没有使用统计方法来预先确定样本量 。实验不是随机的 。在实验和结果评估中 ，研究人员并未对分配视而不见。
重组SARS-COV-2 MA的产生被北卡罗来纳大学Chapel Hill机构审查委员会（UNC-CH IBC）以及美国国家过敏和感染性疾病研究所（NIAID）的潜在大流行病原体护理委员会（NIAID）批准在BSL3条件下使用 。根据北卡罗来纳大学教堂山的机构动物护理和使用委员会批准的所有动物工作 。所有工作均使用经批准的标准操作程序和SARS-COV-2的安全条件进行。我们的机构BSL3设施旨在符合生物安全在微生物和生物医学实验室（BMBL） ，美国卫生与公共服务部，公共卫生服务部 ，疾病控制与预防中心（CDC）和卫生研究院（NIH）建议的安全要求。已经提交了实验室安全计划 ，该设施已被UNC环境健康与安全部（EHS）和CDC批准使用 。
使用Geneious Prime（V.2020.0.5）对齐2B组冠状病毒和ACE2氨基酸序列 。使用的登录号为：SARS-COV URBANI（AY278741），WIV1（KF367457），SHC014（KC881005） ，SARS-COV-2（MN985325.1） ，人ACE2（BAB40370）和鼠标ACE2（BAB40370）和鼠标ACE2（NP_081562）。使用Blosum62矩阵计算蛋白质相似性评分 。先前由晶体结构鉴定的接触残基33,34,45 。使用Modeller（V.9.20）进行结构建模，并使用Pymol（V.1.8.6.0）进行可视化。
所有使用的病毒均源自SARS-COV-2的传染性克隆 ，该克隆是使用SARS-COV和MERS-COV22,46,47的类似策略设计的 。The Q498Y/P499T substitutions were generated by site-directed mutagenesis using the following primers: forward: 5′-ATATGGTTTCTACACG ACTAATGGTGTTGGTTACCAACC-3′, reverse: 5′-TAGTCGTGTAGAAACCAT ATGATTGTAAAGGAAAGTAACAATT AAAACCTTC-3′.在传染性克隆的系统cDNA组装后得出病毒 ，然后在体外转录和电穿孔到Vero E6细胞中 。在Vero E6细胞上传递了一次病毒量，并通过斑块测定滴定。简而言之 ，将病毒连续稀释并接种到Vero E6细胞的汇合单层 ，然后是琼脂糖叠加层 。通过中性红色染料染色，在2 dpi处可视化斑块 。
Vero E6细胞于2003年从USamriid获得（ATCC CRL-1586） ，并在Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM； Gibco） ，5％胎儿克隆II血清（FCII，Hyclone）和1 x抗生素 - 抗生素 - 抗生素 - 抗生素（Gibco）中保存。DBT-9细胞先前是在我们的实验室中衍生在DMEM ，10％FCII和1倍抗生素 - 抗杀菌物中的克隆细胞 。细胞被确认对支原体污染为阴性 。
对于Vero E6单步生长曲线 ，在多种感染（MOI）的0.5中感染细胞1小时。除去接种物，并用PBS洗涤两次单层，并用培养基代替。对于HAE细胞生长曲线 ，将细胞在0.5的MOI下感染2小时 。除去接种物 ，并用PBS洗涤三次细胞 。在指定的时间点，在没有替换的情况下除去Vero E6上清液 ，或用200μl1×PBS顶端洗涤HAE细胞10分钟 ，并在-80°C下储存，直到被斑块测定滴定 ，如上所述。
对于ACE2受体的使用 ，使用Lipofectamine 2000（Invitrogen）转染了非允许DBT-9细胞，用PCDNA3.1空载体 ，PCDNA3.1-HACE2或PCDNA3.1-MACE2转染 。转染后24小时 ，在MOI的0.5中感染细胞1小时，除去并用PBS洗涤两次 。感染后24小时 ，去除培养基 ，并通过Trizol（Invitrogen）收集总细胞RNA，并使用Direct-Zol RNA Miniprep Kit（Zymo Research）提取。使用Taqman Fast Virus 1-Step Master Mix（Thermo Fisher Scientific）在QuantStudio 3（Applied Biosystems）上通过QRT-PCR（Thermo Fisher Scientific）对病毒RNA进行定量 。SARS-CoV-2 RNA was quantified using US Centers of Disease Control and Prevention diagnostic N1 assay with the primers: forward: 5′-GACCCCAAAATCAGCGAAAT-3′, probe: 5′-FAM-ACCCCGCATTACGTTTGGTGGAC C-BHQ1-3′, reverse: 5′-TCTGGTTACTGCCAGTTGAATCTG-3′.主机18S rRNA用作管家控制（Invitrogen，产品编号4319413E） 。使用ΔΔCT方法分析病毒RNA ，并用空载体转染的细胞中的病毒RNA上的折叠变化。
在北卡罗来纳大学教堂山分校饲养并维持了过表达HFH4-ACE2的小鼠 。BALB/C小鼠是从Envigo获得的（菌株047） 。小鼠在氯胺酮 - 氧基麻醉下用鼻内鼻内105 PFU感染小鼠。每天监测体重 ，并如前所述进行全身多生理图（WBP） 。简而言之，在使用FinePointe软件进行5分钟的数据采集期之前 ，允许小鼠在WBP室（DSI BUXCO呼吸溶液 ，DSI）中平衡30分钟 。在指示的时间点，通过异氟烷过量对小鼠安乐死的一部分 ，并收集组织样品进行滴度和组织病理学分析。在组织收集之前 ，将一小部分用于鼻涡轮组织病理学的小鼠灌注10％磷酸盐缓冲福尔马林。右尾肺叶被用于滴定，并将其存储在-80°C下 ，直到在1 ml PBS中匀浆 ，并如上所述用斑块测定法滴定 。将左肺叶用于组织病理学，并在石蜡嵌入和切片之前固定在10％的磷酸盐缓冲福尔马林中7天 。
将肺固定在10％磷酸盐缓冲的福尔马林 ，嵌入石蜡 ，并以4μm的切片中固定。用血久毒素和曙红染色连续切片，并使用单克隆抗Sars-Cov N抗体（1：250，NB100-56576 ，Novus Biogologicals）对Ventana Platform Platformation（Roche）（Roche）染色的部分（Novus Biologicals）进行染色 ，以进行SARS-COV-2 N的免疫组织化学（1：250，NB100-56576 ，Novus Biogologicals） 。使用Cellens条目软件 ，使用DP27摄像机以200倍的放大倍率在Olympus BX43光学显微镜上捕获显微照片 。
如前所述5,48，生成非选择的BSL2委内瑞拉委内瑞拉脑炎病毒病毒病毒病毒菌株3526复制子颗粒（VRP）以表达GFP ，SARS-COV-2 S或N ，如前所述5,48。通过在10μL中用103 VRP的后脚垫感染小鼠接种小鼠，在质量后3周内相同增强 ，并在3周时通过下颌下血出血 ，以确认存在中和抗体的存在 。通过使用野生型SARS-COV-2表达纳米酸酯酶（NLUC）代替ORF7A，通过中和测定评估中和抗体水平 。简而言之 ，SARS-COV-2的ORF7A基因从ORF7A转录调节序列下游的分子克隆和NLUC中取出。回收编码NLUC（SARS-COV-2 NLUC）的重组病毒 ，在37°C下将血清的滴定和血清系列稀释液孵育1小时，然后添加到Vero E6细胞的单层中 。感染48小时后，使用Nano-Glo荧光素酶测定系统（Promega）使用NLUC活性对病毒感染进行了定量 。IC50值是根据全稀释曲线计算得出的。
在促进后4周挑战小鼠 ，在氯胺酮 - 氧基麻醉下进行105个PFU 。每天监控体重 。在感染后的第2天 ，通过异氟烷过量对小鼠安乐死，并收集组织样品进行滴度分析 ，如上所述。
PEG-IFN-λ1是从GMP预填充注射器中从Eiger Biopharmaceuticals获得的 ，每个注射器0.18 mg（0.4 mg ml-1）。原发性HAE细胞培养物是从UNC的Marsico肺研究所/囊性纤维化研究中心的组织采购和细胞培养核心实验室获得的 。兰德尔（S.将原代细胞扩展到产生通道1细胞，并在transwell-Col（12毫米）的支撑（Corning）上以每孔250,000个细胞的密度铺路 。HAE细胞培养物是通过在空气界面上的分化产生6到8周的 ，形成了分化良好的极化培养物 ，这些培养物与体内假性化的粘膜纤毛上皮相似。在感染前，将HAE细胞用一定范围的PEG-IFN-λ1剂量在基底外侧处理24小时 。MTA从Gilead Sciences获得Remdesivir（1μM） ，并用作阳性对照 。培养物以0.5的MOI感染2小时。除去接种物 ，并用PBS洗涤培养3次 。在感染后48小时内，进行顶端洗涤以通过斑块测定法测量病毒复制 ，如上所述 。这项研究在两个独立的人类捐助者中重复。
在感染前18小时 ，在感染前18小时，在感染前18小时，在感染前18小时 ，在第18 h上用单个2μg剂量的PEG-IFN-λ1用单个2μg剂量的PEG-IFN-λ1皮下处理 ，或在感染后12小时治疗，或在感染后12小时 ，或在PBS-decehicle摄取的105 h MAA中 ，用SARS-COV在感染前12 h，并在感染前 ，将一岁或10周龄的BALB/C或4至7周龄的HFH4-ACE2小鼠皮下处理 。氯胺酮 - 二甲苯麻醉 。4至7周龄时的HFH4-ACE2小鼠被视为上述 ，并用105 PFU的SARS-COV-2 MA感染。每天监控体重 。如指示进行WBP 。在指示的天数，通过异氟烷过量对小鼠安乐死 ，并如上所述收集组织样品进行滴度分析。
所有数据均在棱镜中可视化和分析（V.8.4.2）。如图传说中所述进行非参数测试 。数字在Adobe Illustrator（v.24.1）中排列 。
有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然研究报告摘要中获得。
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本文概览： 没有使用统计方法来预先确定样本量。实验不是随机的。在实验和结果评估中，研究人员并未对分配视而不见。 重组SARS-COV-2 MA的产生被北卡罗来纳大学Chape...
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