色氨酸衍生的代谢产物吲哚-3-乙酸（IAA）在植物中具有重要作用，引发了多种发育过程和对环境CUES的反应1,2 。在对将生长素感知转化为转录反应的核事件的机械理解中 ，已经取得了很多进展 。9,10,11。其他研究已经在组织环境中调查了生长素从细胞中涉及的基本机械和非矢量释放的基本机制 ，这是通过Pinform的外排转运蛋白和ABCB转运蛋白的作用发生的，并导致计算机模型导致生长素流量介导的生长素流动介导的发育或物理学过程 。12,12,13,13,14 。相比之下 ，由于技术局限性（参考文献15综述） ，对单细胞分辨率以组织在组织中的实际分布知之甚少。目前，植物生物学家只能使用代理来可视化生长素分布，例如记者基因的生长素依赖性表达（例如 ，使用Systems Dr5 :: GUS3; dr5 :: er-gfp4和dr5 :: nls-3xgfp5）。但是 ，这种间接方法的特征在于潜伏期，并且可以受到生长素信号机械的调制影响 。最近 ，从依赖生长素依赖性的降解（并因此降低）与IAA抑制性蛋白的结构域II相关的荧光蛋白（例如 ，二炎和R2D27）的荧光蛋白中推断出IAA水平 。这些方法的局限性是它们的不可逆性，这排除了生长素水平瞬时变化的可视化。
Planta中生长素动力学可视化的理想传感器应具有以下特征：首先 ，传感器与生长素的物理相互作用应以可逆的方式引起荧光信号 ，以便可以监测生长素浓度的变化；其次，传感器的灵敏度应足够高 ，可以随着时间的推移对动态生长分布进行成像 。第三 ，传感器应针对不同的亚细胞隔室的目标 - 依赖基因表达或蛋白质降解的常规代理无法实现的位置；第四，传感器不应包含参与植物代谢或调节的组件 ，以便避免使用植物对生长素反应的干扰和传感器的调节 。
考虑到这些边界条件 ，我们开发了一种遗传编码的，完全可逆的生物传感器，用于体内成像 ，用于从空间和时间分辨率的高空间和时间分辨率的体内成像 ，从细菌色氨酸抑制剂（TRPR）开始。IAA类似于色氨酸：两者都包含一个吲哚环，其3位与TRP中的氨基酸部分相连 ，IAA中的羧基连接（图1A） 。二聚体TRPR在结合TRP16,17后经历构象变化 ，融合到TRPR的荧光蛋白可以中继这种变化，从而产生荧光共振能传递（FRET）信号 ，作为体内测量的方便读数18（图1B） 。此外 ，TRPR对IAA8的亲和力较低。这使TRPR成为开发生长素特异性，遗传编码的FRET BioSensor19的理想起点 。我们的设计工作旨在改善IAA结合的亲和力和特异性 ，同时消除TRP结合 。我们假设TRP和IAA的吲哚环具有可比的结合模式 ，并将设计集中在TRP氨基附近的TRPR残基上（图1C）（图1C），旨在提高IAA羧基的特异性。此选择后来扩展到包括相邻残基 。总共在连续的诱变回合中产生了2,000种变体 ，并在添加IAA时筛选了FRET信号的增加（图1D ，扩展数据图1） 。使用与IAA相似的物质库检查了改进的变体的配体特异性，据报道在拟南芥中存在（扩展数据表1）。为了确认结合亲和力的改善，通过等温滴定量热法分析了选定的TRPR变体（扩展数据表2A）。此外 ，通过X射线晶体学阐明了几种变体的结构 ，以引导诱变实验（扩展数据表2B，补充表1A – H） 。
我们的结构分析表明 ，与TRP相比 ，IAA与TRPR结合时，IAA被翻转180°（图2A） ，IAA的羧基面向TRPR结合口袋的打开（图2B） 。TRP与周围蛋白质残基相互作用锚定 ，而IAA结合没有这种稳定性，这反映在这种相互作用的较差的结合亲和力中（扩展数据表2a）。在工程生长素传感器中 ，我们确定了稳定并偏爱这种IAA结合模式的变体 。首先 ，发现在88位（S88Y）处的丝氨酸至酪氨酸突变完全阻止了Y88的侧链链链，同时通过与R84和Y88 Y88的瓜尼尼诺基团的IAA相互作用同时使用IAA结合 。通过优化其吲哚环与TRPR结合口袋的疏水相互作用 ，进一步提高了对IAA的亲和力。为此 ，将突变T44L和T81M纳入了最终传感器设计中（图2D） 。在工程过程中，我们还监视了吲哚-3乙腈（IAN）的结合（可能会与IAA竞争）（扩展数据表2A） 。IAN和IAA的结合模式明显相似（扩展数据图2a，b）；但是 ，诸如N87G之类的突变通过Y88的位置的小变化发挥歧视作用（扩展数据图2C）。最后 ，我们确定了对IAA亲和力没有良好作用但可以改善FRET读数的突变，这可能是通过包装的变化 ，因此是附着的荧光蛋白的方向的变化（扩展数据图2D） 。然后 ，我们优化了荧光机和链接器组合（图3的扩展数据），以产生我们的最终传感器 ，我们将其称为“ auxsen ” ，并带有组成的颗粒– trpr – aquamarine – trpr，其中trpr为trpr（m42f/t42f/t44l/t44l/t81m/t81m/n87g/n87g/n87g/n87g/n87g/s888y）（2. 1d. 1d. 1d. 1d. 1d. 1d. 1d. 1d. 1d. 1d. 1d. 1d 。
在体外 ，用50μMIAA处理后 ，Auxsen的FRET比率在三个倍上变化，该系数在细胞生长素浓度范围内。该信号在胞质pH值下稳定 ，在还原或氧化环境和所有测试的盐离子的情况下（扩展数据图4） 。使用其他吲哚衍生物评估了Auxsen对IAA的特异性 。其中 ，艾克森对IAA的亲和力最高。尽管观察到其他化合物的响应，但它们的结合亲和力减少了一个数量级（扩展数据图5）。在这些吲哚衍生物中，只有伊恩在植物中大量存在（扩展数据表1） 。然而 ，根显示对用IAN治疗的增长反应 ，并且建模表明IAA受体SCFTIR1可以结合IAN21 。因此，伊恩可能被隔离了 ，因此不太可能干扰植物中的生长素。
作为确认体内Auxsen功能的第一步 ，我们在细胞悬浮原生质体中的病毒35S启动子瞬时表达了传感器的核定位版本，并通过流式细胞仪量化了FRET响应 。从四个数量级的培养基中的生长素浓度随着培养基的浓度而增加 ，从3μMIAA开始（图3A ，B，扩展数据图6、7） ，基线壁fret信号被认为反映了原生质质体种群中生长素的内源性水平 。因此 ，传感器的敏感性足以报告内源性生长素水平。
我们生成了大约250个带有地塞米松诱导表达系统的转基因拟南芥线（Pbay-Bar-prps5a-Mgal4-VP16-GR_UAS_NLS_AUXSEN），并选择了10行在第四代中稳定地表达传感器 。强 ，普遍活跃的启动子RPS5A驱动酵母转录因子GAL4P的表达 ，其核摄取是由地塞米松诱导的，而GAL4P与UAS启动子的结合会导致核含量的生长素传感器的表达 。在地塞米松诱导过夜后，在根尖端中通过mneongreen荧光在一夜之间的根尖中鉴定出强烈表达的线。为了检查植物学对植物学生长素的反应 ，我们用10μMIAA处理了幼苗 ，并随时间记录了FRET信号（图3C – F） 。10分钟后，根核中的FRET信号达到了最大值 ，然后保持恒定50分钟 。相比之下 ，用溶剂DMSO处理不会诱导任何反应（图3C，D）。为了揭示核生长素积累的速度 ，我们在较短的时间间隔内测量了FRET信号 。在2分钟内达到最大信号 ，仅1分钟后达到80％以上（图3E，F） 。因此 ，来自细胞外空间的生长素的吸收似乎是高效的。然后 ，我们通过清除IAA来研究核积累的可逆性。在10μMIAA中孵育10分钟后，幼苗给出了最大特征比 ，将培养基更改为DMSO（图3G ，H） 。FRET比率逐渐降低，几乎达到30分钟后的预孵育值，这表明细胞的IAA流体缓慢（图3G ，H） 。我们重复了实验 ，但将IAA孵育时间延长至1小时。这种加速的IAA外排使得FRET比在IAA退出10分钟内降低到其预孵育水平（图3G，H） 。IAA的外流增加与1小时后的PIN外排载体的两到三倍相关 ，而IAA孵育10分钟（扩展数据图8） 。总之 ，该基于FRET的传感器可以报告瞬时生长素积累的动力学。尽管传统的记者系统可以检测对生长素摄取的反应6，但记者翻译或降解的不可逆性掩盖了生长素反应的短暂性 。我们的数据表明 ，IAA的吸收是一个构成的快速过程 ，而来自细胞的外排则按需发生，好像生长素调节其自身的出口一样 。
为了探索生长素是否可能积累在其他亚细胞室中（基于基因表达或蛋白质降解的记者无法访问的 ，我们都将Auxsen靶向内质网的腔（ER）。ER膜中销钉和类似销的生长素转运蛋白的定位导致人们猜测 ，ER中的生长素积累可能是生长素稳态的古老机制 。与DMSO对照相比，在100μMIAA中孵育幼苗15分钟导致FRET比的强烈增加 ，这表明IAA被转运到ER中（图3i ，j） 。同一幼苗根中的不同细胞在ER中显示出不同水平的辅助辅助子（图3i）。但是，暴露于IAA时的FRET比率变化在表达较高或更低水平的Auxsen的细胞之间没有显着差异（图3J） 。总之，这个基于FRET的生长素传感器可以忠实地报告来自诸如ER等亚细胞隔室的生长素浓度 ，而传统的生长素反应记者无法访问 。
从生长素反应记者的稳态表达水平（如PDR5：GFP：GFP或p35s：dii-Venus）中 ，内源性生长素的空间分布是从稳定状态表达水平推断出来的，dii-venus在根部拟端tip6附近的根部正当中心的静态中心显示出明显的最大值。与此相一致 ，尽管没有显着的最大值 ，但我们的生长素传感器的FRET比稳定地增加了根尖（图4A，B）。为了评估向生长素的稳态分布的转运的贡献 ，我们在Brefeldin A中孵育幼苗 ，该幼苗通过抑制生长素外排式转运蛋白PIN124的极性回收来损害生长素的转运 。与未处理的对照相比，在处理的根尖端中 ，FRET比率增加（图4A ，B） 。据推测，这种增加是由于根尖中的IAA合成而导致的 ，而排出受损时 ，这与细胞分级表达GFP表达的线条中IAA生物合成的质谱分析是一致的，并且与根PIP25中的Auxin-Biosynsis基因的表达相一致。我们得出的结论是，Auxsen报告了内源性生长素分布的扰动 ，这突出了其用于检测生长素的特异性 。
响应重力载体方向的响应根生长的重定向是快速生长素信号传导的一个主要例子 ，它涉及根尖端内内源性生长素的重新分布 。生长素外排转运蛋白PIN3从（前）基底到（前）侧面质膜的重新定位已在将根转向水平位置后2分钟被检测到2分钟。但是，据我们所知 ，尚未报告生长素分布的伴随变化 。使用生长素反应性降解报告基因二维斯的最早变化是在重力刺激开始后30分钟的新下侧的荧光降低28 。我们平衡了安装在近垂直位置的幼苗根 ，然后将其方向更改为135°，并随着时间的推移监测了核颗粒的比率（图4C ，D）。在1分钟内 ，根尖的新下一侧的FRET比明显增加，相当于5分钟后达到的最大值的80％以上 。然后 ，我们将根部返回到30分钟后的近垂直位置 ，并在1分钟内检测到了FRET信号的预刺激分布（图4C，D） 。因此 ，重力刺激会在根尖端中引起生长素传输系统的快速和可逆响应。总之 ，该生长素传感器报告了内源性生长素积累的快速，可逆的重新分布 。
我们的设计方法为普遍存在的植物信号分子生长素提供了一种新的传感器Auxsen 。从色氨酸传感器开始，我们优化了IAA结合的亲和力和特异性 ，并通过选择FRET对和接头的优化来提高信号强度。我们的结果提供了原则上的证明 ，即该检测系统可以可视化生长素的动态再分配以及生长素的亚细胞池，这是当前正在使用的生长素报告者无法实现的。通过Auxsen的分辨能力使生长素动力学对生长素动力学的见解的一个例子是有效摄取和较慢的生长素的条件外排之间的对比 。此外 ，Auxsen可以使生长素分布的变化与生长素反应的变化区分开 ，这是研究该主要信号分子在植物生长和发育中的生物学效应的基础的复杂调节网络的先决条件 。
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文章不错《生长素直接可视化的生物传感器》内容很有帮助