实验是根据墨尔本大学 ，莫纳什大学和St Vincents Research Institutes动物伦理委员会（10323
，10324，10352 ，10352，10385
，10427，10427 ，21712
，21712，22282 ，22282
，22404，25349 and 28097）进行的。每NHMRC澳大利亚澳大利亚守护和使用动物的守则 ，在温度控制的高屏障设施中
，将小鼠保持在12小时的浅黑暗周期中，并免费获得食物和水 。C57BL/6J小鼠来自澳大利亚动物资源中心 ，而Agrp-Ires-Cre（应变012899）
，DB/DB（应变000697），NPY-GFP（应变006417）（应变006417） ，POMC-GFP（POMC-GFP（应变），劳动来自杰克逊实验室
。为了产生Agrp-ires-cre ;; lsl-Cas9-GFP（AGRP-CAS9）小鼠
，用纯合LSL-Cas9-GFP小鼠育成半合子Agrp-ires-Cre小鼠。除非另有说明，否则所有实验干预措施均在8-10周龄的雄性啮齿动物中进行 。雄性Sprague -Dawley大鼠（澳大利亚动物资源中心）在室温为23±2°C的室温和富集材料中分别容纳 ，房间湿度为40–70％
，在反向12 h的光/黑暗周期（09:00点亮）。为动物提供标准的ChOW（Barastoc，Ridley农业生农剂） ，一种高脂高糖饮食（小鼠：分别来自脂肪和碳水化合物的总能量的43％和20％
，SF04-001，特种饲料 ，老鼠：RATS：RATS：30％的总能量SF17-204的脂肪SF17-204
，高脂肪饲料，或240％的高脂肪饲料（40％） ，或者是高脂肪酸的脂肪及其高脂肪酸含量（fat）
。胆固醇
，SF16-033，专业饲料）。为了诱导小鼠的后期2型糖尿病 ，雄性C57BL/6J小鼠在HFHS饮食中喂食4周，然后在接下来的2周内接受50 mm柠檬酸钠的含酸钠pH 4.5） 。监测血糖水平
，并使用稳定的血糖水平> 15 mm的小鼠进行下游实验
。对于所有实验， 随机分配用于分配单个小鼠向实验组分配 ，并根据先前的工作和现场标准选择样本量。 　　使用组织提取物PCR缓冲液（MDX004
，子午生物科学）从尾部活检中提取DNA，并使用mytaq HS红色混合物（Bio-25048 ，子午生物科学）通过以下引物通过以下引物通过PCR扩增DNA
，以检测CRE（：forthitian groffence crectect）5'-GTGAAACAGCATTGCTGTCACTT-3'），LSL-CAS9（WT向前：5'-AAGGGGCTGCAGTGGAGTGAGTA-3' ，WT反向：5'-MCAGGACGACGCCCACACACACACACACACACACACACACACA-3'
，MT FORFECT：MT Forward：5'-TCCCCCCCATCATCATCAAGCTCCCTCCCCCCCCCCCCCCC-3 ^''5′-CTTCTTCTTTGGGGCCATCT-3′), Npy-GFP (common forward: 5′-TATGTGGACGGGGCAGAAGATCCAGG-3′, wt reverse: 5′-CCCAGCTCACATATTTATCTAGAG-3′, mt reverse: 5′-GGTGCGGTTGCCGTACTGGA-3′), Pomc-GFP (forward5'-AAGTTCATCTGCACCCG-3'，反向5'-TGCTCAGGTAGTGGTGTGTCG-3'）等位基因 。以下引物用于监测小鼠胰岛素受体基因（ΔInsrcrispr）的CRISPR介导的缺失：正向5'-Gagatggtggtccacctgaagga-3' ，反向5'-GTGAAGGTCTTGGTGGCAGAGAAGC-3'
。 　　对于脑部的免疫组织化学
，用肝素化的盐水（10,000单位L -1猪肝素）对小鼠进行了麻醉和灌注，然后是10％中性的中性缓冲福尔马林。将大脑固定16小时 ，并在4°C的30％蔗糖中在PBS中保存三天，以冷冻保护组织
，然后再在干冰上冷冻 。在下丘脑的整个延髓范围内，在冠状平面上切开了30微米的切片（相距120 mm）
。将切片存储在-20°C下的冷冻保护剂（30％乙二醇 ，PBS中的20％甘油）中
，以进行长期存储。为了检测透明质酸和versican，使用柠檬酸酸性缓冲液（10 mm柠檬酸钠 ，0.05％Tween 20
，pH 6.0，pH 6.0）对切片进行热诱导的表位检测 ，持续20分钟 。 　　For detection of aggrecan, GFP, hyaluronic acid, mCherry, versican, tenascin C, HAPLN1, neurocan, phosphacan, brevican, WFA, WFA–FITC, PGP9.5 and AgRP, sections were incubated at room temperature for 1 h in blocking buffer (0.3% Triton X-100, 5% normal goat serum, Gibco, ThermoFisher, 0.02% sodium azide) and then overnight at 4 °C in 1% blocking buffer containing either rabbit anti-aggrecan (1:1,000, AB1031, Millipore), chicken anti-GFP (1:2,000; ab13970, Abcam), biotinylated hyaluronic acid binding protein (1:100, 385911, Millipore), rabbit anti-dsRed（1：2,000
，600-401-379，Rockland） ，兔子反versican（1：1,000
，AB1033，Millipore） ，Tenascin C（1：500，M1-B4
，发育研究杂交瘤银行），HAPLN1 ，HAPLN1（1：500
，9/30/8-a-4，发展型研究）Hybridoma Bank), phosphacan (1:300, 3F8, Developmental Studies Hybridoma Bank), brevican (1:500, 610895, BD Transduction Laboratories), biotinylated WFA (1:2,000, L1516; Sigma-Aldrich), WFA–FITC (1:2,000, FL-1351-2, Vector Laboratories), rabbit antiPGP9.5（1：1,000 ，14730-1-AP
，ProteIntech）或豚鼠抗克拉普（1：500，AS506 ，澳大利亚抗体）
。After washing with PBS-T (0.3% Triton X-100 in PBS + 0.02% sodium azide), sections were incubated with goat anti-chicken–Alexa Fluor 488 (ab150169, Abcam), goat anti-rabbit–Alexa Fluor 488, goat anti-rabbit–Alexa Fluor 595 or goat anti-rabbit–Alexa Fluor647（分别为AB150077
，AB150080或AB150083，ABCAM） ，链霉亲和素 - 埃尔克萨荧光594或链霉亲和素 - 艾尔克萨素荧光647链霉亲和素（405240
，Biolegend，biolegend）在室温下为2 h的5％阻塞罩。将切片用Mowiol 4–88安装介质安装 ，并用Olympus BX61显微镜可视化 。使用Olympus BX61摄像机捕获图像，该摄像头使用Olympus Cellens Dimension软件v2.1获取
，并使用ImageJ软件v1.53 S（NIH）处理。使用Zeiss LSM880 Airyscan快速共聚焦显微镜捕获细胞内在化的图像， 使用Zeiss Zen Software v2.1获取并使用ImageJ V1.53 S（NIH）进行处理
。亮度和对比度已进行了调整以帮助分析和可视化。 　　对于INGWAT ，EWAT
，肝脏和BAT免疫组织化学，在室温下在摇摆平台上立即剖析组织并将其固定在旋转平台上48小时 。将组织嵌入石蜡中 ，并制备5 µm切片100 µm
。对于血久毒素和曙红组织学
，将切片在血久蛋白酶中孵育3分钟，然后在曙红中30 s。为了检测UCP1 ，在95°C下
，将INGWAT切片在柠檬酸酸性缓冲液（10 mM柠檬酸钠，0.05％Tween 20 ，pH 6.0）中进行20分钟 。将切片在室温下在5％阻止缓冲液中孵育1小时
，然后在兔抗UCP1（1：1,000; AB10983，ABCAM）在4°C下过夜 ，在1％阻止缓冲液中
。在PBS-T洗涤后，将切片与山羊抗兔Alexa Fluor 488（AB150077
，ABCAM）在5％阻断缓冲液中在室温下孵育2小时。将切片在DAPI（PBS中的20 ng ml -1）中孵育10分钟，然后用Mowiol 4–88安装介质安装 ，并用Olympus BX61显微镜可视化 。使用Olympus BX61摄像机捕获图像
，该摄像头使用Olympus Cellens Dimension软件v2.1获取，并使用ImageJ软件v1.53 S（NIH）处理
。亮度和对比度已进行了调整以帮助分析和可视化。 　　将小鼠用媒介物（PBS）或胰岛素（3 Mu G -1 ，Actrapid
，Nova Nordisk）注射小鼠，并在15分钟后 ，在10％中性缓冲的福尔马林中
，心情心灌注（如上所述） 。对于P-STAT3信号，将小鼠静脉注射为媒介物（PBS）或瘦素（每只小鼠20μg ，体积为100μl）
，并在30分钟后用10％中性缓冲福尔马林（Bufferered Hormorin）在30分钟后灌注
。将大脑在室温下在摇摆平台上固定16小时，然后在PBS中的30％蔗糖中保留两天 ，以冷冻保护组织，然后在干冰上冷冻。在下丘脑的整个延髓范围内
，将30 µm切片切成30 µm的切片 。将切片在新鲜制备的1％NaOH中预处理20分钟，在PBS中1％H2O2 ，在PBS中洗涤
，在0.3％甘氨酸中孵育10分钟，用PBS洗涤 ，并在0.03％SDS中孵育10分钟。然后将切片在室温下在5％阻止缓冲液中阻塞1小时
，并与兔抗P-AKT（SER473）（1：300; 4060，细胞信号技术） ，兔抗P-STAT3（Tyr705）（Tyr705）（1：500
，数字9131s，Cell Signaling Technology） ，或Cabbit Anti Anti Fluorer孵化48小时
。然后将切片在5％阻止缓冲液中孵育
，其中含有山羊抗兔Alexa Fluor 647（AB150083，ABCAM） ，山羊抗兔Alexa Fluor 594（AB150080，ABCAM）或生物素基化的山羊抗rabbit（BA-1000
，ba-1000，vector bufferatories ，sodium in No sodium
，sodeium in No sodeium，sodium notious。用Mowiol 4–88安装介质安装荧光切片 ，并使用Olympus BX61显微镜进行可视化 。使用Olympus BX61摄像机捕获图像
，该摄像头使用Olympus Cellens Dimension软件v2.1获取，并使用ImageJ软件v1.53 S（NIH）处理
。For chromogenic detection, p-AKT signal was amplified using Vectastain ABC-HRP Kit (1;500, PK-4000, Vector Laboratories) and visualized using 0.1% H2O2 DAB solution (3,30-diaminobenzidine, ICN980681, Thermo Fisher) Peroxidase Substrate Kits (Vector Laboratories)。使用Leica DMC6200摄像头和Leica Application Suite X软件 ，使用Leica DM2000 LED明亮场显微镜可视化P-STAT3和P-AKT免疫阳性细胞 。亮度和对比度已进行了调整以帮助分析和可视化
。 　　在整个Rostro-caudal弧中对ARC PNN进行了立体学评估。将弧分为三个区域
，包括rostral弧（-1.22/-1.58 mm前骨），内侧弧（-1.58/-1.94 mm前孔）和尾弧（-1.94/-1.94/−2.18 mm anc） 。在VMH和RSG皮层（-1.58/-1.94毫米前后）中定量PNN
。 　　所有图像定量均在ImageJ V1.53 S（NIH）中进行。原始图像使用滚动球算法进行背景减法 ，以最大程度地减少背景和任何潜在的自动荧光差异 。为了量化每个大脑区域内PNN的面积和强度（ARC
，VMH或RSG皮层）图像的图像被阈值并进行了二进制，以创建仅PNN的感兴趣区域（ROI）掩码
。对于每个大脑区域 ，PNN ROI面积（µm2）和强度。该过程是自动化的，以最大程度地减少偏差并考虑到多个图像的脑核大小的差异 。根据Paxinos和Franklin小鼠脑图集（http://labs.gaidi.ca/mouse-brain-brain--atlas/）定义脑核。将每个区域内的PNN的面积和强度标准化为相应的对照
。 　　为了确定PNN内ECM成分（透明质酸
，Hapln1，Tenascin C ，Aggrecan
，Aggrecan，Versican ，Persican
，Phosphacan，Brevican ，Neurocan）的共定位（WFA阳性染色）（WFA阳性阳性染色）
，根据图像产生了2个面膜：一个用于构成pnn的PNN和另一个pnn的PNN和另一个面具。计算总PNN结构的整体面积和强度 。通过仅量化总PNN蒙版内的表达式来确定PNN内部成分的面积和强度
。这允许在ARC PNN中特异性表达的ECM组件的表征。将每个区域内的PNN的面积和强度标准化为相应的对照 。为了确定ARC PNN组件中WFA标记的电弧PNN的共定位，每个图像生成了两个掩码：一个用于总PNN染色 ，另一个用于弧内的组件染色
。计算总组件结构的整体面积和强度。通过仅量化总组分掩模中的WFA表达来确定包含组件的PNN的面积和强度 。将每个区域内的PNN的面积和强度标准化为相应的对照
。这种组合方法进一步表征了组件对PNN区域的特异性。亮度和对比度已进行了调整以帮助分析和可视化 。 　　为了确定代谢性疾病发展过程中PNN中哪些代谢相关的ARC神经元
，我们分析了从0、4和12周HFHS喂养的NPY-GFP（可视化AGRP/NPY神经元）和POMC-GFP（可视化POMC神经元）小鼠的大脑
。如“免疫组织化学 ”中所述，对GFP和WFA进行了弧形部分 ，并使用ImageJ V1.53 S（NIH）软件进行了分析。为了确定PNN中包含的GFP阳性神经元的数量，我们产生了两个掩模 。为了定义电弧中的PNN结构
，对图像进行了阈值并二进制以创建PNN掩码。为了识别单个GFP阳性神经元，对图像进行了阈值并进行了二进制以创建GFP掩模
。为了定义单个GFP神经元 ，使用流域分离算法对GFP面膜进行了分割。GFP阳性细胞的总数在整个ARC区域内和PNN面膜内计数 。这量化了由PNN围绕电弧所包含的GFP细胞的百分比
。 　　为了确定特异性围绕ARC中各个GFP细胞的PNN的强度
，将GFP图像阈值和二进制。使用ImageJ V1.53 S软件中的扩张，距离图和Voronoi过程 ，在每个GFP细胞周围生成了1.29 µM的ROI（皮质神经元周围的ECM的平均大小） 。这产生了能够特异性分析与单个GFP细胞接触的PNN的掩模
。使用此面具
，确定了存在弧PNN内GFP细胞周围的PNN染色强度。 　　将小鼠禁食过夜，并在透明的笼子中单独安装 ，并随意进入水 。光周期开始后的两个小时（09:00）将预先提高的食物提交给小鼠
，并且小鼠不受干扰并谨慎观察90分钟
。在90分钟的观察结果中，每30秒钟对瞬时行为进行评分。根据以下分类记录每个30 s间隔的行为：喂食（料斗的动物试图获得食物 ，咀嚼或gnawawing）
，饮酒（动物在水喷嘴上舔），修饰（动物刮擦 ，咬人或舔取其解剖学的任何部分），在其解剖学的任何一部分）
，在动物curling之以鼻，包括动物的动物 ，包括活跃的活动
，包括活动，包括活跃的活动）（在意识时动物不动或疾病行为的迹象） 。将数据整理成5分钟的垃圾箱 ，并评估了几个变量
，包括小鼠花费在每种记录的行为（总行为的百分比），食物摄入量的百分比 ，从饮食到休息时间到饱腹感的平均时间（饮食行为频率与静止行为频率相交的时间）
。 　　所有立体定位注射均在异氟烷麻醉下使用超精确的立体定位仪（963 KOPF）或超精确的旋转立体仪器（69100
，RWD Life Sciences）以及立体纳米注射器（788130，KDSCOCICIFICIC）（HAIMIROSIFIFICIC）（HAMIROSYRTOIFIC）（HAIMIROSYRITIFIC）（788130 ，kd scientific）（Hamilosyrton）。To induce hypothalamic inflammation, mice were bilaterally injected with a 1:1:1 cocktail containing AAVs expressing GFP (AAV-CMV-eGFP, Addgene) and ligands for TNF (AA​​V-CMV-TNF) and TGFβ (AAV-CMV-TGFβ) or control AAV alone (AAV-CMV-eGFP, Addgene).To inhibit hypothalamic inflammation mice received bilateral injections of a 1:1:1:1 AAV cocktail containing expressing soluble TNF Receptor Superfamily 1 A (AAV-CMV-sTNFR1A), soluble TGFβR2 (AAV-TRE-sTGFβR2 and AAV-CMV-TetOFF) and AAV-CMV-eGFP vector, or control AAV alone（AAV-CMV-EGFP
，addgene） 。我们在〜1012 GU ML -1处传递的所有炎症AAV。为了拆卸电弧内的PNN，小鼠接受了双侧（除非另有说明）给活性CHABC（C3667 ，Sigma;溶解在1 M trehalose中）或热灭活的CHABC蛋白作为媒介物（1 M trehalose48中的CHABC）的855°C的总计，以15 m的chabc蛋白（溶解在1 m的心形核糖）中
，以45°cys chabc（CHABC）作为载体（CHABC），以45°的整合（CHABC）作为媒介物（CHABC） ，接受了双侧（除非另有说明）给药
。每侧150 nl。为了在ARC或RSG内脉冲PNN
，小鼠接受了双侧（除非另有说明）给予生物素化的WFA（每侧0.3 µg，体积为150 nl） 。为了破坏AGRP神经元中的胰岛素受体 ，在静脉内注射了12周的HFHS HFHS喂养的AGRP-CAS9小鼠
，并用表达U6驱动的指南RNA的靶向INSR基因或cprambleed序列（5'GTGTGTGTGTAGTTCGACCATTCGTCGTCGTG-3'）的AAV矢量和AACDRAND的AAV向量
。Unless otherwise stated injections were delivered bilaterally into the ARC (coordinates, bregma: anterior–posterior, −1.70 mm; dorsal–ventral, −5.85 mm; lateral, ±0.18 mm, 200 nl per side) or into the RSG (coordinates, bregma: anterior–posterior, −1.70 mm;背腹，-1.00毫米； 横向 ，±0.20 mm
，每侧200 nl）。将WFA – Biotin单方面注射到CC（坐标，Bregma：前后 ，-1.70 mm；腹侧 - 腹侧
，-1.50 mm；横向，±0.20 mm ，每侧200 nl） 。 　　对于高胰岛素血糖夹，在异氟烷下将小鼠麻醉
，右颈静脉被导管以进行输注，如前所述4
。导管附着在植入式按钮上（BMSW25 ，RWD Life Sciences）。将植入物按钮盖住
，以使小鼠的小鼠搅拌，并通过每天用40 µL肝素盐水冲洗来保留专利 。在实验当天 ，在07:00取出食物
。3.5 h禁食后
，对[3-3H]葡萄糖（Net331A001MC，PerkinElmer）进行了启动（1分钟 ，1.25μcimin-1）连续输注（0.05μcimin-1）
，以测量全身葡萄糖更换，如所述。90分钟后 ，小鼠在10分钟内接受了40 mu kg -1胰岛素推注
，然后进行连续的胰岛素输注（4 mu kg -1 kg -1 min -1在胶质素中） 。通过30％葡萄糖溶液的可变输注来维持尤格糖症（〜8–10 mM血糖）
。 　　如上所述，在稳态条件下收集尾血样品（外观速率（RA）=消失速率（RD）） ，在80 、90
、100、100 、110和120分钟时以确定RD和RA，如上所述。在120分钟时
，将13μCI的注入[14C] -2-脱氧 - 葡萄糖（NEC495A250UC，Perkinelmer）中 ，将其注入颈静脉中
，并在122、125
、125、135 、145和155分钟以122
、125、125 、135
、145和155分钟进行采样 。在实验组织结束时，提取了葡萄糖摄取的测定。 　　将HFHS喂养的C57BL/6J小鼠双侧注射载体或CHABC
。确定了24小时的食物摄入量对ARC内CHABC治疗的小鼠 ，并配对了经过的载体内治疗的载体治疗的小鼠队列
，从而将食物的可用性仅限于经过ARC ARC CHABC治疗的小鼠消耗的平均食物。 　　在墨尔本小鼠代谢表型平台（澳大利亚墨尔本大学）中进行了代谢测量 。Glucose tolerance tests were performed on 6 h fasted conscious mice respectively by injecting -glucose (2 mg per g of lean body mass and 1 mg per g lean mass for db/db and HFHS + streptozotocin mice) into the peritoneal cavity and measuring glucose in tail blood immediately before and at 0, 15, 30, 45, 60, 90 and 120 min after injection using an Accu-Check根管仪（Roche）
。确定葡萄糖偏移曲线下的区域并表示为mm×min。使用大鼠/小鼠胰岛素ELISA（EZRMI-13K，Merck Millipore）或Accu-Check-Check-Check Glucutemens确定禁食（快速）血浆胰岛素或葡萄糖水平 。使用方程[（葡萄糖×胰岛素）/405]计算HOMA-IR
。使用Opus 7.0光谱软件（Bruker Optics）使用TD-NMR Minispec测量肥胖。 　　将小鼠适应24小时 ，然后在环境控制的Promethion代谢筛查系统（Sable Systems International）中进行监测48小时
，该系统配备了间接开路量热量，食品消耗和活动监测器以测量活动 ，热量摄入和能量消耗 。使用Metascreen v2.3.15.13和宏解释器V23.6.0（Sable Systems International）记录和提取数据
。计算呼吸商的计算为CO2产量与O2消耗呼吸道交换比和能量消耗的比率
，并使用堰等式（能量消耗（KCAL H -1）= 60×（0.003941×vo2+0.001106×VCO2）使用体外质量/组合式的群体差异来计算，并考虑了使用体外群的差异 ，并计算了使用体外群的差异。表型中心（MMPC）能量消耗分析页面（https://www.mmpc.org/shared/regression.aspx） 。 　　为了提供INGWAT和BAT热发生的索引，使用红外热成像来测量腹股沟和Xap膜间区域的温度变化
，如前所述50
。将Flir T1010热成像摄像头（澳大利亚Flir Systems）安装到三脚架上，并将动物定位在与摄像机70厘米的标准化距离处。将动物麻醉 ，在感兴趣的区域剃光
，并在俯卧和仰卧的位置收集全身图像 。使用Flir Researchit Max 4程序（FLIR系统）分析温度。确定了INGWAT和BAT内的峰值温度
。 　　生成AAV-GSCRAMBLED（PAAV-U6> MSCRAMBLE-GTGTAGTCGACCATTCGTG）-CAG> LL：REV（MCHERRY）：REV（LL）：WPRE）和AAV-GIR（paav [-u6> minsr [grna-tatcgactggtcccgtatcc] -u6> minsr [grna-gtctgtccaggcacccgccgccaa] -cag> ll：ll：rev（mcherry）：rev（mcherry）：rev（ll）：wpre）病毒载体，首先是使用在线设计的cisgr vectors（sgrnas）。http://chopchop.cbu.uib.no/） 。考虑使用非特征（https://cm.jefferson.edu/off-spotter/）在计算机中评估潜在的非目标GRNA结合 ，并考虑了表现出与非特异性基因组区域不匹配的指南
。For AAV-gScrambled a pUp-U6>Scrambled gRNA vector was generated using the Gibson assembly of a pDONR P4-P1R backbone and primers 5′-GGGGACAACTTTGTATAGAAAAGTTGGAGGGCCTATTTCCCATGATTC-3′ and5'-GGGGGACTGCTTTTTTTTTGTACAAACTTGAAAAAAAAAGCCCCGACTCGGTGCC-3'。对于aav-gir a pup-u6> minsr [grna-tatcgactggtcccgtatcc] -u6> minsr [grna-gtctgtccaggcaccgccaa grna vector是使用gibson组装的aari aari pup-u6-aarri-aarari-staffer-aari-aariari backboone and backe grna生成的5'-attcttgtggaaaggacgaaaccgtatcgatcgtcgtcccgtatccg-3'和5'-aacttgctttgctatttctagctaaaaacttggcggtgcggtgcctggacagac-3' 。对于AAV-GSCRAMBLED和AAV-GIR
，将P-UP向量与Pdown-Cag和Ptail-Ll一起克隆：Rev（MCHERRY）：REV（LL），使用Gateway方法通过LR反应生成最终向量
。AAV质粒用于生成包装到滴定> 2×1013 gc ml-1的AAV-DJ/8假型中的重组病毒载体。所有向量克隆和AAV包装均由VectorBuilder（伊利诺伊州芝加哥）进行 。表达炎症因子TNF（AAV-CMV-TNF）和TGFβ（AAV-CMV-TGFβ）或可溶性TNF受体超级家族1A（AAV-CMV-STNFRA1）或TGFβ受体2（AAV-CMV-StNFRA1）或TGFβ受体2（AAV-StGFβR2和AAV-STGFβR2和AAV-CMMV-wAWAWADEAFF WASTEFF WASTEOFF）的重组AAV载体（AAV-CMV-TNF）和TNF受体超家族1A（AAV-CMV-STNFRA1）（AAV-CMV-STNFRA1）（AAV-STGFβR2和AAV-CMV）wAWSH-WASTOFF WASTOFF wAWAWAWADEADES ，简而言 携带AAV表达质粒中AV2末端重复侧面的相关基因表达盒的cDNA构造用PDGM6包装质粒转染到HEK293T细胞中（Sigma； Sigma；通过Sigma认证
，通过Sigma认证，未通过磷酸磷酸化方法进行降压剂 ，并未测试过降膜污染物）
。转染后72小时
，收集培养基和细胞通过肝素亲和力柱（HITRAP，GE Healthcare）色谱法和隔夜的超速离心 ，然后在无菌生理铃声的溶液中重新悬浮，并通过基于定量PCR的溶液（Applied Biosystems）在无菌生理铃声中确定
，如前所述52。将纯化的载体冷冻存储至使用当天，此时它们在室温下迅速解冻 ，并在无菌PBS中稀释
，如本文所述，通过立体定位注射给药 。 　　12周的HFHS喂养的C57BL/6J或年龄匹配的Chow-fed对照对车辆或CHABC进行了双边注射 ，进入了ARC
。注射后3天（在看到体重差异之前）
，将小鼠禁食6小时。为了评估胰岛素渗出到电弧小鼠中的外渗（胰岛素– FITC（每只小鼠50 µg 100 µl的每只小鼠，静脉注射 ，I3661
，Sigma，Sigma）或FITC（每只小鼠64.3 µmol ，每只小鼠64.3 µmol
，体积100 µl，静脉注射 ，静脉注射，F3651
，SIGMA） 。为了评估瘦素渗出到弧中，给小鼠施用瘦素-647（每只小鼠的20μg ，体积为100μl）。注射后30分钟
，将小鼠灌注（如上所述）
。为了评估胰岛素的外渗，无论BBB不论BBB ，都将胰岛素– FITC（每只小鼠1 µg的体积为2 µL）直接施用到侧心室中。To do this, mice were anaesthetized and stereotaxically injected (as described above) insulin–FITC at a rate of 200 nl min−1 into the lateral ventricles (coordinates, bregma: anterior–posterior, −0.20 mm; dorsal–ventral, −2.4 mm; lateral, +0.10 mm).从注射开始时将小鼠灌注20分钟（如上所述） 。为了评估胰岛素– FITC的大脑
，将固定后固定过夜，并在PBS中的30％蔗糖中冷冻保护
。为了保留自发的荧光信号 ，将大脑和切片保持在黑暗中
，并在切片后立即安装和成像。 　　在异氟烷麻醉下12周HFHS喂养的C57BL/6J或AGRP-CAS9小鼠在右侧心室（0.2 mm后部，1.0毫米 ，距Bregma的1.0 mm）施加了静脉内静脉内植入 。导向套管位于注射部位上方1.3毫米处（位于头骨表面1毫米）
。用AAV-GSCRAMBLED或AAV-GIR处理AGRP-Cas9小鼠
，并在AAV给药后7天接受了指导套管放置。在2 µL的体积中施用小鼠，室内室内媒介物（DDH2O） ，氟胺（每天100 µg每天100 µg或每天250 µg），所有化合物在熄灯前约1小时（19:00）递送约1小时（19:00） 。 　　有意识的小鼠通过刮擦和平行于地板的倒下
，下巴与颈部的近180度角平行
。使用10 µL尖端，将移液器装有5 µL的媒介物（DDH2O）或荧光胺（每只小鼠1毫克20 µL或20 µL中的小鼠5 mg）。将填充的移液器的尖端以45度角放置在左鼻孔附近 ，并弹出该药物以形成一个小的5 µL液滴
，以使小鼠吸入 。小鼠吸入第一个液滴后，弹出剩余的溶液立即形成另一个小液滴 ，使小鼠通过同一鼻孔吸入
。在右鼻孔重复该过程之前
，将小鼠保持在该位置15 s。将小鼠返回笼子2分钟，然后重复该过程 ，以使每只鼠标收到四个液滴
，每只5 µL，总共提供20 µL溶液 。所有药物均在熄灯之前大约1小时（19:00）送达。 　　为了确定ARC ，RSG或CC中的PNN周转率
，如“ Stereotagic手术
”中所述，小鼠接受了对WFA -Biotin的立体定位注射
。在实验终点处 ，经心脏灌注小鼠，并通过对“免疫组织化学的免疫组织化学”中所述的WFA -BIOTIN（PNN）和WFA -FITC（脉冲时）和WFA – FITC（脉冲时）和WFA -FITC（PNN）和WFA -FITC（PNN）的免疫荧光检测来评估。 　　为了追逐弧中的脉冲WFA -Biotin
，使用ImageJ V1.53 S（NIH）软件对切片进行成像并分析 。原始图像使用滚球算法进行背景减法，以最大程度地减少背景和组织自动荧光
。为了量化电弧内的染色区域 ，对图像进行了阈值并进行了二进制
，以创建用于WFA – Biotin和WFA -FITC的ROI面膜。对于每个图像，计算染色ROI区域（µm2）和强度 。 　　为了验证PNN跟踪器技术 ，将C57BL/6J小鼠立体定向与WFA单方面注射（每侧0.3 µg
，体积为150 nl），以将PNN脉冲到电弧的一侧 ，并注入了另一侧
。一天后
，小鼠经心发灌注，对弧脑切片进行染色并分析以进行PNN跟踪器分析。为了确定脉冲WFA – Biotin代表当前PNN的忠实忠诚度 ，我们量化了WFA-Biotin（脉冲标记）与WFA – FITC共定位的百分比（总PNN） 。 　　为了验证追踪的WFA – Biotin信号代表真正的PNN染色
，我们立体定位注射的WFA（每侧0.3 µg，体积为150 nl的0.3 µg）双侧进入8周大的C57BL/6J小鼠的弧
。3天后 ，小鼠对CHABC的单侧注射（每侧15 MU为150 nL）或媒介物拆卸WFA -Biotin结合的PNN。为了确定脉冲WFA – Biotin的特异性，我们量化并比较了CHABC中WFA - 生物素染色的面积和强度和强度 。 　　为了确定瘦小和肥胖小鼠的PNN周转
，我们对定位注射了WFA-Biotin（每侧0.3 µg，体积为150 nl） ，将双侧分配到12周的HFHS-FHS-FHS-FHS-FHS-FED C57BL/6J小鼠或老年匹配的控制器中
。注射后1、3 、5和10周
，在手术后的第二天或在手术后的第二天提取大脑。将脑部切片染色以存在WFA -BIOTIN和WFA -FITC，并如上所述量化了WFA -Biotin染色面积 。为了确定PNN周转率 ，我们比较了实验（第0天）中存在的WFA标记的PNN与在第1
、3、5和10周保持的PNN。使用相同的过程来评估CC的RSG和血管中的营业额
。 　　在提取缓冲液中孵育微分解的电弧组织
，其中含有8 m尿素，0.5％Triton X-100 、5 mM Tris 2-羧乙基膦和完整的无MINI ETDA无eTDA蛋白酶抑制剂鸡尾酒（Merck） ，持续30分钟
，持续30分钟，温和混合并随后均匀化。将样品在5,000 rpm处离心30分钟 ，并收集上清液
，并使用Amicon UltraCell-10k-10k MWCO离心管交换缓冲液 。使用Bradford分析估算每个样品的蛋白质浓度
。使用5 mM二硫苏糖醇在50°C下降低30分钟的每种蛋白质提取物30分钟，并在室温下用10 mM碘乙酰胺烷基化一个小时 ，然后在0.45μMPVDF膜上（Millipore，IPVH20200）斑点上
，并干燥。将每个样品斑点转移到96孔板中，并使用水中的1％（v/v）聚乙烯基吡咯烷酮溶液阻止 。 　　二糖分析程序从53改编 ，并进行以下修改
。使用含5 Mu CHABC（Sigma
，Cat＃C3667）的酶混合物从PVDF样品斑中释放出GAG二糖，每人50 ng肝素I/II/II/III（R＆D Systems）在100 mM乙酸铵pH 7中 ，在5 mmmmmmmonmmonmonmonmonmonmonmonmonmonmonement pH 7中
，在5 mmmmmmmmmmonmonmony ph 7中，在30°C and Cypecium colcium colcium calcium colcium cycium cycium cycium cypium in 30°C。An additional mixture of purified GAG polysaccharides containing 1 μg each of bovine kidney heparan sulfate (Sigma-Aldrich, H7640), 10 μg shark chondroitin sulfate (Signma-Aldrich, C4382) and 1 μg of Streptococcus equi hyaluronic acid (Sigma-Aldrich, 53747) were digested alongside样品作为酶反应对照 ，并作为保留时间标准 。根据市售方案（Ludger lt-kab-vp24-guide-v2.0）
，收集并在低压下收集了消化的二糖，并在低压下干燥以进行标记
。将样品与8个常见HS（Iduron ，HS混合物）和8种常见的硫酸软件二糖（Iduron
，软骨素硫酸软骨）的标准混合物一起用2-AB标记，并用两次八AB洗涤两次以去除多余的标记剂。将水层中的清洁样品干燥 ，并将其重悬于75％（v/v）乙腈中，乙酸铵
，pH 6.8 。 　　使用序列的Zic-hilic柱（200Å孔径，3.5 µm粒径 ，1 mm×150 mm）在35°C下
，使用Agilent 1260 Infinity II使用荧光检测，将标记的二糖通过液相色谱分离
。流动相位溶剂A（10 mM NH4AC ，pH 6.8）和溶剂B（10 mm NH4AC pH 6.8中的90％乙腈在10 mm NH4AC pH 6.8中）以60μlmin -1的恒定流速在微流模式下以梯度参数为单位：0-3 min
，100％B;4-14分钟，94％B;34分钟 ，86％b;47分钟
，75％b;51分钟，60％b;52–57分钟 ，60％b;58–65分钟
，100％B。分别设置为320 nm和420 nm的激发和发射波长进行荧光检测 。使用标准面板和多糖消化控制识别峰，作为保留时间标准 ，并按峰面积手动量化丰度。 　　将NPY-GFP雄性小鼠放在HFHS饮食上12周，然后在电生理表征前3天在ARC中注射载体或CHABC
。Mice were anaesthetized with isoflurane prior to brain extraction, and brains were incubated in ice-cold artificial cerebrospinal fluid (aCSF) of the following composition: 127 mM NaCl, 1.2 mM KH2PO4, 1.9 mM KCl, 26 mM NaHCO3, 3 mM D-glucose, 7 mM mannitol, 2.4 mM CaCl2, 1.3 mMMGCL2（饱和95％O2和5％CO2
，pH 7.4）。使用纤维状组（Leica VTS1000S）切割冠状切片（250μm） 。将切片在34°C下加热30分钟，然后在记录之前冷却至室温
。将切片放在录音室中 ，并连续用室温ACSF灌注。 　　使用红外视频显微镜（AxioCam MRM
，Zeiss）和直立显微镜（BX51WI，Olympus） ，使用荧光和差异干扰对比度可视化弧中的NPY-GFP神经元 。对于当前的夹具记录
，使用水平拔出器（Sutter Instruments）从薄壁的硼硅酸盐玻璃（Sutter Instruments，BF150-86-10）中拉出贴片管（8-11MΩ）Na-GTP和10 mM Biocytin（300 MOSM和pH 7.3 ，渗透压和pH值相应地调节）
。In voltage-clamp recordings to examine K+ currents, patch pipettes (3–6 MΩ) were filled with intracellular solution containing 130 mM potassium gluconate, 6 mM NaCl, 4 mM NaOH, 11 mM EGTA, 1 mM CaCl2, 10 mM HEPES, 1 mM MgCl2, 2 mM Na-ATP, 0.2 mM Na-GTP, 0.1% biocytin（295 MOSM和pH 7.3
，相应地用蔗糖和KOH调整渗透压和pH）。分析中未包括均为20MΩ的串联电阻的细胞 。记录在四毒素的存在下进行，其中11个去极化脉冲从-40至+60 mV施加500 ms ，以10 mV的增量从-80 mV施加10 mV
。50 ms的预硫次至0 mV用于使任何残余电压依赖性Na+电流失活。使用双IPA集成的补丁放大器（用SutterPatch软件（Sutter Instruments）控制的所有当前夹具数据以5 kHz过滤的所有当前夹具数据）进行全细胞记录 。使用SutterPatch（Sutter Instruments）和Clampfit 10.7（Axon Instruments）分析数据
。 　　在液氮中微调中甲状腺下丘脑并在液氮中冷冻。将组织在100μl冰冷的RIPA裂解缓冲液（AB156034
，ABCAM，英国 ，含有phostop磷酸酶抑制剂，每10毫升的1片； Roche Phoss-RO）中机械匀浆
，并通过偏心阐明（在4°C时为13,000 rpm） 。如前所述（PMID：31509751），通过SDS -PAGE解决组织裂解物。所使用的抗体是兔磷酸-RIR（Tyr1162 ，Tyr1163）多克隆抗体（1：1,000
、44-804 G
，Invitrogen，MA） ，兔单克隆抗IR（1：1,000、3025x
，细胞信号传导），Rabbit-β-actin actin toldib antib抗体grodib grody（1：1：1：1：2,000 ，4967）单克隆抗体（1：5,000
，60004-1-Ig，proteIntech） ，小鼠单克隆抗细胞管蛋白（1：2,000
，T5168，Sigma）
。 　　使用TRIZOL试剂（Invitrogen）和总RNA质量和数量提取RNA ，使用纳米体3300 v2.8.1（Thermo Scientific）确定。使用高容量性cDNA逆转录试剂盒（Applied Biosystems）对mRNA进行反转录，并使用SYBR Green PCR Master Mix（4309155
，Applied Biosystems）处理定量实时PCR 。以下引物用于SYBR绿色表达测定：ADAMST4（forward-gaacggtggtggcaagtattgtgaggg，reverse-ttcggtggtggtggtgtgtgtgtgtgtaggcagcaca） ，adamst5（forward-ctgccttccttcaaggcaaaggaaatgtgtggtggtggtggca）(forward-GCAGACTGACATTGTGGACCTG, reverse-ATCTCCTGGCTGTCACCTTCTG), Il6 (forward-GGTGCCCTGCCAGTATTCTC, reverse-GGCTCCCAACACAGGATGA), Kcna4 (forward-GCAGATTGCTGAATGACACCTCG, reverse-GGACAAGCAAAGCATCGAACCAC), Kcnb1（前向gaggagttcgacaacgtgct
，反向tgagtgacaggggaggaggcaatgga），kcnb2（forward-gctgggagaaacctaactcgtcc ，反向ctcgtttttttttttcttgcagctctg）
，kcnc3反向tGGCTTTGTCTTCTCTCGAC），KCNC4（forward-ccagctcgaatcgcccccatttac ，reverse-agcaccgcatagcatcatcgccat）
，kcnd2（forward-cctacatgcatgcagagagcggaa（forward-agaagaggagcagatgggcaag，reverse-cttgatggtggggtcgtcgtacag） ，kcnj11（forward-tgcgtcgtcagcaagcatccactcctcct
，recterse-cagggtcctgtcaccaccatgc），frocker反向CCCAAAGCACTTCGTCTCTGT） ，KCNJ6（forward-ggaactggagattgtggtgtcatcc，recterse-tctccagcgttaggacagggtg）
，kcnj9（forward tctcactctctctcgtcagcca(forward-CCTGAAGGACTTTCTGCACAAGG, reverse-ACTCCACCTGAGTGAAATGCCG), Kcnn3 (forward-TCCACCGTCATCCTGCTTGGTT, reverse-CAGGCTGATGTAGAGGATACGC), Kcnq3 (forward-AAGCCTACGCTTTCTGGCAGAG,逆向ACAGCTCGGATGGCAGCCTTA），MMP13（forward-agcagttccaaaggctacaact ，reverse-ggatgcttggggggggggggggggtctc）
，mmp14（forward-agcactgtgttttgacgaa）（前向GTCGCCCCTAAAACAGACAA，反向GGGTCTCGATGGTGTTCTGGT） ，MMP9（forward-gctgctgactacgataaggacggca
， 反向tagtggtgcaggcagagtagga），nfkb1（forward-gctgccaaagaaggacacgacgaca ，recterse-ggcaggctattgctcatcacag）
，rn18s，forward-cagctccccccccccccaagcgttcctgg（前向Aagggttcagcctacctt ，反向gtcggGactgctgctggtggtgt）
，stnfr1α（forward-ggttattatcttgctaggtctttg，reverse-gatccctacctacaaatgatggg）（forward-ctaatgttgttgcctcctcctacag ，反向gcacagaagtagcattgtaccc），tgfbr1（forward-ggaccattgtgtgtgtgtgtgtgtgtgttacaagaaagc）
，反向catggcggtaacatcagtctga），tgfbr2（forward-tccctagtgaaagtgaaagaagaagaagaagaagaagaagaagaagccgcccccccccc ，c
，cc​​tttgaagccc， ，反向taccagccatggagtagacat）
，timp1（forward-tcttggttcctggcggtactct，反向GTGAGTGTCACTCTCTCCAGTTGC） ，timp3（forward-gctagaagtcaacaaaataccag反向GGTCACTGTCCCAGCATCTT）
。 　　将基因表达归一化为RN18
，并使用ΔΔCT方法实现了相对定量。使用Bio-Rad CFX 384触摸（Bio-Rad）进行反应 。 　　为了确定胰岛素与PNN成分在体外的相互作用，首先将平底96孔板与10μgml-1聚赖氨酸涂层过夜 ，然后用水冲洗
。纯化的CSPG混合物
，其中含有神经胶质，磷酸 ，versican和Aggrecan（CC117，Merk Millipore）
，纯化的Aggrecan（A1960，Merk Millipore）或纯化的C4S（S9004 ，S9004
，S9004，卖出化学物质） ，在96韦尔的室内供应96韦尔的浓度
，以10μgml的含量为10μgml-1对1级供水，供应4 H h HOR-1对准4 H H hl-1 kh tose n H Hy H H Hyl hh h Hy hl-1 kh in tement poseration in 4 h he hh theeption 4 h hele to s toe。将胰岛素-FITC孵育在含有ECM的板上 ，浓度在室温下为5-1 mg ml -1
，持续2小时，并受到光保护 。对照井含有不含ECM ，牛血清白蛋白（10μgml-1）或单独的聚赖氨酸
。用水洗涤井3次
，并使用Spectrostar Nano Microplate读取器（BMG LabTech，德国）进行成像。为了消化PNN或否定PNN负电荷 ，将井与CHABC（0.5 U ML-1）或Poly-L-L-精氨酸（10μgml-1，P7762
，Merk Millipore）在37°C的ECM涂层后37°C孵育1 h，在37°C后用水冲洗3次 ，然后将水洗涤3次
，然后用胰岛素– fitc浓缩 。 　　使用GraphPad Prism版本10（GraphPad软件）进行统计分析
。统计显着性由一个单向或双向方差分析（具有多重比较或重复测量），一个或两尾配对或不成对学生的t检验 ，ANCOVA或简单的线性回归。p <0.05被认为是重要的： *p <0.05
，** p <0.01和*** p <0.001 。单个实验的统计细节，例如N的精确值和精确的统计检验 ，请参见图和传说。 　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得
。