所有动物实验均符合加州大学伯克利分校机构动物护理和使用委员会的监管标准和批准。在20-26°C和30–70％的湿度下，在12 h – 12 h的光周期中 ，将小鼠保持在特定无病因的条件下，并给定水和标准的食物饮食（Harlan的辐射杂志） 。所有老鼠都是内部繁殖的。C57BL/6和B6.129S2-IFNAR1TM1AGT/MMJAX（IFNAR - / - ）小鼠最初来自Jackson Laboratories和MMRC
，并在内部进一步繁殖
。先前描述了SP140 - / - 小鼠的产生和基因分型4。通过CAS9的C57BL/6个Zygotes，IDT的Alt-R Crispr-Cas9 Crrna（GRNA序列：Acuccaagggggacccuguuca）和同源性ALT-R HDR Donor donor Oligo产生HA-SP140敲入小鼠 。(CCCCTGAAGGAGTTCTCTCTGGGCTTCCCAGAGACTCAGAGGGGGTTCGGTCTAGTCTGAACAGGGTCCCTTGGAGTCTGTGTAGGGGATGTACCCATACGATGTTCCAGATTACGCTGCAGGAGGCTACAATGAACTCAGCAGCAGGTAAGTCCCATTCTCTCTTGTCCCTTGTCTC) as previously描述61
。将创始人回到C57BL/6J上 ，并进一步繁殖了具有匹配的HA-SP140等位基因的小鼠。使用来自Transnetyx的基于QPCR的测定法对HA-SP140敲入小鼠进行基因分型 。SP140 - / - 抗1 - / - 抗2 - / - 小鼠是通过用Cas9和sgrna（Cgacgatggcggtgactaccc）的SP140 - / - Zygotes电穿孔产生的
。将创始人进行基因分型
，并将其反向SP140 - / - 小鼠，然后进一步繁殖了带有匹配等位基因的后代。对于基因分抗1/2 ，以0.4 mg ml -1蛋白酶K进行过夜
，在Quickextract裂解缓冲液中获得大耳夹，然后在Quickextract裂解缓冲液中消化 ，然后进行热灭活（85°C 4分钟
，98°C，持续2分钟） ，并储存在-80°C下 。冷冻后
，耳夹裂解物涡旋
。Mice were genotyped for Resist1 (Gm21188) with Q5 2× PCR mix according to the manufacturer’s instructions with 1 μl of lysate per 20 μl PCR reaction (F, TTGAGAAATCCGTTTGTAATGGG; R, GCCTTTCTCCGGATTCACGA; cycling conditions: 98 °C for 3 min, 35 cycles of 98 °C for10 s， 63.5°C持续20 s和72°C 65 s ，然后最终延伸为72°C 10分钟）。Mice were genotyped for Resist2 (Gm36079) with Phusion GC rich PCR components according to the manufacturer’s instructions, using 1 μl of lysate per 20 μl PCR reaction (F, TGGTATTCTCTAGAGATAACATCACAGCACCTACTTACTCC; R, CCTCCCCTCGCCATCACTGCCTG; cycling conditions: 98 °C for 30 s, 3098°C的循环持续10 s，72°C 15 s和72°C 60 s
，然后最终延伸为72°C 10分钟） 。总共用FastAp和EXOI清洁了总共5μL的PCR产物，然后用水和Sanger测序将双重稀释（抗数R ，GCCTTTCTCCGGGATTCACGA； COLSIT2 F SEQ
，CTGAATGATTCTTCTTCTCTACTGCTTCCCATCC）
。使用Snapgene（V.7.0.1）评估了Sanger测序结果。 　　从UC Berkeley组织培养设施中获得HEK293T和GP2细胞，并在完整的DMEM（10％FBS（V/V）（Gibco）和1×Penicillin -streptlylin-streptomycin和gibutamine（Gibco）中进一步传播在37°C和5％CO2 。Blaer1细胞（来自V. hornung的实验室）以完整的rpmi培养在B细胞阶段 ，并如前所述分化为单核细胞29。PCR（F
，caccatctgtcactctctgttaacc; r，ggagcaaacaggattagataccccccccccccccccccccccccccccccccccccccccccccccccccccccccccccccccc; r dreamtaq pcr试剂;HEK293T细胞于2024年11月25日最后一次验证 ，GP2细胞于2024年5月23日进行了最后验证
，并于2024年5月23日对Blaer1细胞进行了最后验证
。 　　将小鼠安乐死，并在70％乙醇中用严格的洗涤提取骨骼（股骨和胫骨）。在70％乙醇和BMM培养基中洗涤后（如前所述的3T3细胞产生的10％MCSF（V/V）的完整RPMI）将骨骼粉碎在灭菌的砂浆和杵中 ，骨髓通过70-μm滤光片 。一只小鼠的骨髓在BMM培养基中的30毫升总体积中分为八个15 cm非组织文化处理的板
。骨髓收集日被认为是第0天
，并且在第3天以每盘10 mL培养基喂食BMM。在第6天，通过刮擦并以适当的密度（每个非组织培养物处理的12孔12孔和24孔；对于超过100,000个细胞） ，将BMM收集在冷PBS中，并在非组织文化处理的板上收集BMM
，并至少在刺激前搁置一整夜 。为了刺激，将培养基吸入并用含有10 ng ml-1 lps（Invivogen ，tlrl-3pelps）的BMM培养基代替
，100μgml-1 poly（i：c）（Invivogen，tlrl-picw） ，100μgml-1 dmxaA（100μgml-1 dmxaa）575304）
。 　　根据套件说明
，使用Omega Biotek Total RNA II试剂盒分离RNA。随后根据制造商的说明，对RNA进行了DNase在柱上（Qiagen ，79254）或RQ1（Promega
，M6101）的处理 。对于BLAER1细胞，RNase抑制剂始终包括DNase处理（rNaseout（Invitrogen）或rnasin（promega））
。然后将RNA在RNase抑制剂的情况下 ，用上本III III逆转录酶（Invitrogen
，18080093）和Oligo DT18（NEB，S1316S）转化为cDNA。使用Power Sybr Green PCR Master Mix（Thermo Fisher Scientific ，43-676-59）试剂通过QPCR评估稀释的cDNA，并使用技术重复项评估 。每个实验中的样品产生的标准曲线用于量化转录本的相对量
。Ifnb1 transcript levels (F, GTCCTCAACTGCTCTCCACT; R, CCTGCAACCACCACTCATTC) were normalized to housekeeping genes including Rps17 (F, CGCCATTATCCCCAGCAAG; R, TGTCGGGATCCACCTCAATG), Oaz1 (F, GTGGTGGCCTCTACATCGAG; R,如图所示。人IFNB1转录量（F
，Cagcatctgctgctggttgaaga; r，cattacctgaaggccaagga）被标准化为HPRT1（f ，atcagactgaagagctattgtaatga; r
，tggcttatatatatatAtatatAtataTcccaAcacttcgtcgtg） 。QPCR分析中还包括未用逆转录酶处理的DNase处理的RNA，以确保完全消化基因组DNA。RT – QPCR反应孔具有较差的ROX参考 ，将分析排除在分析之外
，并且具有异常低的管家基因量的样品表示RNA降解
。数字中的重复表示生物学重复（单独的细胞井）。 　　如先前所述的27,62，在100μgml -1 dMXAA刺激前用新鲜制备的400μM4SU预处理BMM（Cayman Chemicals ，16373）1-2小时1-2小时
，或在DMXAA刺激后2小时用4SU处理，如前所述2 h 。简而言之 ，如上所述收集RNA并处理了DNase
。用48μMN-乙基马来酰亚胺（Sigma-Aldrich
，04259-5G）处理等量的RNA（约200 ng或更多），并用20 mM DTT淬灭。然后用RNACLEAN珠（Beckman Coulter ，A63987）纯化RNA，并根据制造商的指示在存在RNase抑制剂的情况下
，用原始的II逆转录酶转换为cDNA 。然后按照上述IFNB1（F，TGGATGGCAAAGGCAGTGTAA; R ，CACCTACAGGGGGGGACTTC）和RPS17（见上文）进行QPCR
。在某些实验中
，管家归一化的IFNB1在数字中显示为每种情况下DMXAA刺激2小时的平均IFNB1/RPS17量的百分比。为了验证障碍RT -QPCR方案，在每个障碍RT -QPCR实验中 ，在DMXAA处理之前
，还与4SU并行预处理BMM细胞，并在T = 2和其他时间点上分离RNA ，并在图中指示的其他时间点
，并转化为CDNA 。确认NEM治疗可将QPCR对IFNB1转录本的检测减少约十倍左右，并在DMXAA前进行4SU预处理 ，每次障碍RT -QPCR实验
。 　　在200μl培养基中的非组织文化处理的96孔板中
，将BMM的每孔播种为每孔85,000个细胞，并在一夜之间休息。用图传说中指示的刺激刺激细胞24小时 。将板以600克旋转5分钟 ，然后除去上清液并存储在-80°C下
。根据制造商的说明，使用Lumikine Xpress MIFN-β2.0试剂盒进行评估之前
，将来自DMXAA处理的细胞的培养上清液稀释1：50-1：100。 　　第6天的BMMS衍生自B6和SP140 - / - ，或IFNAR - / - 和SP140 - / - IFNAR - / - 小鼠 ，在六孔非组织培养的板中以1×106个细胞播种
，以1×106个细胞接种，并在经过的六孔培养板中播种 。然后 ，将BMM保持未刺激或用DMXAA（B6和SP140 - / - BMM100μgml -1）
，以及10μgml -1 dmxaA，用于IFNAR - / - - / - 和SP140 - / - / - ifnar - ifnar - / - bmms的IFNAR - / - - for BON -ifNAR ---/ - bmms for 8 h140 for 8 h140 -in -in -in -for 8 h140 h140 -in -1440 h。IFNAR - / - 和SP140 - / - IFNAR - / - BMM
。使用Omega Biotek Total RNA II试剂盒分离RNA ，并根据制造商的说明对DNase进行了DNase对Turbo DNase（Thermo Fisher Scientific
，AM2238）进行了处理。对于来自B6和SP140 - / - BMM的RNA，使用RRNA DEPTETION（QIAGEN ，QIASEQ FASTSERCT-HMR RRNA删除套件）和NEBNEXT RNAXT RNA Ultra Ultra套件（NEB）生成了Azenta单个单位文库 。图书馆均匀分离在Illumina Hiseq流动池的两个车道上并进行了测序（150 bp配对末端读数
，每个样本的深度为25-30万读）
。对于IFNAR - - / - 和SP140 - / - IFNAR - / - BMM样品，为使用poly（a）选择和KAPA HyperPrep Reagents（ROCHE）进行双重指标制备了库 ，并通过UCBerkeley QB3 Vincent QB3 Vincent QB3 Vincent sequents sequent sequent sequentalitation coecent Laboratory。随后，库在450至500 bp之间进行了大小选择
，然后在Illumina Novaseq流动池上进行了测序，深度超过2000万个映射的读取（150 bp ，配对 - 末端） 。从IFNAR - / - 和SP140 - / - IFNAR - / - 样品分别收集B6和SP140 - / - 样品
。每种基因型的三个独立实验收集了每种基因型的三种生物学重复
，每种基因型的三个独立实验，这些实验是年龄和性别匹配的三种。使用BBDUK v.38.05修剪适配器和低质量读数 ，其中'ktrim = r k = 23 mink = 23 mink = 11 hdist = 1 mapq = 10 qtrim = r trimq = r trimq = 10 tpe tbo' 。对于UCSC基因组浏览器可视化
，将读取映射到MM10鼠标参考基因组（https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hggateway?db=mm10） 使用HISAT2 v.2.1.0与选项'-no-SoftClip -k 100 |Samtools视图-Q 10 -SB- |Samtools排序’
。使用DeepTools Bamcoverage v.3.0.1制造了CPM归一化的大wig。对于转录本量化，使用鲑鱼V.0.13.1映射到MM10（Gencode.vm18.annotation.gtf） ，其中具有“ - libType a -validatemappings -range-rangeFactorizationbins-labtype a-libtype a-gccbias ” 。使用DESEQ2 V.1.38.3称为DEGS
，设计为“〜批次 +基因型 +治疗 +基因型：治疗”
。对于SP140 - / - 与B6 BMM和SP140 - / - IFNAR - / - 与IFNAR - / - BMMS的差异表达分析，从以下DESEQ2比较得出了归一化计数数据：（1）SP140-DEDEFIENT与DMMMS治疗的dmxaAa（sp140-Dece）bmmms pred bmsms vers vers vers vers vers vers vers vers vers vers vers vers vers vers vers vers vers vers vers vers vers vertt vertt vertt verttDMXAA（3个重复）;（2）未处理的SP140缺陷BMM（3重复）与未处理的SP140-WT BMM（3重复）。除去所有样品的零计数基因 。使用GGPLOT2 v.3.5.0 R软件包生成火山地块。 　　在三个单独的实验中 ，B6和SP140 - / - 样品BMMS在100μgml-1 DMXAA中衍生和刺激8小时
，与针对RNA-Seq产生的样品平行
。在PBS中收集BMM并进行计数，并根据先前所述的100,000个输入细胞产生ATAC -SEQ样品 ，除了将分离的核以1,000g离心。如先前所述，编制了与Illumina兼容的库
，并具有附加的Ampure XP珠（Beckman Coulter）纯化，以去除污染的适配器二聚体 。在Illumina Hiseq流动池上用Azenta对样品进行测序（每个样品的成对端读数超过5000万 ，读取150 bp）
。使用BBDUK v.38.05修剪适配器和低质量读取
，其中参数为“ ktrim = r k = 23 mink = 23 mink = 11 hdist = 1 maq = 10 qtrim = 10 qtrim = r trimq = 10 tpe tbo’，并使用bwa-mem v.0.7.15和无量的读取中绘制为mm10 ，并仅读取了bwa-mem v.0.7.15
，并仅读取了10分钟的读数。去除与线粒体基因组排列的片段被去除 。使用MACS2 v.2.1.1的完整和尺寸取消对齐文件使用配对 - 端选项“ - 格式bampe -spmr -b-broad
”进行峰值调用
。为了可视化，使用DeepTools BamCoverage v.3.0.1制作了每百万个均值的大翅膀文件。对于用DMXAA处理的SP140 - / - BMM的ATAC – SEQ峰数据的差分表达分析 ，用DMXAA处理的B6 BMMS（3重复）（3个重复）
，归一化计数数据来自deseq2 。在使用密台床（v.2.28.0）中发现了最接近的基因与SP140 - / - BMM产生的数据中的最终基因
。然后，该基因列表与HA – SP140剪切和运行峰值数据的盖床基因列表重叠。使用GGPLOT2 v.3.5.0 R软件包生成火山地块 。 　　将低通的HEK293T细胞或GP2包装细胞在组织文化处理的板上以六孔格式播种 ，并至少在一夜之间休息
。To generate lentivirus, HEK293T cells at >70% confluency in a six-well tissue-culture-treated plate were transfected with 0.468 μg VSV-G (pMD2.G, Addgene, 12259), 1.17 μg D8.9 packaging vector and 1.56 μg of doxycycline-inducible, puromycin-selectable lentiviral根据制造商的说明
，使用Lipofectamine 2000使用河孔向量。本研究中使用的慢病毒主链（PLIP）通过去除CCDB29改编自PLIX（Addgene，41394） 。使用输注试剂（TAKARA） ，将编码密码子优化的小鼠/人抗性或麦克利的基因块克隆到PLIP中，用NHEI和BAMHI（用NHEI和BAMHI消化）
，基本上如前所述，如前所述29。PCR还生成了抗（∆C）构建体以在ASP161之后去除残基 ，然后输注克隆到PLIP主链中
。所有构建体均通过Sanger测序验证
，其结果在Snapgene v.7.0.1中进行了评估。为了产生逆转录病毒，将六孔板中的GP2s高于70％的汇合度 ，用0.5μg的VSV-G和3.5μg的腹膜逆转录胺2000 。32716;将小鼠SP140或HA-SP140密码子优化的cDNA克隆到PTGMP中
，并通过输注（TAKARA）进行了修改，其中包括最小的CMV启动子驱动SP140构建体 ，然后是PGK启动子驱动普霉素抵抗盒
。然后
，转染后18-20小时，转染细胞上的培养基更改为1 ml BMM培养基。如上所述收集骨髓 ，并在BMM培养基中镀骨 。根据制造商的说明
，产生了反元蛋白处理的（Takara）六孔板
。第二天 （在转染细胞上更换培养基后约30小时），通过通过0.45μM滤波器过滤从转染的细胞中收集病毒 ，并在4 mL BMM培养基中添加到每孔骨髓中的1×106细胞中。在37°C下以650克旋转1.5–2 h 。然后，在骨髓收集后3天
，BMM被用1.33 mL BMM培养基喂食
。BMM是在收集BMM后第4天选择的紫霉素，并以2.75-5μgml -1紫霉素的形式选择。确定紫霉素的杀伤曲线 ，以鉴定选择BMM选择所需的最低浓度
，并使用缺乏紫霉素耐药性盒的逆转录病毒载体转导的非转导井或BMMS来验证完全杀死非呼吸毒素的非转导细胞 。选择嘌呤霉素（2天）后，将培养基交换 ，并允许BMM恢复2-6天
，然后再播种
。用慢病毒PLIP构建体转导的BMM用2.5μgml -1强力霉素预处理24小时，然后用100μgml -1 dmxaa和新鲜的多西环素仔细调整。在图传说中指示的RNA分离或co-IP中指示的时间点收集细胞 。 　　如上所述 ，用编码HA – SP140或SP140的逆转录病毒转导SP140 - / - BMM
，并用100μgml -1 DMXAA刺激8小时。使用0.5μg的兔抗HA单克隆抗体（细胞信号技术，C29F4 ，C29F4）使用Escherichia Coli coli coli coli coli coli coli spike-In使用0.5μg兔抗HA单克隆抗体（EpiCypher
，14-1048，v3） ，使用Epicypher Cutana/Chic/Cut＆Run Kit（Epicypher，14-1048
，V3），将一百万个细胞输入生物学三式三份（Epicypher ，14-1048
，v3）中的生物学三分之一
。还对未转移的B6 BMM（0.5×106）进行处理，以使用0.5μg兔同种型对照IgG（Epicypher ，13-0042）进行切割和运行
，单个生物学重复。根据套件说明，在孤立的核上进行切割和运行 。根据套件说明 ，使用Epicypher Cutypher Cutana Cut＆Run Library Prep套件（Epicypher
，14-1001）制备库，然后在Illumina Novaseq Flow Cell上进行测序 ，每样品的读数为250 bp配对末端读取约为600万个读取
。使用BBDUK v.38.05修剪适配器和低质量读数
，使用选项“ ktrim = r k = 23 mink = 11 hdist = 11 hdist = 1 maq = 10 tpe tbo qtrim = r trimq = 10'。使用BWA-MEM V.0.7.15对修剪读数对齐与MM10组件，并且仅保留了最小MAPQ为10的唯一映射读数 。去除与线粒体基因组排列的片段被去除
。使用Macs2 v.2.1.1的完整和尺寸子集对齐文件进行峰值调用 ，并配对端选项“ - 式式bampe - pvalue-pvalue 0.01 - spmr -b-b-call-call-summits”。使用Bedgraphtobigwig v.4从Macs2拟范围的床上图文件中编写了Bigwig文件 。MacS2峰得分是HA – SP140峰的输出的归一化序列读数的序列读数
。 　　合并了复制MACS2切割和运行峰值文件，然后使用BedTools Intersect（v.2.28.0）65从HA – SP140峰文件中减去控件（IgG和SP140）
，以输出SP140峰的文件。该SP140峰值文件用作Cistrome Toolkit数据浏览器（http://dbtoolkit.cistrome.org/)66中的输入 。SP140峰值文件还用作注释工具的基因组区域富集的输入（Great，V.4.0.4）67
。 　　在20°C的LB培养基中 ，在LB培养基中产生并纯化了Anxa2-S100A
，并在LB培养基的大肠杆菌BL21（DE3）星细胞（Thermo Fisher Scientific）中纯化，作为携带N端His6-SASUMO标签的融合蛋白。将细胞重悬于裂解缓冲液（50 mM HEPES ，500 mM NaCl
，25 mM咪唑，pH 7.5）中 ，并使用Branson Ultrasonics Sonifier SFX550裂解 。通过在40,000g的4°C下离心1小时通过离心清除裂解液。将清除的裂解物加载到5 mL Histrap柱（Cytiva）上
。将结合的蛋白在带有洗脱缓冲液的线性梯度上洗脱（50 mM HEPES
，200 mM NaCl，500 mM咪唑 ，pH 7.5）。在最后一步中
，在含有10 mm HEPES，200 mM NaCl ，2 mM DTT，2 mm DTT
，pH 7.5的缓冲液中，在SuperDex 200 26/600列上进行了尺寸 - 排斥色谱法 。 　　For expression of full-length RESIST, full-length human RESIST (UniProt: Q3ZCQ2) was inserted between the BamHI and XbaI restriction sites of the pLIB plasmid68 with a TEV (tobacco etch virus) protease-cleavable, N-terminal His6–MBP (maltose-binding protein) tag and a C-terminal StrepII tag.编码人TTP的RNA结合锌指的DNA序列（TZF； Uniprot：p26651 ，残基SER102至Ser169）在NDEI和XHOI限制位点之间插入PNYC质粒的NDEI和XHOI限制位点之间
，并使用TEV-clable n-terminal mbp and-Terminal mbp and terminal mbp and crteci和a-crteci strtractinal stractinal stractinal先前描述了NOT9模块表达的DNA构建体70
。随后，使用Multibac baculovirus表达系统71,72在SF21昆虫细胞中表达具有N末端TEV可裂解His6-MBP标签和C末端链球菌标签的全长抗药性。简而言之 ，在SF900II培养基（Thermo Fisher Scientific）中
，将SF21细胞在27°C下的密度为2×106细胞，并在其停止分隔后收集了48小时 ，并感染了V1 HIS6 -MBP -MBP -MBP -STREPII baculovirus的SF900II培养基（Thermo Fisher Scientific） 。将收集的细胞重悬于冰冷的蛋白缓冲液中（50 mM HEPES pH 7.5 、150 mM NaCl
，5％（v/v）甘油，20 mm CHAP ，25 mM咪唑）
，并通过超声裂解
。通过在40,000克离心40分钟，在4°C下澄清裂解液 ，通过0.45μm尼龙滤波器过滤，并将其加载到5 ml镍荷荷丝带柱（Cytiva）上。通过补充40 mM咪唑的裂解缓冲液洗涤去除污染物
，并在补充了250 mM咪唑的裂解缓冲液中洗脱了HIS6 -MBP抗抗菌剂 。通过在含有50 mM HEPES pH 7.5，150 mm NaCl ，5％（V/V）甘油
，20 mm Chaps的hiload Superdex 200 16/600柱（Cytiva）上，通过尺寸 - 排斥色谱法进一步纯化了洗脱蛋白
。将峰值分数合并 ，以一个离心滤波器浓缩
， 在液氮中闪烁，并储存在-80°C下。TTP（TZF）的RNA结合锌指在20°C的自动诱导培养基中表达在自动诱导培养基中的大肠杆菌BL21（DE3）星细胞（Thermo Fisher Scientific）过夜 ，作为融合蛋白
，载有N-末端的TEV可透明的MBP标签和C- terminal termalinal strepii标签 。将收集的细胞重悬于蛋白质缓冲液（50 mM HEPES pH 7.5、300 mM NaCl，10％（w/v）蔗糖）中 ，并通过超声处理裂解
。通过以40,000克离心40分钟来阐明裂解物
，并加载到1 mL streptrap XT柱（Cytiva）上。通过用高盐缓冲液（50 mM HEPES pH 7.5，1 M NaCl ，10％（w/v）蔗糖）洗涤，用含50 mM生物素的裂解缓冲液洗脱
，清除污染物 。通过补充2 mM DTT的蛋白缓冲液中的SuperDex 200 26/600色谱柱（Cytiva）上的大小排列色谱法进一步纯化了洗脱蛋白。然后将峰值分数汇总，并用离心滤光片浓缩 ，在液氮中闪烁
，并储存在-80°C下
。最后，如前所述制备了NOT9模块48。 　　在37°C下 ，在自动诱导培养基中生长的大肠杆菌BL21（DE3）星细胞（DE3）星细胞（Thermo Fisher Scientific）在37°C的自动诱导培养基中生长的大肠杆菌BL21（DE3）星细胞（Thermo Fisher Scientific）在37°C下生长的大肠杆菌BL21（DE3）星细胞（Thermo Fisher Scientific）在37°C下生长的大肠杆菌BL21（DE3）星细胞（Thermo Fisher Scientific）在37°C下生长 。将细胞重悬于裂解缓冲液（50 mM HEPES
，500 mM NaCl，pH 7.5）中 ，并使用Branson Ultrasonics Sonifier SFX550裂解
，然后通过40,000G在4°C下以40,000g的离心液清除裂解液
。将链球菌标记的蛋白（AnxA2R，MBP或SMARCA3）与链霉亲素sepharose树脂一起孵育（Cytiva ，28935599）。孵育1小时后
，用50 mM HEPES，500 mM NaCl ，pH 7.5，0.03％Tween-20
，一次用50 mM HEPES，500 mM NaCl ，pH 7.5
，pH 7.5和一次带有绑定缓冲液（50 mm HEPES，200 mm NACL ，pH 7.5）洗涤珠两次 。将纯化的AnxA2（S100A）添加到珠连接蛋白中
。孵育1小时后
，将珠子用结合缓冲液洗涤四次，并在结合缓冲液中用50 mM生物素洗脱蛋白质。通过SDS -PAGE分析洗脱蛋白 ，然后分析Coomassie Blue染色 。 　　对于用CCR4 – NOT亚基的全长抗性的下拉
，纯化的HIS6-MBP抗抗菌 - 抗链球菌或HIS6-MBP – Strepii被固定在链链球菌琼脂糖树脂上的C-末端strepii标签中，将其固定为诱饵
。然后 ，在恒定搅拌下
，在6°C下，将250 pmol的诱饵蛋白在下拉缓冲液（50 mM HEPES pH 7.5 ，200 mm NaCl，0.03％（v/v）Tween-20）中孵育1小时。两次用下拉缓冲液洗涤后
，除去未结合的蛋白质，并将500 pmol的NOT9模块与珠连接蛋白一起孵育1小时 。最后 ，用下拉缓冲液洗涤珠子三次
，并使用补充有50 mm生物素的下拉缓冲液洗脱结合的蛋白质
。使用SDS -PAGE分析洗脱蛋白，然后进行Coomassie Blue染色。 　　慢病毒是由HEK293T细胞用PLIP构建体转染的HEK293T细胞（MCHERRY或HUMAN CORSIS ，未加入或N/C末端HA标签）
，如上所述的BMM转导所述 。病毒被覆盖到Blaer1细胞上，随后选择纯嘌呤霉素并如前所述进行区分29。分化5天后 ，用2.5μgml -1强力霉素和新鲜细胞因子刺激Blaer1细胞过夜
。第二天加入具有新的细胞因子
，新鲜的强力霉素和ADU-S100的培养基，最终浓度为5μgml-1（aduro）。在指定的时间点 ，收集粘附和非粘附细胞
，并在TRK裂解缓冲液（Omega Biotek Total RNA试剂盒）中进行RNA分离 。如上所述，将RNA从裂解物中尽快分离出来 ，并如上所述转换为具有上标试剂和RNase抑制剂的cDNA
。 　　为了对BMM的抗性分析，用抗性构建体或MCHERRY转导BMM
，并用强力霉素处理，然后进行DMXAA处理 ，如上所述。在图中指示的时间点收集了细胞（0.6×106–2.4×106）
，并在300–600μL裂解缓冲液（50 mm Tris-HCl pH 7.5，0.2％NP-40 ，5％NP-40
，5％甘油，5％Nacl ，100 mm Nacl
，100 mm Nacl，1.5 mmgcl2 ，1 min min）中裂解在ICE上裂解 。通过在4°C下以18,213g离心30分钟来阐明裂解物
，并使用二氨酸酸测定法对裂解液进行定量，以确保大约相等的输入蛋白
。在Laemmli缓冲液中稀释了十分之一的澄清裂解物以进行输入样品。将上清液与抗HA磁珠（Thermo Fisher Scientific ，88836）一起在4°C下旋转3 h 。然后将带有裂解液的珠用裂解缓冲液（每洗1毫升）洗涤3次，然后通过煮沸5分钟将免疫沉淀的蛋白在30-50 mL Laemmli缓冲液中洗脱
。然后通过免疫印迹分析样品。 　　为了对BMMS75的FLAG-TTP进行IP分析
，如上所述将N端标记的小鼠TTP构建体克隆到PLIP中 。根据制造商的说明，使用Lipofectamine 2000 ，将小鼠FLAG-TTP转染为具有N末端HA标签的小鼠抗的HEK293T细胞的半融合10 cm板
。600 ng的TTP构建体与6μgmCherry共转染
，660 ng的TTP构建体与6μg抗性共转染。转染后，用强力霉素处理细胞以诱导表达24小时 ，然后在PBS中收集 。将细胞在低渗性裂解缓冲液中裂解
，该缓冲液由10 mM Tris-HCl pH 7.5
、10 mM NaCl，2 mM EDTA ，0.5％Triton X-100和蛋白酶抑制剂在冰上旋转10分钟。然后将NaCl调节至150 mm
，并用30μg的RNase A在冰上用涡旋处理20分钟
。通过在4°C下以18,000克离心30分钟来阐明样品，将10％的样品作为输入样品 ，并在Laemmli缓冲液中稀释。将样品与50μL的Sigma抗FLAG M2琼脂糖珠（Sigma Aldrich
，M8823）在裂解缓冲液中平衡，并调整后NaCl ，并重悬于200μl裂解缓冲液中，每反应调节NaCl 。将样品与珠子在4°C下旋转2小时孵育2小时
，然后用1 ml洗涤缓冲液（50 mM Tris HCl pH 7.5，300 mM NaCl ，0.05％Triton X-100
，蛋白酶抑制剂）洗涤五次
。将其余的液体完全从珠子中完全吸入，并用小孔针头将珠子重悬于2×Laemmli缓冲液中 ，然后在洗涤缓冲液中稀释
，然后通过免疫印迹分析。 　　在4-12％的Bis-Tris蛋白凝胶（Invitrogen）上运行在Laemmli缓冲液中稀释的样品，然后在35 V下转移至PVDF膜90分钟 。在Odyssey Licor PBS阻断缓冲液或在TBST中稀释的2–5％的非脂肪干牛奶中 ，膜被阻断
。然后用4°C的抗体在5％BSA TBST中稀释的膜探测膜。这项研究中使用的抗体如下：大鼠抗HA（Roche
，3f10，1186742300 ，1：1,000）
，小鼠抗肌动蛋白（Santa Cruz Biotechnology，SC-477778 ，1：1,000）22503-1-AP，1：500）
，兔子抗TTP（Millipore Sigma，Abe285 ，1：1,000）
，兔子抗CNOT11（Sigma-Aldrich，HPA069823 ，0.4μgml-1）
，rabbit Anti-Zfp36l1（Celli-Zfp36l1）（ABCAM，AB70775 ，1：1,000）和兔子抗SP140（如前所述4; 1：1,000）和Flag – TTP IPS（Thermo Fisher Scientific
，PA1-984B，1：1,000）的兔子抗flag 。 　　如先前所述进行4
。简而言之 ，将JR32ΔFLAAL.肺炎（来自D. Zamboni的实验室）从冷冻的甘油汤中连接到BCYE板上。单个菌落被用来条纹大约4 cm2贴片
，随后生长2-3天 。将细菌在水中稀释，并在600 nm处测量光密度以确定细菌浓度
。然后将细菌稀释至无菌PBS中每毫升2.5×106细菌的终浓度。通过腹膜内注射将小鼠用甲基嗪和氯胺酮的混合物麻醉 ，然后在鼻内给予40μl稀释的细菌（最终传染剂量为105种细菌） 。感染后96小时，将小鼠安乐死
，并将肺在5 mL高压灭菌的Milliq水中匀浆。将肺匀浆稀释并在BCYE板上铺板，并在生长4天后列举了菌落形成单元
。进行了一种SP140 - / - 抗1/2+/+和SP140 - / - 抗1/2 - / - 同窝工的感染 ，这重现了用非静电材料感染获得的结果。 　　Alphafold-Multimer（V.2.3.2）76是在由Cal Cryo Em设备托管的设备上运行的
，该设备包括NVIDIA GPU和> 72 TB的存储空间 。小鼠抵抗和CCR4-NOT氨基酸序列来自NCBI（抗性，XP_006517870.1; CNOT1 M-Heat ，XP_036009857.11–695; np_705813.2;简而言之
，使用默认设置的CNOT1 M-Heat，CNOT9或CNOT1 N-MIF4G/CNOT10/CNOT11在多聚机模式下以多聚机模式运行 ，最大模板日期指定为2023-01-01和-DB_PRESET = full_dbs
。在Chimerax（v.1.6.1）中可视化输出模型
，并使用MatchMaker命令对齐。用PLDDT颜色的PAE图和结构用PaeViewer（v.1.0）77可视化 。 　　将BMM收集在PBS中，并用Cas9 2 NLS核酸酶（Synthego）与GRNA（Synthego ，Sgrna EZ套件）和Alt-R Cas9电穿孔增强剂（IDT
，1075916）在LONZA P3 Buffer（Lonza，v4xp-3032）中与Bufferer的描述
。使用LONZA 4D-Nucleofector核心单元（AAF-1002B）使用程序CM-137进行电穿孔。电穿孔的BMM立即将其铺在BMM培养基中 。每2天进行骨髓收集后的第10天进行半中间的交换 ，当时BMM被播种以进行下游测定
。通过对靶向区域的基因组DNA进行免疫印迹或PCR分析来评估敲除效率，然后进行冰分析（Synthego）
，如图图例所示。GM21188（抗1）用Prirestar PCR试剂和底漆F1（AttGagaAatccgttgTaAtggg）和R1（taggcgaatttcgtggcacaca）根据制造商的指示，其指令具有55°C的退火温度 ，或使用Q5 PCR Reagens F2
，根据制造商的指示（TTGAGAAATCCGTTGTAATGGG）和R2（GCCTTTCTCCGGATTCACGA），具有循环条件：98°C 3分钟；35个98°C的循环10 s ，63.5°C 20 s和72°C 1分钟5 s 。将GM36079（抗2）用F（TggtattCtctCtctCtagataAcatCacagcCtacttactcc）和R（CCTCCCCCTCGCCATCACTGCCTG）使用phusion GC PCR试剂进行：98°C的30 s
，30-35 cycles for 98°C，使用98°C的98°C ，使用GC PCR试剂和循环条件为：98°C
，为98°C，72°C持续1分钟
。RC3H1的破坏由PCR（F ，f
，cacactatgctgctgactgtatctacagaag; r，tcccctcctcctcaggtaaaaacagtgc; cycling：98°C持续30 s ，然后持续30 s，然后30个循环98°C的98°C
，60 s，60°C ，持续5 s和72°C
，使用1分钟phcccr gc gc gc gc gc gc gc gc gc phccr gcccr gc gc phccr。RC3H2的破坏由PCR（Q5 PCR试剂，F2 ，Agggcataagatgtgcacaga; R2
，ActgctaAccccgagcatcag;和98°C的循环3分钟，然后循环3分钟 ，然后在10 s
，60 s，60°C的20 s和72 c中 ，然后进行35个循环35个循环 。通过凝胶提取
，Ampure XP珠（Beckman Coulter）清洁PCR 或在提交Sanger测序之前使用快速AP和EXOI进行处理。使用Synthego ICE在线工具（https://ice.editco.bio/#/）进行冰分析
。这项研究中使用的GRNA序列如下：GM21188/GM36079 GRNA 1，GCUGGGGGCCUCUUGCACCAGA；GM21188/GM36079 GRNA 2 ，CGACGAUGGCGGUGACUACC;CNOT1 GRNA 1，ugugaaucggcacgguccug;CNOT1 GRNA 2
，Acucauucagauaacaga;CNOT11 GRNA 1，UCCAUCAAGGCAAUCGCG；CNOT11 GRNA 2 ，gcugagagaucaucucgggg;CNOT9 GRNA 1
，cauugcaaacucuguuagac;CNOT9 GRNA 2，GCCUACUGCACUAGCCCAAG；ZFP36 GRNA 1 ，Caugaccugucauccgacca;ZFP36 GRNA 2
，cuucauccacaacccccccg;ZFP36L1 GRNA 1，AAAAAUGGUGGCGGACACGA;ZFP36L1 GRNA 2 ，ACGGGCAAAAGCCGAUGGTG;ZFP36L2 GRNA 1
，CAAGAAGUCGAUAUCGUAGA;ZFP36L2 GRNA 2，GagagcggcaCgugCaagua;RC3H1 GRNA ，CAAAUGGGCAAGCCUUACGG；RC3H2 GRNA
，ucgguuuuauucaagc。 　　底物RNA是通过体外转录（IVT）产生的 。对于IFNB1 WT RNA底物，将IFNB1 mRNA（GenBank：NM_002176.4;核苷酸740–825）的3'-UTR中的基因合成为基因片段（Azenta） ，并与上游T7启动子和17个随机核核底细胞合成
。对于IFNB1-MUT RNA底物，将核苷酸758和825之间的所有腺苷残基突变为胞嘧啶。通过PCR扩增基因片段
，并使用Hersibr T7高产量RNA合成试剂盒（NEB）将纯化的PCR产物用作IVT的模板 。通过在含有10 mM HEPES pH 7.5，200 mm NaCl的缓冲液中 ，通过尺寸排斥色谱分离IVT产物
，将IVT产物分离出10/300 GL
。合并包含完整RNA底物的馏分，沉淀乙醇并重悬于无RNase水中。电泳迁移率转移测定法（EMSA）结合反应包含50 nm底物RNA和50–800 nm TZF蛋白 。在37°C的缓冲液中 ，在包含20 mm管道pH 6.8、10 mM KCl
，40 mm NaCl，2 mm mg（OAC）2 、3％（v/v）Ficoll 400和0.05％（V/V）NP-40的缓冲液中进行15分钟
。通过电泳在0.5×tbe缓冲液中的非肾化聚丙烯酰胺凝胶上通过电泳分析RNA - 蛋白质复合物 ，在10 v cm -1时
，pH 8.3，pH 8.3。在分析之前 ，将凝胶用1×SYBR金（Thermo Fisher Scientific）在0.5×TBE pH 7.5中染色5分钟 。使用fiji79量化图像
。 　　如上所述生成第7天的BMM
，并在非组织文化处理的12孔板中以指示的感染性多种感染感染了250,000个细胞。对于MCMV-GFP和MHV68-GFP，将细胞在无血清的无PPMI中感染3-4小时 ，并补充了少量接种物的青霉素 - 链霉素和谷氨酰胺 。MCMV-GFP和MHV68-GFP是L. Coscoy和B. A. Glaunsinger的礼物。MHV68-GFP and MCMV-GFP titre was estimated by infection of 3T3 cells, and calculated by the assumption that a viral dilution resulting in 100% of infected 3T3 cells corresponds to an approximate multiplicity of infection of 5. For Sendai-GFP infections (ViraTree), cells were infected for 1.5 h in serum-free RPMI supplemented with penicillin–streptomycin and谷氨酰胺在低水果体积中
。感染后，将培养基替换并在PBS中收集细胞之前培养培养基20-24小时
，并用幽灵染料染色Far Red 780染色，并根据套件的说明固定在BD细胞胞质细胞处理中 ，然后用流式细胞仪洗涤和分析。使用FlowJo分析数据 。 　　在缺乏抗生素的BMM培养基中
，将BMM在玻璃盖玻片上播种在0.5×106和1×106之间，并过夜
。用100μgml-1 DMXAA刺激BMM ，固定在4％新鲜制备的多聚甲醛（电子显微镜科学）中
，在室温下固定10分钟，然后在新鲜制造的0.2％Triton X-100和0.2％BSA中透过冰上的PBS中的PBS冰上10分钟。将盖玻片用PBS洗涤3次 ，然后在山羊血清和FC-Block（Trustain FCX Plus
，抗小鼠CD16/32）中封闭1小时，然后在4°C下在4°C下在PBS稀释的PBS中孵育过夜 ，该抗体在具有1％Tween-20和1％BSA的PBS中稀释 。初级抗体和稀释液为小鼠抗PML（Millipore Sigma
，05-718，1：100） ，大鼠抗HA（Roche，11867423001
，1：200），兔子抗抗原蛋白（ABCAM ，ABCAM
，AB1666630，1：100）
。将盖玻片在PBS中洗涤3次 ，然后在辅助抗体中孵育1：1,000的二次抗体
，在室温下为1％Tween-20和1％BSA，在PBS中稀释1：1,000 ，持续2-3小时。所使用的二抗是驴抗抗鼠Alexa Fluor 488（Invitrogen
，A21208），山羊抗小鼠Alexa Fluor 647（Invitrogen ，A21236）
，山羊抗兔647（Life Technologies，A21244） 。在三个PBS洗涤盖玻片后 ，将核在室温下以1μgml -1在PBS中的1μgml -1染色10分钟，然后洗涤三个PBS
。盖玻片安装在Vectashield安装培养基中（Vector Laboratories
，H-1000-10）。然后将盖玻片边缘用透明的指甲油密封，然后以×63放大倍率在Zeiss LSM 880 NLO AxioExaminer上进行成像 。 　　对于图传说中所示的独立实验 ，Imaris文件转换器v.10.0.1处理Z堆栈
，然后由Imaris Stitcher v.9.9.1
。图像是高斯过滤（0.132μm），并生成用于数字的屏幕截图。DAPI ，HA – SP140
，PML和纤维蛋白的表面在Imaris中使用HA – SP140，PML和Fibrillarin表面和5μM的DAPI表面生成Imaris 。然后出口表面统计。首先将表面滤波为DAPI+（在低于平均DAPI表面的平均荧光强度之内） ，然后按大小过滤（超过0.2μm3）
。如果HA – SP140表面的纤维蛋白强度平均值在2s.d之内
，则认为HA – SP140 NB被认为重叠纤维蛋白。纤维林表面的平均荧光强度，反之亦然 ，纤维蛋白表面与HA – SP140表面重叠 。重叠的相同标准应用于HA – SP140和PML表面
。对于每个独立实验
，计算了100多个核的表面的平均荧光强度。 　　在独立的实验中，除了HA – SP140剪切和Alphafold预测外 ，所有结果均至少两次重复 。除RNA-SEQ，ATAC-SEQ和CUT＆RUN实验外
，所有实验的统计和图是使用GraphPad Prism（V.10.0.2）生成的
。对于具有两组比较的数据，使用Welch的校正或双向ANOVA使用两尾t检验计算P值 ，如图传说中所述。对于具有两个以上比较组的数据
，使用了方差分析 。我们发现，我们的RT-QPCR数据的残差不是正态分布的 ，因此
，对于这些数据，我们对Log10转换数据进行了ANOVA ，该数据基于Q – Q图生成了更正常的分布式残差
，因此更适合ANOVA测试
。We used one-way Welch’s and Brown–Forsythe ANOVA without assuming data sphericity or equal variance, for data with multiple genotypes and one treatment condition, with a more-conservative post hoc Dunnett’s T3 multiple-comparison correction for log10-transformed data and less-conservative post hoc FDR correction for multiple comparisons (Q = 0.001, two-stage linear step-up procedure of Benjamini,Krieger和Yekutieli）用于所有其他数据。对具有两个以上比较组和/或多个测量时间点的数据进行了双向方差分析，其完整模型在内 ，包括相互作用项
，因为我们发现基因型的效果随时间而变化 。对于双向方差分析，我们没有假设球形性 ，并使用了HOC Tukey的多重比较测试或šidák的多比较校正，如图传说中所述
。对于非正常分布的数据（体内感染的L. pneumophila）
，使用了带有Dunn的多重比较测试的Kruskal – Wallis单向方差分析。所有数据的平均值均已绘制，并以点为单独表示重复 。错误条表示S.E.M.每个图中显示的数据表示提供的源原始数据； 源数据中还提供了统计测试详细信息。在RT -QPCR ，ELISA或病毒感染中的重复表示在实验中的单独孔
，而肺炎乳杆菌感染中的重复表示来自三个组合实验的单个小鼠
。复制数字（n）在数字，传奇和源数据中表示。对于所有实验 ，根据基因型和治疗组对样品进行了分组
，并且未进一步随机 。研究人员没有对实验组视而不见，统计方法没有用于预先确定样本量
。 　　所有原理图都是由R.E.V.在生物体中生成的。可在https://biorender.com/owrrzg2上获得图4H ，https://biorender.com/0kcpnq3和https://biorender.com/rig1le4 for图5H
，以及https://biorender.com.com.com/22n44jit for Exterded Data Dagate for Exterded Data Dig.4Aa 。 　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得
。