（CRE）ARBR和两个雄性和一名雌性SSTTM2.1（CRE）ZJH与GT（ROSA）26Sortm14（CAG-TDTOMATO）HZE交叉
。 　　在手术当天，用异氟烷（氧气为1-2％）麻醉小鼠 ，使用闭环加热垫监测其体温并保持在37-38°C，并用眼部透明胶（Viscotears液体凝胶
，Alcon）保护眼睛。在手术前和口服后几天，皮下施用镇痛药（Rimadyl ，5 mg kg -1） 。在手术前30分钟
，对肌肉内进行了地塞米松（0.5 mg kg -1），以防止脑水肿。裸露的大脑经常被人工脑脊液灌注（150 mM NaCl ，2.5 mM KCl
，10 mM HEPES，2 mM CaCl2 ，1 mM MGCL2； pH 7.3用NaOH
，300 MOSM调节）
。在手术期间，我们首先在颅骨的右半球上植入头板以进行后固定：使用牙科水泥（超键C＆B ，10 Sun Medical）将带有10毫米圆形开口的不锈钢头板固定在头骨上。然后
，我们使用活检打孔器在V1（3毫米直径）上进行了圆形颅骨切开术 。此时，在颅骨切开术中的不同位置进行了六到七份病毒注射
。最后 ，使用氰基丙烯酸酯粘合剂（Vetbond，3M）和牙齿水泥密封颅骨切开术。 　　所有小鼠均注射了无条件的GCAMP6M病毒
，AAV1.Syn.gcamp6m.wpre.sv40，从宾夕法尼亚大学病毒载体核心获得 。使用纳米注射器（Drummond Scientific Company ，Broomall
，PA 1）注射该病毒，并在立体观念微型手持剂上注射贝彩片
。6至7个玻利的100–200 NL病毒（2.23×1012 GC ML -1）缓慢地（约20 nl min -1）单方面注射到单眼V1中（参考文献51）2.1-3.3 mm ，横向上
，3.5-4.0 mm，从bregma和L2/3-300-3（200-300 -MMMMMM MM）后端端端端 ，并在后部端端。 　　注射病毒后
，将少量推注（10μl）红色的荧光珠（羧酸盐修饰的微球，2.0 µm ，红色荧光（580/605）
，2％固体，Thermo Fisher Scientific）注入了颅骨术的最大含量 ，允许在挑战中注入挑战的一部分 。尾部部分
。恢复后，将小鼠习惯于处理和头部固定三天
，然后进行录音。 　　将每只鼠标记录至少三个会议 。病毒注射后15-45天进行体内记录
。我们使用了由扫描仪4.2（参考文献52）控制的谐振 - galvo扫描仪（B-Scope，Thorlabs）的商业两光子显微镜 ，其采集帧速率约为30 Hz（在512乘512乘512个像素
，对应于4.3 Hz的Aampling速率）。视场为550–600 µm 。我们在15–45 µm步骤中成像了七个平面，从大脑表面以下的各个位置开始（从0到-150 µm） ，以样品采样不同的皮质深度
，因此在不同的会话中同时记录了亚型。成像钙活性在920 nm或980 nm的波长下进行
。沿着方位角轴横跨-135至+135的视觉度（V°）的三个计算机屏幕，沿着海拔轴沿着轴和-35至+35 v°用于显示视觉刺激。在展示视觉刺激期间 ，我们关闭了监视器的红色枪支
，以防止监视器污染红色荧光通道的光 。 　　在每个录制会话结束时，获取参考Z堆栈
。从与成像平面相同的位置开始 ，我们获得了两个约400μm深度的Z-stack
，在平面之间以1μm的步长。第一个称为GCAMP Z-stack，以与钙成像（920或980 nm）相同的波长获取 。第二个称为参考Z-stack ，以1,040 nm的形式获取，以形象麦克利荧光
。 　　在对每只小鼠安乐死之前
，我们在1,040 nm处获得了结构性Z堆（从脑表面到400μm深），以获取整个颅骨切开术的麦克利细胞的图像（包括注入红色荧光珠的位置）。该结构Z-stack用于选择用于执行转录组分析的切片 ，并为注册算法提供初始化点 。 　　所有记录均针对V1单眼区域（> 60°方位角）
。为了找到该区域
，在第一个成像会话中，我们最初使用单平面成像映射了不同候选视野的视网膜。将稀疏的噪声刺激呈现给小鼠 ，由宽度为4.5°的黑色或白色正方形在灰色背景上以5 Hz的帧速率组成10分钟 。正方形在16 x 60个网格中随机出现在固定位置
，跨越计算机屏幕的视网膜范围
。1.5％的正方形在任何时候都显示。 　　漂流的光栅集中在显微镜视野的平均接收场上 。光栅的持续时间为0.5 s，时间频率为2 Hz ，空间频率为每度0.15个周期。光栅向12个不同的方向漂移（从0到330°
，分开30°），为3种不同尺寸（5° ，15°和60°直径）
。 　　来自Imagenet数据库的自然场景对比度归一化并如前所述34。每个图像以0.5 s的间隔均匀分布为0.3至1.1 s
，将每个图像呈现为0.5 s 。总介绍的五％是灰色刺激
。在每个会话期间，我们呈现了两次给定的1,000个不同自然图像（对应于最初使用的2,800张图像的子集34）。 　　在每个录制过程中 ，我们呈现了用于绘制视网膜映射的相同随机稀疏噪声刺激（见上文），持续30分钟 。 　　自发活动记录在均匀的灰色屏幕前
，设置为稳定的青色水平，等于为视觉响应方案提供的所有刺激的背景
。这些灰色屏幕演示的持续时间通常在15至20分钟之间。 　　我们使用了准直的红外LED（SLS-0208-B ，LPEAK = 850 nm;控制器：SLC-AA02-US; MIGHTEX Systems）来阐明与记录位点对侧的眼睛 。用单色相机（DMK 21BU04.H
，成像源）捕获了眼睛位置的视频，配备有变焦镜头（MVL7000； Navitar） ，并以大约50°Azimuth和50°的升级为鼠标中心
。使用放置在相机物镜前（长通092/52×0.75）的光带滤光片（700-900 nm）拒绝显示监测器和成像激光器的污染灯。 　　使用Suite2p处理两光子钙数据（参考文献53） 。通过从每个感兴趣的区域（ROI）中减去其周围的神经纤维信号乘以恒定因子为0.7
，从而纠正了神经质污染
。使用非阴性尖峰反volution54对钙痕迹进行反围候，其钙指示剂衰减时间尺度为1.5 s。手动策划了ROI ，以确保仅考虑细胞体进行进一步分析 。 　　已经描述了许多高度多重mRNA检测的方法
，已描述为55,56,57,58,59,60,61,61,62,63,64,65,65,66,67,68,68,69,69,70,71,72,73。Coppafish方法是原位测序方法28的开发（扩展数据图1）
。该方法使用逆转录，挂锁探针和滚动循环放大 ，将mRNA放大至DNA滚动循环产物（RCPS）
，其中包含多个20-核苷酸（NT）条形码序列的多个副本，然后在7轮荧光荧光成像中检测其位置。 　　选择了一个73个基因 ，以识别皮质细胞类型 。该面板是先前的研究28中描述的99个基因的一个子集，该小组使用算法根据SCRNA-SEQ数据选择了该算法
，该算法预测需要哪些基因组合来识别精细的转录组亚型
。回顾性分析分析了每个基因对分类精度的贡献表明，该小组中的26个基因无目的用于准确分类细胞（参考文献28的图S16） ，从而导致它们从面板中取出。在我们的实验中检测到一个基因（YJEFN3）
，但不能用于将细胞分配给转录组亚型，因为它在参考scrna-seq dataset3中不存在 。因此 ，在主要文本中
，我们指的是一个72基因面板
。 　　为每个基因设计了多个挂锁探针，跨越cDNA的长度（补充数据2）。根据由SCRNA-SEQ确定的每个特定基因的表达 ，根据每个特定基因的表达选择每个基因的不同挂锁探针的数量 。这意味着将较少的挂锁探针用于具有高表达的基因
，反之亦然（例如，为SST设计了四个挂锁探针 ，但为CHODL设计了10个）
。所有挂锁探针均由两个15-20-NT识别位点
，一个20-nt基因条形码（每个基因独有）和一个20-NT锚定序列（对于所有基因和挂锁探针相同）。 　　使用先前描述的Software28设计挂锁探针 。简而言之，该软件通过限制结合序列的熔化温度 ，以及使用BLAST+检查候选序列与鼠标整个转录组（RefSeq数据库）通过限制候选序列来找到合适的RNA目标序列
。除了50％以上的覆盖率，跨越目标序列的中央10 NT的80％同源性和覆盖范围
，其他成绩单或非编码RNA序列的候选目标被排除在50％以上。对于每个挂锁探针，我们还为逆转录设计了一个特定的底漆：15 nt长的DNA寡核苷酸 ，该核苷酸结合了由Padlock探针靶向的mRNA序列上游的区域（补充数据3） 。与随机引物相比
，特定引物的使用大大改善了每节获得的RCP数量（Bugeon，S。等人 ，未发表的观测值）
。 　　为了确定基因特异性DNA条形码序列（和锚定序列）
，将240,000个正交25-mer寡核苷酸序列74从5'端修剪为20 nt，并使用Santalucia方法筛选熔化温度（55°C和56°C之间）。使用BLAST +与NCBI鼠标基因组和转录本（鼠标G + T）数据库进一步筛选了用小鼠序列进行正交的筛选 。我们使用以下BLAST参数：“ -Reward ” ，1
，“ -penalty
”，-2 ，“ -gapopen”
，2，“ -gapextend ” ，1，“ -evalue
”
，10
。此爆炸搜索中的任何匹配均从池中删除。接下来，我们使用相同的BLAST参数检查了其余序列对自己的潜在交叉反应性 ，并删除了任何命中
，从而产生了6,397个可能的序列 。从该池选择条形码序列
。 　　组合成像策略使用了两种类型的DNA探针。设计了七个“染料探针”，每个探针都由一个20 nt长的DNA寡核酸组成 ，该寡核共轭与以下七个荧光团之一：DY405
，AF488，DY485XL ，AF532
，AF532，AF594 ，AF594
，AF647和AF7​​50；在每个成像圆上使用相同的染料探针（补充数据4） 。此外，为每个成像弹设计了一组40 nt的“桥梁探针 ” ，将每个基因的RCP条形码与七个染料探针之一联系起来（扩展数据图1和补充数据5）
。因此，桥梁探针导致每个基因在每个回合的特定颜色通道中显示。将七个染料探针与RCP与桥梁探针联系起来的两部分策略可在制造Ngenes×Nrounds染料探针方面节省大量成本
，因为染料耦合探针比简单的DNA贵得多 。 　　每个基因都使用Reed -Solomon编码方案75（补充数据6）为七个成像弹分配了一系列染料，该染料构建了最小可能的重叠序列
。具体而言 ，基因由整数G编号
，并转换为基本7表示G2G1G0。在r弹R分配给基因G的染料为 　　如果将添加和乘法理解为Modulo 7 。代码0至6（对应于每轮相同的颜色），因为这些代码无法与固定背景荧光区分开 ，因此使用了相同的颜色。 　　所有自定义的DNA寡聚（挂锁探针
，引物，桥梁探针和染料探针）均从集成的DNA技术获得
。挂锁探针被订购为5'磷酸化4 nmol Ultramer DNA寡聚；所有其他寡核酸均被命令为经典25 nmol DNA寡核酸。补充数据2–5中提供了所有556个引物和挂锁探针 ，511个桥梁探针和7个染料探针的DNA序列 。 　　体内记录完成后
，用异氟烷麻醉小鼠，然后用致命剂量的戊巴比妥钠（0.01 mL G -1）注射
。然后将新鲜的大脑从头骨上剖析 ，非常小心地保留组织的完整性并避免翘曲。然后将大脑放入OCT（Sakura Finetek）
，然后在干冰上冷冻30分钟 。然后将样品存储在-80°C下直至切片
。然后，使用每个大脑的Leica低温恒温器获得矢状切片（15 µm厚） ，并安装在明胶涂层的硼硅酸盐玻璃盖（22 x 55 mm）上。明胶涂层的盖玻片允许整个方案中的组织截面粘附在盖玻片和RNA保存上 。To make them, coverslips mounted on a rack were dipped for 30 s in a solution of 2% w/v gelatine and 0.2 % w/v chromium potassium sulfate dodecahydrate in distilled water (https://www.rndsystems.com/resources/protocols/protocol-preparation-gelatin-coated-slides-histological-tissue-sections).在每个盖玻片上融化了两个至三个脑部切片，然后冷冻并存储在-80°C下
。 　　不必将MCHERRY和GCAMP的天然荧光漂白（原则上可能会干扰以后的荧光成像）
，因为这些荧光在标准组织加工过程中完全消失了。 　　如前所述，制备了RCP ，并进行了一些修改 。首先
，从冰箱中取出盖玻片，然后在室温下使用4％多聚甲醛（PFA）直接预固定5分钟
。这种预固定之后是用无核酸酶缓冲盐水（PBS）快速洗涤 ，并在室温下在0.1 m HCl中孵育5分钟。再洗一次PBS后
，将切片在70％乙醇中孵育1分钟，然后在室温下在100％乙醇中孵育1分钟 。然后将盖玻片放在空气中干燥。为了将试剂保持在组织截面上 ，使用疏水性屏障Pap笔（直接疏水屏障Pap h-4000
，载体实验室）在每个部分上绘制屏障
。 　　然后将切片直接在逆转录混合物中直接在37°C的逆转录混合物中孵育，并在加湿的腔室中（幻灯片染色系统 ，染色M918
，VWR）。该混合物包含0.5 mM DNTP混合物（热渔民科学），基因特异性引物（每个10μm） ，0.2μgμl-1 BSA（NEB），1Uμl-1 ruboprotect RNase RNase RNase抑制剂（BLIRT）和20UμL-1转录逆转录酶（BLEVERSTRICT bull）（BLEVERSERCTAIN）在1×reversects Cressive in Cressift in Cressift in Cressift in Cressercrance in 1×revessercrance in 1××Reversercrance（BLEVERSERCERCER） 。除去混合物
，并将PBS中的新鲜4％（w/v）PFA添加到中间，而不会在两者之间进行任何洗涤
。固定后步骤旨在交联新合成的cDNA到细胞基质 ，并在室温下进行30分钟
，然后在PBS中进行两次洗涤。然后使用单个反应混合物进行RNASEH消化，挂锁杂交和连接 。该混合物包含0.05 m kCl（Sigma） ，20％碳酸乙酯（Sigma）
，10 nm的每个挂锁探针（557个探针），0.2μgμl -1 bsa ，0.3uμl -1 tth DNA连接酶（Blirt）和0.4uμl -1uμl -μl -1 rnase h（blig）H（bligs）expaster h（blig）eperer（blig）（blig）1×Ampl）（1×Ampl）
。首先将切片在37°C下孵育30分钟
，以进行RNASEH消化，并移动至45°C 60分钟 ，以进行严格的杂交和最佳的DNA连接酶活性。然后将部分在PBS中洗涤两次 。最后
，对于滚动圈的扩增，将切片孵育在含有5％甘油（Sigma）的混合物中 ，0.25 nm DNTP混合物，0.2μgμl-1 BSA
，0.2UμL-1 Equiphi29 DNA DNA Polymerase（Thermo Fisher Scientific）（Thermo Fisher Scientific）和1×Equienticific（Thermo Fistific）（Thermo Fisher Scientific）和1×Equiptific（Thermo Fistific）（Thermo Fistific）（Thermo Fistricic）（thermo fistific）（过度）
。 　　通过将AF750偶联的寡核苷酸探针（IDT）与所有RCP中存在的锚定序列杂交，在完整条形码读取之前迅速验证了RCP的生产。将切片在室温下在含有10 nm的染料探针 ，2×SSC
，20％碳酸盐和H2O的杂交混合物中孵育15分钟 。然后用2×SSC洗涤两次
。然后将SSC从部分中取出，并使用10 µL Superfrost Gold Antifade Mountant（Life Technologies）将盖玻片安装到Superfrost Plus（VWR）载玻片上。然后获取ROI（视觉皮层）的图像以可视化RCP 。 　　所有七轮成像都发生在自定义流动池中 ，使用自动化的流体在每一回合前洗涤合适的桥和染料探针。使用搅拌器设计流动池
，并使用ultimaker S5 3D打印机在聚乙烯酸丝（PLA）中使用聚乙烯醇（PVA）支撑结构设计
。打印后，通过将流动池放在摇杆上过夜 ，将PVA支撑取出。为了使流动池安全
，两个22×55毫米的玻璃盖板（一个带有RCP含RCP的部分，一个裸露的部分）和两个大约40厘米长的Efte管（用于使用UV Optical（Norland ulland ulland ulland curing andical）的uv ulland ulland curing 81 ，将tefzel tefzel Nat 0.0625英寸外径x 0.020英寸内径固定在手持式365 nm光源（Thorlabs
，CS20K2） 。安装了带有部分的盖玻片，以使侧面的侧面面向流动池的内部
。 　　成像设置由带有NIR-LDI激光面板和Zyla SCMOS 4.2相机（Andor）的尼康Eclipse Ti2显微镜组成。流体设置由一个微型3泵（吉尔森）和两个连接的MVP多数字（汉密尔顿）组成 ，每个端口都有8个端口 。Nikon NIS Elements软件（V.5.20.02，Build 1453）用于获取图像并与控制流体泵和多数字的第二台计算机进行通信
。阀门的打开以及泵活动的速度和持续时间由编辑的Kilroy软件（https://github.com/zhuanglab/storm-control; editts; editts; acycliq/storm-control）进行了管理。成像和测序化学由NIS Elements软件（ND序列采集模块）协调
，该软件通过National Instruments NI-USB 6008板通过发送TTL脉冲来与运行Kilroy的计算机通信 。 　　在测序之前，为七个成像弹中的每一个中的每一个中含有桥梁探针混合物 ，以及染料探针混合物
，锚探针混合物，成像缓冲 ，2×SSC和100％甲酰胺的15 ml猎鹰试管
，每座都通过EFTE tube tube and theless and andive and vellant andive and noth andive and vellc and vellc and vellc and velrin and velrin（1/16英寸）
。桥梁，染料和锚探针的混合物包含在2×SSC ，20％碳酸乙二烯和H2O中稀释至10 nm的适当寡核苷酸。最终锚圆形的桥探头混合物包含Cy7偶联的锚探头以及与AF532染料探针结合的GAD1桥探针（GAD1_R6 - 10 nm）和DAPI
，以染色细胞核 。每个实验（存储在4°C）中都使用新的甲酰胺（S4117 Millipore）等分试样
。然后将流动池安装到多斜线阶段，并通过EFTE管连接到泵和多数字。将泵的速度调节到约0.4 mL s -1 。为了填充流动池 ，将每个溶液通过流体系统冲洗4分钟（流动池体积约为1 ml）。 　　对于每个成像实验
，总共进行了八轮成像：七个回合条形码和一个最后的锚圆形圆形，以检测每个用于以后图像对齐的RCP的位置
。在每一轮中 ，首先将切片在100％甲酰胺中孵育15分钟，以从任何以前的标签中剥离RCP。然后将甲酰胺用水从流量池中冲洗4分钟
，然后用2×SSC冲洗4分钟 。将部分在该圆形的桥梁探针混合物中孵育15分钟，然后用2×SSC洗涤
。此后 ，将切片在染料探针混合物中孵育15分钟
，并再次用2×SSC洗涤。流动池充满了成像缓冲液，该成像缓冲液由葡萄糖氧化酶和含有氧气清除系统的过氧化酶组成 ，以保护荧光团在成像过程中的光漂白 。 　　每一轮测序化学后
，使用宽田表荧光激发获得16位图像，并具有40倍放大倍率的空气目标（CFI PLAN PLAN PLAN APOCHROMAT LAMBDA 40XC ，NA 0.95）
。图像由七个不同的颜色通道中的Z堆栈（Z-Step：0.5μm）组成
，与七个荧光团（荧光团 - 激发波长，发射过滤器：DY405 - EX405 ，460/50 M; AF488 - AF478 - EX470
，525/36 M; DY485XL - ex485xl - 632/632/60; af470，632/632/60;560/40 m; AF594 - EX555 ，632/60 m;每个瓷砖为2,048×2,048像素（像素尺寸：0.1625μm）。调整成像参数仅覆盖ROI（V1），通常由10-15个瓷砖组成
，重叠10％ 。尼康完美的焦点系统用于确保焦点在成像弹中保持相对恒定
。图像文件保存在尼康的本机ND2格式中。 　　使用一套定制软件来分析原位数据，用于图像处理 ，基因调用和细胞调用 。所有代码均以MATLAB编写
，并在https://github.com/jduffield65/iss上免费提供
。该软件是从先前描述的28中开发的，但经过了大量修改 ，因此在此处进行了完整描述。 　　原位数据由八发多光谱成像组成（七个组合弹
，一个参考回合，其中所有RCP都通过锚序列标记 ，以及用于GAD1 RCPS和DAPI染色的其他污渍） 。由于组织样品对于单个相机图像太大
，因此在重叠的瓷砖中进行成像。在每个瓷砖中，每种颜色都拍摄了宽大图像的焦点堆栈 ，并使用焦点算法的扩展深度将其扁平化成两个维度（2D）
。因此
，数据由一组图像组成： 　　在这里，我给出了用于测序圆形r ，颜色通道C，瓷砖t和像素坐标x在该瓷砖中的X的像素强度。识别检测到基因的处理管道包括多个步骤：初始注册；RCP斑点检测和良好的注册；跨话补偿；和基因呼唤 。这些分析进行了
，而没有将所有瓷砖缝制成一个大图像
。这种方法允许在内存有限的计算机上处​​理非常大的数据集，并且还可以轻松允许非刚性比对。在管道之前 ，所有RCP图像都通过与汉宁的差异进行线性过滤：半径为0.5μm的hanning减去半径为1μm的hanning
，均归一化以均衡 。DAPI背景图像用半径为8μm
。 　　最初的注册步骤使用第8轮拍摄的锚图像在所有图像图块之间找到偏移（我们称为“参考图像”）。我们使用它来定义整个组织样品的全球坐标系 。 　　因为我们使用方形的策略，所以每个瓷砖最多可能具有四个“邻居
”：其具有大量重叠区域的其他瓷砖
。我们表示相邻的瓷砖对。 　　首先在每个图块的参考图像中检测到斑点 ，因为过滤图像的局部最大值超过了固定的检测阈值 。要对齐参考图像
，我们循环循环所有对相邻图块，并计算一个偏移以注册这两个图块过滤后的参考图像的重叠区域
。通过对所有2D偏移的详尽搜索 ，在显微镜位置传感器预期的范围内
，通过详尽的搜索发现了两个图块T1和T2之间的偏移。对于每次偏移，我们在T1上找到每个位点S应用换档后 ，像素距离ds到T2上最近的位置 。计算一个分数
，并将最终移位向量视为最大化该分数的分数。也就是说，邻居最近的人
。 　　我们通过找到每个图块T的坐标原点XT来定义一个单个的全局坐标系。请注意 ，由于邻居对多于瓷砖，因此该问题被过度确定 。因此
，我们通过最小化损失函数来计算偏移 　　相对于XT区分此损耗函数会产生一组同时的线性方程，其解决方案在参考弹上产生了每个图块的起源
。此步骤的结果足以定义全球坐标系 ，但由于发生了色差以及小旋转或非韧性移位的出现
，因此不提供多个彩色通道的图像的像素级对齐。下一步将通过点云注册来处理后者 。 　　第二个处理步骤检测七个测序弹的所有图像中的斑点，进行颜色通道和测序弹的细微对准 ，并为每个位置计算在全局坐标中的位置
，并且强度向量汇总了该点在每个回合和通道中检测到的荧光的荧光
。 　　此步骤中最复杂的部分是精细的图像注册。即使将相同的瓷砖布局用于所有测序回合，但由于样品的放置和旋转的略有变化 ，瓷砖的精确位置可能会有所不同 。因此
，在不同的测序回合中的不同瓷砖上可能会发现一个斑点
。此外，由于色差 ，在不同颜色通道中的位置可能处于略有不同的位置（尽管没有不同的瓷砖）。由于大多数斑点的大小只有几个像素
，因此即使是单像素的注册误差也可能损害准确的RNA读取 。 　　使用上述初始注册为参考图像中检测到的每个斑点定义了全局坐标
。在瓷砖重叠的区域中，仅保留在全球坐标中更靠近其原始瓷砖中心的位置而不是其他任何地方来拒绝重复的斑点。 　　接下来 ，在所有测序回合和颜色通道的图像中检测到点位置 。这些用于使用Point Cloud Registration将每个回合和颜色通道与相应图块的参考图像对齐。具体而言，我们使用迭代 - closest（ICP）算法的仿射转换从每个参考图像到相应的瓷砖的图像
，以及与超过3个像素外的匹配
。这些仿射转换可以包括偏移，尺度 ，旋转和剪切
，但是我们没有发现有必要在瓷砖内引入非线性翘曲变换（非线性转换仍然可以通过跨瓷砖的仿射变换的变化在全球范围内发生）。由于ICP算法对局部最大值高度敏感，因此它是从通过相同方法计算出的移位转换初始化的 ，用于在参考图像之间找到重叠 。也就是说
，最大化近邻居数量的变化
。当斑点位于不同回合的相邻图块上时，相应的图像再次在ICP注册。 　　最后 ，通过从每个滤波的图像的对齐坐标中读取强度
，计算每个回合R中每个点S的七维强度向量VS 。 　　将斑点与基因关联的最后一步包括将强度向量转换为基因身份
。 　　在此阶段，重要的考虑因素是颜色通道之间可能发生串扰。由于光学出血 ，可能会发生一些串扰 。由于探针的化学交叉反应性
，可能会发生其他串扰
。随着当前的杂交化学（与以前的结合化学测序化学不同），串扰的程度在一轮中往往是恒定的 ，因此我们学习了一个7×7的串扰矩阵，并将其应用于所有回合。 　　为了估算存在的串扰
，我们首先收集了一组七个7维矢量与R，其中包含所有良好隔离斑点s的每个颜色通道中的强度 。仅使用良好的斑点来确保不受与不同基因相对的斑点的空间重叠的影响
。如果在斑点周围的环形区域（4-14像素半径）上平均参考图像强度平均的参考图像强度小于阈值小于阈值 ，则将一个点定义为良好。然后
，通过在这些向量上运行缩放的K-均值算法来估算串扰，该矢量找到了一组七个向量CD（d指七个染料之一） ，使得误差函数： 　　最小化；换句话说
，它发现了七个强度向量CD，因此 ，R圆形的每个良好位置都接近其中一个的缩放版本 。 　　跨词矩阵用于预测每个颜色通道和圆形的每个基因G的RCP预期的颜色曲线。如果将基因G分配为染料DG
，则在R中为R，则通过将相应的串扰矢量串联来获得预测的49维强度矢量
。 　　组织加工和原位化学的改善意味着我们当前的方法比以前的原位测序方法28产生的RCP要大得多。因此 ，相邻RCP的荧光通常会重叠
，这会使先前的检测方法无法找到它们 。为了解决重叠点，我们基于正交匹配追踪（OMP）78开发了一种基因称呼算法
。该算法还允许减去背景自动荧光。从本质上讲 ，OMP反复测试像素的49维荧光载体是否与每个基因的预测荧光载体重叠 。如果是这样，在该位置检测到一个基因
，则将其代码从荧光载体投射出来，然后重复该过程
。 　　OMP算法拟合了49维图像（圆形和颜色通道的每个组合的一个维图）作为49维代码向量的总和。每个基因都有一个代码向量AG ，每个颜色通道的一个“背景”代码仅在一个颜色通道中的所有回合都具有相等的强度 。这些背景代码解释了组织自动荧光
，这将平等影响所有成像弹
。 　　基因代码Ag是从每个圆中使用芦苇 - 溶剂分配的染料DG的知识来得出的。这些代码考虑到一个事实，即不同的基因可以在不同的回合中具有一致的不同强度 ，这可能是由于桥梁探针的合成浓度不均匀引起的 。为了说明这种不均匀性
，我们学习了一个比例因子εg，r ，并预测基因G的49维基因代码作为串联： 　　在指定如何选择εg
，r之前，我们将描述一般算法
。 　　OMP算法表示每个像素P作为代码向量的加权总和：。算法的每个步骤都可以将代码添加到用于近似像素VP的一组代码向量中；始终包括7个背景代码 。该基因集初始化为空 ，并选择在每个步骤中添加哪个基因代码（如果有）
，算法可以计算每种可能的添加物的残差减小，并选择该基因的最大减小 ，前提是该基因的最大减小，前提是
，该减小的阈值高于0.0612的阈值，最大值由VP的绝对值（最大值）（最大值）（均为vp的绝对值）。3.0） ，每个像素总共总共6个基因
。在此迭代过程终止了所有像素后
，为每个基因制作一个图像，如果该基因不在像素基因集中 ，则包含每个像素的基因的重量或零。RNA检测是该图像的局部最大值
，但要遵守阈值标准 。该标准考虑了几个因素，最好通过检查源代码（https://github.com/jduffield65/iss）来理解
。 　　为了选择比例因子εg ，r
，使用所有εg，r = 1的单个迭代emp算法的单个迭代。然后 ，我们计算每个回合中每个基因的所有检测点的7维平均强度向量 。然后
，我们发现每轮的比例因子εg，r和基因作为最小二乘溶液的溶液 　　DAPI图像用于分割细胞
。这是通过检测每个细胞中局部最大值随后进行分水分割来进行的。手动策划了匹配的细胞及其亲密邻居的分割 。 　　为了将细胞分配给转录组亚型 ，我们使用了先前描述的PCISEQ算法28，这是一种贝叶斯方法
，该方法分配了每个原位细胞的后验概率属于属于先验Scrna-seq定义的一组细胞类别
。正如我们从V1记录的那样，我们使用了先前研究中定义的转录组簇 ，仅使用V1的单元格来计算每个群集的平均表达。这些簇与其他皮质和海马区域产生的簇相似
，但可能有所不同，特别是对于细胞的亚型（参见参考文献6的图S1 ，以及参考文献1的扩展数据图3的扩展数据
，有关这些群集和其他分类方案之间的可能关系） 。将SCRNA-SEQ数据的读数除以100，以预测预期的原位RNA计数
。通过算法估算了进一步的基因依赖性效率因子。PCISEQ算法会产生每个单元属于每个类别的概率 ，我们通过将每个单元格分配给最大a后验概率的亚型来转换为“硬 ”分类；未进一步分析该最大概率小于0.5的细胞（约2％的匹配细胞；扩展数据图4C） 。我们使用以前定义的所有109个转录组簇分配了细胞3
，包括所有层和非gabaergagic细胞的抑制性神经元。然而，该算法将成像的抑制细胞分配给其中35个簇 ，对应于浅层抑制性亚型
。为了评估该算法的准确性
，我们使用泊松分布从SCRNA-SEQ数据集中进行了读取计数，然后估算了属于每个亚型的后验概率与原位单元相似（扩展数据图10）。这表明我们的72基因面板在子类 ，类型和亚型水平上的估计分配准确性分别为98.1％，96.6％和76.4％ 。 　　我们使用了由MCHERRY（GAD2-MCHERRY小鼠）在体内标记的抑制细胞作为地标
，以执行体内GAD-MCHERRY体积和离体脑部切片之间的注册（扩展数据图2）
。在每个成像会话之后，每个对象都为每个主题采集的两个高分辨率参考Z堆栈使用了这种比对。使用与功能成像（920或980 nm）相同的波长进行“ GCAMP Z-stack
” ，覆盖相同的体积
，但分辨率更高 。“ MCHERRY Z-stack”是在同一体积中获得的，具有1,040 nm的激发波长 ，以检测GAD2-MCHERRY小鼠中的抑制性神经元
，但在绿色通道中也提供了一些GCAMP信号（尽管该信号远低于GCAMP Z-stack Z-Stack在920 Nm处采用的信号）
。这两个Z堆栈的不同激发波长导致了一个小的色差，这仅在深度上显着。为了纠正这种像差 ，我们使用了两个成像量中发现的绿色通道
，使用快速傅立叶变换（FFT）卷积将GCAMP Z-stack的平面注册到MCHERRY Z-Stack 。这是通过找到每个GCAMP Z堆栈平面的最佳匹配平面作为Z位置，从而获得了最高的FFT互相关
。此外 ，在最后的功能成像会议之后
，还进行了“全球Z堆 ”，该会议涵盖了颅骨切开术下的整个区域。这用于对原位切片的粗略初始注册 。 　　为了使一个功能性两光子会话的成像平面与GCAMP Z-stack相结合 ，我们首先使用对每条扫描的线的物镜的测量位置（用于功能成像平面和GCAMP Z-stack），首先获得了其理论位置
。然后
，我们估计录制过程中的Z档：与此GCAMP Z-stack相比，钙成像平面的位置。为此 ，每7分钟记录每7分钟获得每个功能成像平面的平均图像 。然后
，使用FFT卷积将这些平均图像对齐与Z-stack。然后，随着时间的流逝 ，我们将这种Z-Drift的中位数置于校正理论成像平面位置
。然后
，我们执行了基于FFT的注册，以校正实际均值图像和重建图像之间X和Y的小移位。因此 ，我们发现了成像平面（以及每个功能ROI）在GCAMP Z-stack中的位置 。然后使用上述转换（深度色差）将它们与MCHERRY Z-stack对齐
。 　　为了在3D MCHERRY Z-stack中注册原位检测的抑制性神经元的位置
，我们使用抑制性神经元作为地标点，使用了一种自定义点云注册方法。可以在https://github.com/ha-ha-ha-han/neuromicscelldetection/以及https://github.com/sbugeon/neuromicscelldetection上找到MATLAB代码和示例管道脚本 。 　　在切片过程中 ，仔细记录了矢状脑切片的后期中等顺序
。为了找到与成像区域相对应的部分
，我们首先通过每20部分生成RCP来筛选它们，并用GAD1桥探针及其相应的染料探针染色 ，以标记抑制性神经元。通常在其中一个部分上可见荧光珠注射的位置，从而使我们能够推断每个切片的近似位置（基于已知的切片和厚度） 。 　　对体内参考Z-stack的筛选部分的精细注册始于体内和Ex Vivo的细胞检测
。To detect cells in the in vivo mCherry z-stack, each plane was contrast-normalized to correct for the loss of brightness with depth using the following MATLAB GUI https://github.com/nadavyayon/Intensify3D/blob/master/User_GUI_Intensify3D.m (which performs background and signal estimation based on user defined thresholds), and the z-stack was then filtered使用半径为2μm的3D中值滤波器减少背景噪声。使用3D差异的滤波器过滤器随后分割分割
，在这些图像上自动检测到麦克利阳性细胞 。进行手动策划以纠正错过或假阳性检测
。为了检测离体切片中的抑制细胞，我们在参考弹中使用了GAD1的原位表达 ，因为天然麦克利荧光未保存在新鲜冻结的切片中。GAD1检测是在GABA能细胞上形成簇（图2的扩展数据）
，通过对GAD1 RCP图像的高斯平滑检测，并应用了差异的高斯滤波器和水域分割以检测单个簇 。最后 ，我们使用72个基因的原位表达手动策划了这些检测
，以根据主要抑制性细胞标记（例如VIP，SST ，PVALB等）确定推定的中间神经元。 　　首先使用锚固和核染色可视化的大脑结构（海马
，脑表面等），首先使用脑结构（海马 ，脑表面等）进行了粗糙注册
。接下来
，使用算法对它们进行了细微的注册，以注册一个2D点云 ，该云对应于Ex Vivo Slice中的抑制性神经元中的3D点云，对应于体内体积中的抑制性神经元。为了使这些点云保持一致
，我们使用了6个自由度（α，β ，γ
，X，Y ，Z）的刚性登记
，其中α，β ，γ是旋转角度
，而X，Y ，Z是转换（非rigid点云量表）
，但我们发现它是不必要的） 。注册算法搜索了参数（αmax，βmax ，γmax，Xmax
，Ymax，Zmax） ，从而最大化了2D片的匹配到3D体积的相应部分
。 　　由于此注册问题具有大量本地最大值
，因此我们对这六个参数进行了详尽的网格搜索。由于3D阵列的傅立叶卷积很快，但是它们的旋转不是 ，因此我们使用了混合点和傅立叶方法 。外环在所有旋转角度（α
，β，γ）的所有组合上进行搜索 ，初始步长为1°
，精制到0.5°以使其比对，并相应地旋转3D点云
。然后通过在每个点的位置添加一个高斯峰来从这些旋转点合成3D体积图像。该图像的每个平面z均与固定的2D阵列相似地合成为2D云而进行了傅立叶 ，并存储了所得的3D相关图
，以积累相关得分函数C（α，β ，γ，γ
，X，X ，Y
，Z） 。使用交叉校正图峰的强度和在15μm耐受性匹配的细胞百分比（以占小的非刚性变形）中，发现并对此6D阵列的最高局部最大值进行排名
。最后 ，通过查看从参考z堆栈和GAD1 RCP图像之间的插值切割之间的覆盖来手动评估每个部分的匹配有效性。手动调整旋转和翻译参数
，以提供两个数据集之间的最佳覆盖层 。发现了粗手册注册的-10°至10°之间的典型旋转角度，使我们能够仅搜索此范围来节省计算时间
。 　　最后 ，使用自定义的MATLAB GUI来策划体内记录中抑制性细胞与体内切片中的抑制细胞之间的匹配。GUI使我们能够可视化每个细胞的体内麦克利图像（从参考Z-stack获得）
，ROI在参考Z-stack上的位置以及参考Z-stack横截面和不同基因的原位基因表达之间的重叠 。对于每个切片，我们显示了距参考Z堆栈中切片的位置不到10 µm的所有MCHERRY阳性ROI。根据这些数据 ，手动策划了体内和体内GAD阳性细胞的每个分配
。在此阶段
，还为匹配的细胞及其邻居手动调整了最初使用DAPI图像的自动分割发现的边界，以纠正DAPI分割中可能影响基因和细胞类型分配的错误。这种校正既基于DAPI图像 ，也基于原位基因表达，该基因提供了可能表明在相邻细胞的DAPI分割中分类不足的信息 。我们采取了一种保守的方法来进行此手动策划过程
，丢弃了所有成像的细胞，而该匹配的体内切片并不是绝对清楚的（约占细胞的50％）
。 　　我们记录了总计3,469（每次疗程204±42）抑制细胞和6,684（每次疗程393±173）兴奋性细胞。在这些抑制细胞中 ，可以良好的信心将1,515个（每次疗程89±31）细胞与离体切片对齐
，因此被分配给了转录组身份（请参阅补充数据1） 。在多个成像会议中记录了一些前体识别的细胞
。在所有图中，每个匹配的单元都选择了一个唯一的会话（除了图2 ，我们在单个会话中显示了所有单元格
，以及在所有会话中使用所有单元格的成对相关性：图3A和5D和扩展数据图6B和8C – E）。根据在本次会话期间运行的鼠标花费的时间百分比选择了分配的会话，以最大程度地记录小区的行为变异性 。去除这些重复物后 ，我们获得了1,090个独特的细胞
。在这些细胞中
，由于其最大后概率小于0.5，因此去除了17个细胞。最后 ，将8个分配给总数少于3个细胞的亚型的细胞被丢弃 。1,065个细胞的最终群体属于35个转录组亚型
。 　　为了层次分析
，将35个亚型分为11种基于先前文献对应于推定的解剖学或生理细胞类型的类型。对于PVALB神经元，分组是明确的：PVALB-VIPR2亚型在遗传上与所有其他PVALB亚型都非常不同 ，并且几项研究已经鉴定出该亚型的分子标记物具有吊灯细胞3,4,7,79 。对于SST细胞，UMAP分析（扩展数据图3）表明
，两个SST-TAC1子类型桥接了两个SST-CALB2亚型（鉴定为浅层层Martinotti细胞7,80,81）和PVALB-TPBG子类型（标识为表面表面层PVALBB篮细胞7）之间的连续体。Patch-seq分析证实，SST-TAC1细胞在L1中的轴突较少 ，并且比经典的Martinotti细胞具有更快的刺激性表型7
。因此
，我们将两种SST-TAC1亚型识别为非Martinotti SST细胞，并承认这两种SST类型可能会瓷砖连续 ，而不是真正是离散的细胞组。对于LAMP5细胞
，我们根据先前的研究结果82,83对亚型进行了分组 。包括lamp5-npy组的三个亚型根据其强烈表达的NPY表达鉴定为神经元细胞
。由于NDNF的表达而非NPY，LAMP5-FAM19A1-TMEM182亚型被鉴定为冠层细胞。由于其强烈表达ChRNA7和NDNF和NPY的弱表达 ，因此将其余两个亚型鉴定为α7细胞 。对于VIP细胞
，我们将亚型除以转录组方法：UMAP分析表明，两个VIP亚型之间具有明显的离散区别 ，这些VIP亚型的特​​征是RELN表达以及VIP本身的较弱表达
。我们不知道对这些VIP-RELN细胞的任何具体研究。但是
，基于它们弱的VIP表达以及Reln通常是L1标记的事实， 我们用先前描述的L1 VIP细胞始终识别这种类型82 。VIP类别中包括SERPINF1亚型 ，因为我们认为这是一个离散的子类，因此我们没有看到强有力的证据
。最后
，根据VIP表达将SNCG亚型分为两种类型，SNCG-VIP和SNCG-PDZRN3分别鉴定为小和大CCK细胞 ，分别为84,85。 　　当在两个条件下比较活动时（例如
，视觉刺激与灰色屏幕；大与小光栅；运行与固定同步）时，我们使用了计算的调制索引 　　其中r是第一个条件下的平均活动（例如 ，在响应时间窗口中）
，而b是第二个条件下的平均活动（例如，在基线时间窗口中） 。 　　为了分析使用细胞深度验证Coppafish亚型调用（图1J） ，我们使用了所有层的细胞
，而不仅仅是L1-L3的体内成像细胞
。我们使用了14个部分，从L1 -L6获得基因表达（全部取自同一小鼠）。DAPI分割均在所有层中手动策划（见上文） ，并使用标准方法在这些部分上进行单元调用 。这提供了约47,000个细胞的皮质深度
，其中2,130个被分配给GABA能亚型。我们通过这些切片（750μM）的最大皮质深度将测得的皮质深度归一化，并计算了每个亚型的中位皮质深度 ，并具有至少4个细胞（发现46个这样的亚型）
。然后，我们为先前的研究7的斑块ze数据做了同样的事情
，该数据给出了42个亚型，具有4个以上的细胞。然后 ，我们比较了两个数据集中至少4个细胞的亚型的皮质深度（总计33个亚型；图1J） 。 　　为了区分自发行为期间的三个主要行为状态
，我们使用了小鼠的运行速度以及皮质振荡的强度
。通过面向空气悬浮的球86的光学传感器来测量跑步速度，并使用2秒移动的平均过滤器平滑。如果这种平滑速度小于0.3 cm s -1 ，我们考虑了鼠标固定的
，否则运行 。为了区分同步和非同步固定状态，我们首先使用PCA计算了兴奋性细胞活性的第一个主成分（PC） ，如先前所述
，该细胞在被动或警报状态下更活跃，如前所述34
。平均该PC上的10％的细胞的活性最为负 ，这提供了在某些固定时期出现的振荡的明确摘要（图2）。根据该平均值明显振荡的周期
，对同步活性的周期进行了分割 。为了测量每个抑制性神经元的振荡耦合，我们随后计算了每个细胞的Z尺寸活性与同步期间这种兴奋性亚群的平均值之间的Pearson相关性
。 　　为了验证我们的细胞类型分配 ，我们将获得后转录组数据获得的结果与使用转基因小鼠线进行的记录进行了比较（扩展数据图5）。我们分析了从参考文献30和4个新小鼠中重新分析了18只转基因小鼠的记录（PVALB为5个，SST为5个
，VIP为5个小鼠）和23个疗程（SST的6个小鼠，SST中的6个小鼠 ，VIP的9个）
，总计为2,589个识别细胞（1,5799999999999个）和572 pvalb和572 pvalb，572 sst ，572 pvalb
，572 pvalb，572 sst 。 　　对于此分析（扩展数据图5） ，我们首先将钙迹线反应到时间t时的每个神经元I（参考文献53）
。我们考虑了每个细胞I和试验N的神经活动的两种度量：从试验开始时间TN到时间TN+∆T的刺激表现过程中的平均神经活性
，以及​​在减去前基线活性后获得的平均神经反应di（n）= ri（n） - bi（n）-bi（n） - bi（n）。时间窗口参数ΔT获取了参考文献中数据的值1 s 。新的转基因数据和事后转录组数据的30和0.5 s，对应于刺激的整个持续时间。然后 ，我们计算给定刺激s和运动条件v的平均活动和响应（v = 0：stastary
，v = 1：运行）：和
。我们通过计算所有试验N（汇总所有不同刺激类型以获得每个细胞获得一个P值）的配对t检验的P值PI来估算每个神经元对视觉刺激的响应性。对于所有随后的分析，我们仅选择p值<0.05的细胞 。通过运行对视觉响应进行调节如下：首先 ，我们计算了所有刺激的平均响应和标准偏差（分别为v = 0和v = 1）
。然后，我们计算了一个调制索引
，如下所示：。然后，对于每个录制会话K ，将此索引归一化
，如下所示 。我们通过运行与皮尔逊相关系数的自发活动和运行速度ρi的平均视觉响应调制（扩展数据）
。在计算Pearson相关系数之前，我们以平均时间为5 s的活动（t）和运行速度V（t）平滑。为了进行此分析 ，我们仅选择了具有比-300μm更浅层的皮质深度的细胞 。 　　为了估计大小调谐曲线（扩展数据图5B）
，我们z得出了每个神经元的活性，如下所示 ，然后在给定类型的细胞上平均
。 　　为了评估具有转基因和转录组细胞类型鉴定的生理特征之间的一致性
，我们训练了一个分类器，可以从转基因线中每个细胞的生理特征预测细胞类型 ，并询问它是否推广到转录组数据（扩展数据图5C）。我们使用1,230个训练细胞（三种单元格类型的每个细胞类型的示例410个示例）训练了分类器 。该预测基于14个特征
，其中包括在不同刺激大小和跑步条件下神经活动的归一化值（功能1-8）；在整个录制会话中计算的钙跟踪的偏度（功能9）；自发活动与运行速度ρi的相关性（功能10）；ROI直径（功能11）；皮质深度（功能12）；以及通过运行调制差异的两种不同的衡量标准：在大小刺激之间；并且，其中（功能13和14）
。我们通过使用z得分的每个神经元的平均偏差和转基因小鼠的平均偏差和标准偏差来归一化的特征 ，而特征1-8已经归一化，如扩展数据所示。我们使用细胞类型：y = {pvalb
，sst，vip}作为训练标签 。使用10种不同的训练和测试转基因数据的随机分裂 ，我们应用了三个不同的线性分类器：线性判别分析；逻辑回归（正则化参数C = 10）;和线性支持矢量分类（正则化参数C = 0.1）。在不同的随机训练集扫描C = {10-3,10-2
，... 102}上，选择了四倍的交叉验证后 ，选择正则化参数
。将分类器应用于转录组数据给出了与测试集转基因数据相同的性能
，表明这两种方法是一致的。 　　使用刺激方向（12个水平）和大小（3个水平）作为对象间因素以及刺激作为对象内因子的存在，使用重复测量ANOVA模型（MATLAB中的FITRM）定义了反应性细胞（激活或抑制） 。如果在进行重复的方差分析（MATLAB中的Ranova）后 ，如果刺激存在显着影响
，则将细胞定义为响应性
。如果响应窗口中的平均活性高于基线，则将显着的细胞分类为激活 ，或者另有抑制。 　　使用交叉验证方法计算方向选择性指数（OSI） 。每个单元的首选方向是通过试验计算得出的
。选择性计算为： 　　其中RPREF是奇数试验对首选方向的平均响应
，而Rortho是对正交方向的奇数试验的平均响应（首选方向 + 90°）。之所以使用这种交叉验证，是因为非交叉验证的选择性指数也可以显示出稀疏神经活动的较大值 ，即使细胞没有张开 。交叉验证的度量可以采用负值，这表明响应不一致
，并且未调节的细胞的期望值为0
。 　　类似地获得了方向选择性指数（DSI）。每个单元的首选方向都是从偶数试验中计算出来的，选择性被计算为： 　　其中RPREF是奇数试验对首选方向的平均响应 ，而RANTI是奇数试验对与首选相反方向的平均响应（RPREF + 180°） 。 　　使用先前研究的方法计算了大小调谐曲线和视觉响应的状态调节（图4D
，E和扩展数据图7C）
。分析仅限于在光栅刺激（<20°）接近接收场位置的细胞。通过平均该类型的所有中心单元的Z尺寸活性（Z得分均相对于整个漂移光栅呈现计算），从而获得了尺寸调谐曲线 。估计基线活性（以对0刺激的响应为响应）估计为在刺激间隔期间Z尺寸活性的平均值。对于刺激响应和基线 ，我们通过在刺激表现过程中采取平均跑步速度来确定小鼠在运行还是静止
。如果此速度超过1 cm s -1
，我们将鼠标视为运行，否则静止。 　　使用所有尺寸的平均值计算所有平均值的跨验证方向调谐曲线（图4B） 。估计单元的首选方向是在试验中提供最大响应的方向
。通过在奇数试验中平均每个细胞的z得分活性 ，相对于此首选方向
，计算了方向调谐曲线。通过除以对首选方向的平均响应（在试验中）的平均响应来标准化曲线 。然后将这些归一化曲线平均在亚型中的所有细胞上平均（图4B）
。交叉验证的使用意味着调整曲线不会在零时自动具有峰值。对于没有感觉调谐的单元，在试验中测得的首选方向与奇数试验响应没有关系 ，因此调整曲线将显得平坦或随机 。 　　为了计算细胞组的平均活性之间的自发相关性（图3A和5D和扩展数据图6b和8c – E）首先通过将每个细胞的反价活性归一化
，通过将其除以其最大值
。对于每个实验，然后我们在灰色屏幕周期内平均每个单元的归一化活性 ，并用1-S盒车窗口平滑，并将采样速率分解为1 Hz。当类型中的细胞数量小于2时
，该实验没有计算相关性 。我们计算了每个组的平均活动与实验平均之间的Pearson相关性
。对于内部类型的相关性，我们将每个组的细胞分为两个半随机分配并应用相同的方法 ，以避免琐碎地获得1的相关性。当类型中的细胞数量小于4时
，该实验的相关性不会计算 。 　　我们总结了一个细胞对自然图像刺激的反应，并用两个数字（图4D和扩展数据图7f ，g）。响应能力被定义为刺激表现期间活动与刺激发作之前的活动之间的调制指数
。信号相关是通过将响应与对1,000张图像的第一次重复的响应与对这些相同图像的第二重复的响应相关联的定义。该度量表征了单元对这些图像刺激的选择性 。 　　为了计算TPC1
，我们为1,065个独特的细胞中的每个细胞中的每一个都使用了72个基因的原位基因表达，这些细胞是在体内成像和转录鉴定的
。我们对此72 x 1,065矩阵执行了PCA ，并以第一个组件的分数获取了每个单元格的TPC1。为了获得斑块序列中单元格的TPC1值（扩展数据图9b）
，使用了相同的权重向量，并通过log（1+x）转换读数 。 　　为了评估转录组PC所解释的方差的比例（扩展数据图8B） ，我们使用了多个线性回归进行了多个线性回归
，并使用剩余的交叉验证来量化每个细胞的状态调制如何通过增加PC的数量来预测
。然后将这种多个线性回归解释所解释的方差的比例进行了比较，通过细胞的亚型 ，类型或子类分配可以解释的差异比例，通过一对一的交叉验证再次评估
，预测了一个单元的状态调制值，作为其在训练集中的亚类 ，类型或子类型的平均调制。 　　我们对先前的SCRNA-SEQ DATASET3进行了UMAP分析
，分别用于尾神经节杰出（CGE）（VIP，SNCG和LAMP5） ，以及内侧神经节杰出性（MGE）（PVALB和SST）衍生的抑制性抑制作用
，仅来自V1（扩展数据 。 　　为此，我们使用了以前已针对CA110描述的方法
。首先 ，使用Prommt聚类算法发现了一组150个基因。然后
，为每个细胞制作了150维表达矢量，将log（2+x）转换为这些基因的SCRNA-SEQ表达水平 。使用MATLAB Toolbox88进行UMAP分析 ，该分析通过按单位圆而以相似性顺序放置在单元圆圈周围来初始化
。 　　The genes automatically selected to perform the UMAP analysis were: Vip, Tac2, Sst, Pdyn, Lamp5, Tac1, Crh, Calb1, Penk, Calb2, Th, Cxcl14, Ndnf, Spp1, Htr3a, Cplx3, Pvalb, Crhbp, Npy, Npy2r, Chodl, Crispld2, Prss23, Nov, Cbln2,Cartpt, Akr1c18, Atp6ap1l, Cadps2, Ppapdc1a (also known as Plpp4), Sncg, Tnfaip8l3, Unc13c, Pdlim3, Scgn, Pcp4, Tcap, Lgals1, Serpine2, Moxd1, Pthlh, Cd34, Cck, Sostdc1, Spon1,Gm39351, Mia, Slc5a7, Pde1a, Adarb2, Mybpc1, Car4, Cbln4, Gabrg1, Fmo1, Slc18a3, Grpr, Lypd6, Pde11a, Rxfp1, Tnnt1, Nxph2, Lpl, Cryab, Cp, Npy1r, Id3, Myl1, Id2, Kit,Serpinf1, Bcar3, Aqp5, Scrg1, Gpd1, Rxfp3, Prox1, Col25a1, Chat, Vwc2l, Amigo2, Myh8, Synpr, Grm8, Igfbp5, Gpx3, Rgs12, Lypd1, Cd24a, Reln, Hapln1, Sln, Chrm2, Ostn, Igfbp7,Prox1os, Atf3, Lect1, Gpc3, Ptprk, Teddm3, Il1rapl2, Col6a1, Nek7, Crispld1, Wif1, Wnt5a, Bmp3, Thrsp, Syt2, Pcdh20, Sfrp2, Myh13, Efemp1, Rprm, Cacna2d1, Lypd6b, Meis2, Lhx6,Angpt1, Rspo1, Sema3c, Itih5, Nfix, Sema3a, Stk32a, Ecel1, Jam2, Igfbp6, Sox6, Nfib, Sall1, Sema5b, Shisa8, Tacr3, Chst7, Frmd7, Gm31465, Rspo4, Chrna2, Lmo1, C1qtnf7, Ndst4,CCDC109B（也称为MCUB）
，NPAS1，EGFR ，S100A10，GPR6
，SLIT2，LSP1。 　　我们通过将它们与先前发表的Patch-Seq DataSet7联系起来 ，研究了结果的电生理和形态学相关性
，该数据播种数据源是来自一组V1抑制细胞的电生理，形态学和基因表达数据 。这些细胞已被遗传分配给我们使用的3个转录组簇 ，这使我们能够将电生理和形态学特性与我们自己的数据集中测得的状态调节相关联。有效的电生理记录可用于4,391个细胞
，其中包括当前注入的长脉冲和短脉冲
。我们使用了由原始作者使用IPFX软件计算的电生理参数，将“上/下比
”重命名（动作电位的向上和向下组件的斜率的绝对比率）为“尖峰形状索引”。适应指数是在长的去极化方形刺激期间峰值变化的速率 。在超极化的平方电流中 ，膜时间常数TAU是稳态的接近速率
，在达到稳态之前，SAG是向下偏转
。计算电容是测量的tau和电阻之间的比率。 　　我们使用斑块序列后获得的形态重建来量化每层轴突的比率 。为了与我们的两光子数据进行比较 ，我们仅检查了L1-3中的somas的重建细胞
，该细胞属于我们从我们记录的35个亚型之一中，总共163个细胞
。形态被表示为无向图 ，其位置和半径与每个节点相关。如果两个节点在层边界内具有皮质深度，则一对相邻节点（一个段）落在层中 。落在层边界上的段（少于每个单元的段的4％）未分为一层
，并且排除了进入白质或PIA的段
。使用节点及其半径之间的距离计算所有内部片段的表面积。层内表面积比是一层中各个段的总表面积的片段表面积的总和 。 　　使用从我们的COPPAFISH数据中发现的相同的72个基因和权重计算每个斑块序列细胞的TPC1，其基因表达转换为log（1+x）
。 　　使用FaceMap（https://github.com/mouseland/facemap）处理眼视频。在鼠标的学生周围手动抽取ROI 。瞳孔区域被定义为高斯拟合面积在阈值的瞳孔框架上 ，其中瞳孔外部的像素设置为零。 　　细胞类型之间差异的统计分析面临两个潜在的混杂
。首先
，不同的实验将偶然地记录每种细胞类型的不同比例，并且也可能会偶然地显示出其他实验到实验的差异 ，例如整体警报水平。其次
，大量亚型提出了潜在的多重比较问题 。 　　为了解决这些问题，我们设计了一个嵌入式置换测试
。首先 ，综合测试询问子类
，类型和亚型是否对我们的兴趣量有显着的主要影响。该综合测试没有多次比较问题，并且在实验中发生了所有改组 ，以避免将实验变化与体验变异性与细胞类型之间的差异混为一谈 。综合测试以嵌套方式在三个级别中的每个级别进行（扩展数据图6a）：第一个询问子类是否存在主要影响；第二次是否存在类型的主要效果
，超出了子类预测
。第三，是否有超出类型预测的主要效应亚型。在综合测试之后 ，使用事后测试来询问每个单个子类中的类型之间是否存在显着差异，以及每个单个类型中亚型之间是否存在显着差异（扩展数据图6a） 。其他事后测试用于询问每个子类
，类型和亚型的数量是否与零有显着不同
。使用Benjamini – Hochberg程序校正所有事后测试以进行多次比较。 　　为了测试子类对数量y的主要影响，综合测试计算每个子类F的平均值 ，并用作测试统计量的跨类别的差异 。为了获得P值
，将此测试统计量与每个实验中每个单元的子类标记的10,000个随机改组后获得的无效集合进行了比较
。为了测试类型的主要效果，我们计算每个类型C的Y平均值 ，并用作测试统计量跨类型的均值。在每个实验和子类中分别通过10,000个类型标签的型号取得了无效分布 。为了测试亚型的主要效应
，我们用作测试统计量，亚型超类型的方差通过在每种类型和实验中分别重新调整亚型标签10,000次后 ，通过重新计算该统计量来获得无效分布。 　　要对特定子类内部类型之间的显着差异进行事后测试（图3B的最右边的p值表示）
，或在特定类型内的亚型之间的显着差异（图3B和类似的恒星在图3B和类似中指示），我们在单个子类和类型中执行了相同的shuffle测试
。例如 ，为了获得PVALB-TAC1类型中亚型显着差异的P值
，我们用作测试统计量这类型内5个亚型的方差，并将其与同一类型中的子类型的10,000个子类型进行比较。然后使用Benjamini-Hochberg程序校正这些事后P值 。为了使子类 ，类型或亚型与零有显着不同的事后测试，我们使用了Benjamini – Hochberg校正的t检验
。 　　对于成对相关性的嵌套置换测试（图3A和扩展数据图6B）
，我们使用了相同的改组程序，使用AS测试统计数据 ，组内相关的平均值与所有实验和细胞组之间的组间相关性与组间相关的平均值之间的差异。 　　嵌套置换测试的所有P值都是一尾 。 　　对于线性相关性（图1J
，3E和6A，B以及扩展数据图6E和9A ，B）
，我们显示了Pearson相关系数的P值
。为了排除将实验变异性与细胞类型之间的差异混为一谈的可能性，我们使用了ANCOVA控制记录会话的离散效果（图3C ，D和5C和扩展数据图8A）
，引用了连续变量的主要效果的重要性。ANCOVA was also used to test whether a continuous transcriptomic variable assigned to each cell correlated significantly with state modulation even after controlling for subtype and recording session (Fig. 3e and Extended Data Fig. 6e) and for subclass and recording session (Fig. 5c), and whether cortical depths of each subtype measured by coppaFISH and Patch-seq were correlated even within a subclass or type (Fig.1J） 。 　　为了测试TPC1对成对相关性的影响（图5D和扩展数据图8C – E），我们按TPC1对类型进行了排序 ，并按照上述计算其成对相关矩阵
。我们使用置换测试来询问接近对角线的值是否大于远离对角线的值。作为测试统计量
，我们使用了距离对角线一两步的平均相关值与所有其他类型对的平均值之间的差异（扩展数据图8F） 。我们通过重新计算此统计量在将类型的统计量重新计算10,000次后通过重新计算该统计数据来构建无效分布
。同样，对于此改组测试 ，P值是一尾。 　　为了显示细胞种群中生理特性的分布，我们使用了盒子图（图3b和4c
，d和扩展数据图6C，D和7A – G） 。在这些图中 ，中央黑色圆圈代表中位数。盒子的左右边缘代表了第25个百分位数和第75个百分位；晶须延伸到最极端的数据点（不包括离群值超过盒子间间距范围的1.5倍
，这些盒子被绘制为小黑点）
。 　　扩展数据中显示的单元格是图1C是记录并用Coppafish处理的1,090个单元的代表性示例。图1b – e中所示的注册示例是我们成功对齐与体内Z堆栈的99个切片（n = 4小鼠）的代表性示例 。扩展数据中显示的九个细胞图4A，B是图2所示的同一疗程中记录的117个分子鉴定的细胞的代表性示例
。所有实验均在四个独立的小鼠上进行 ，并且结果在所有小鼠中可靠地复制。我们没有使用统计方法来预先确定样本量 。但是
，我们的样本量与使用类似方法25,26中出版物中报道的样本量相似
。我们的研究不包含实验组，因此随机化和盲目不适用。 　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然研究报告摘要中获得 。