如前所述51，对本研究中使用的臀部细胞系进行了验证。SEC61B-MEGFP HIPS细胞系（AICS-0059 Cl.36）是在艾伦细胞科学研究所（https://www.allencell.org/cell-catalog.html）开发的 ，并通过Coriell43分布 。CAG :: Cas9细胞系在实验室进行了基因设计（父母细胞系1205-4在斯坦福大学衍生和表征）
。最初生成了细胞系
，使CAS9表达可以通过添加强力霉素关闭，但是在此屏幕中未使用多西环素。cag :: cas9;DLXI1/2B :: EGFP单元线在CAG :: Cas9系列中生成 。2242-1对照髋关节细胞系用于为屏幕生成HCO ，并在斯坦福大学衍生出1208-2对照髋关节细胞系
。1205-4线的捐助者是一名30岁的女性。2242-1线的捐助者是一名4岁男性 。1208-2线的捐助者是20岁的女性。 　　简而言之
，将臀部细胞保存在涂有重组人玻璃纤维蛋白（Life Technologies，CatalogNo
。A14700）的六孔板中 ，在Essential 8培养基（Life Technologies，CatalogNo。A1517001）中 。为了通过臀部细胞菌落
，将细胞与0.5 mM EDTA在室温下孵育7分钟，重悬于必需的8培养基中 ，并分布在新的六孔板中
。对培养物进行了测试
，并维持不含支原体。通过斯坦福国际审查委员会获得了这些线的推导和使用的批准 。臀部细胞基因组完整性的验证是通过高密度单核苷酸多态性阵列进行的（补充表10）
。 　　我们根据NDD10,11,12,13和SFARI数据库（分数1 、2和综合征）的患者的遗传研究编制了与ASD和其他NDD相关的611个基因列表。为了关注在HSO中表达的NDD基因，我们评估了来自DLXI1/2B :: EGFP+细胞的单细胞RNA测序数据中的基因表达6 。为了确保保守的阈值 ，我们平均每个收集的样品（来自HCO和HSO的组装）的单细胞数据
，并为每个测得的基因绘制了样品之间的最大值
。我们专注于至少一个平均样品中至少最小（定义为大于两个读数计数）表达的425个NDD基因（在611个总数中）。为了确认在发展中的人类前脑中的表达，我们还分析了使用河盆内8-9个概念后的原代人脑的神经节凸起（内侧 ，尾部和外侧神经节大脑）中的大量RNA测序数据 。具体而言
，我们在这些样品中获得了最大平均表达值（每千倍映射的log2读数为每千射线酶，每千座读数为rpkm） ，这在图1a中绘制
。为了可视化NDDS基因的发育表达轨迹
，对RPKM进行了归一化的RPKM（从http://development.psychencode.org/）进行了log2的转换并缩放（使用默认参数中的r v.4.1.2中的比例（使用r v.4.1.2中的比例（）函数）。使用GEOM_SMOOTH（）（如r默认参数在R中实现的R中实现的ggplot2 package v.3.3.6）函数执行数据平滑 。简而言之，此功能使用受限的最大似然方法拟合了惩罚的立方回归样条与数据拟合（通过调用MGCV：GAM（GAM（）R功能 ，具有公式= Y〜S（X，BS =“ CS ”）和方法='REML'）。为了可视化筛选在发展中的人皮层细胞群体中筛选基因的表达
，我们分析了先前发表的从妊娠中期收集的单细胞RNA测序数据
。简要地， 从基因表达式Omnibus（登录号GSE162170）下载了原始基因计数矩阵 ，并使用R软件包SEURAT52（v.4.1.0）的标准工作流进行处理：包括使用Sctransform函数（vst.flavor ='v2'）进行标准化。使用原始出版物提供的细胞类型注释
，我们可以看到中枢神经系统衍生的细胞群体中的HIT基因的标准化基因表达 。 　　如前所述53，CAG :: Cas9线生成
。通过修改AAVS1-CAG-HRGFP（Addgene质粒编目编号52344）并用Cas9替换GFP来构建供体质粒。从addgene（质粒编号41818）获得含有GRNA靶向AAVS1基因座的质粒 。hiPS cells (2 × 106 cells) dissociated with accutase (Innovative Cell Technologies, catalogue no. AT104) were electroporated using the P3 Primary Cell 4D-NucleofectorTMX Kit L (Lonza, catalogue no. V4XP-3024), a 4D-nucleofector core unit and X unit (Lonza; nucleofection program no. CA-137).将细胞播种在六孔板上的孔 ，该井中含有玻璃体蛋白
，并含有补充岩石抑制剂Y27632（10 µM; SelleckChem，SelleckChem ，CatalogNo
。S1049）的预热必需的8培养基。一旦种子细胞达到70–80％的汇合
，在STEMFLEX培养基中（Life Technologies，CatalogNo 。A3349401）中的1 µg ml -1葡萄霉素补充了5天
。在尿霉素中选择的5天结束时 ，可见菌落。将细胞在干flex培养基中再维持5天
，并在涂有玻璃体蛋白的24孔板中拾取单个菌落并分别保持 。将细胞在STEMFLEX培养基中持续4天，然后在Essential 8培养基中膨胀并维持
。Three sets of PCR programs were designed to select colonies that showed the insertion of the left, middle and right parts of the donor DNA (PCR1, 5′-TCCTGAGTCCGGACCACTTT and 3′-CACCGCATGTTAGAAGACTTCC; PCR2, 5′-TATGGAGATCCCTCGACCTG and 3′-CCTGGGATACCCCGAAGAGT; PCR3,5'-TTCTTCTTGATGCTGTGCCG和3'-GCTCAAGGGGCTTCATGATG）。臀部基因组完整性的验证是通过高密度单核苷酸多态性阵列进行的 。 　　CAG :: Cas9臀部细胞在六孔板中培养的细胞被慢跑病毒感染 ，表达DLXI1/2B :: EGFP具有抗霉素耐药基因。在传递前，将细胞保持在必需的8培养基中3天
。传播后的一天
，将200 µg ml -1湿霉素添加到培养基中以选择感染细胞。将细胞在湿霉素中维持9天 。没有病毒感染的对照细胞暴露于200 µg mL -1湿霉素后4天死亡
。存活的细胞扩展并冷冻保存供使用。 　　中间神经元迁移crispr sgrna库的设计是通过选择五个瞄准了438个感兴趣的基因（425个NDD基因和与Interneuron Interneuron发育相关的13个基因）和额外10％的“安全
” Harbour靶向负面对照SGRNA（补充表2）54 。克隆限制位点和放大底漆手柄附加到每个寡聚
。SGRNA库寡素在Agilent芯片寡阵阵列合成平台上合成，并将其克隆到慢病毒质粒载体中 ，该质粒载体组成性地表达了Sgrna和Mcherry。 　　如前所述51
，HCO与无馈物保持的臀部细胞区分开 。为了产生3D HCO，将臀部细胞与ACCUTASE分离以获得单细胞悬浮液
。在补充岩石抑制剂Y27632（10 µm）的必需的8培养基中 ，将约3×106的细胞播种800板孔800板。然后将板以100克离心3分钟
，并在37°C下与5％CO2孵育过夜 。第二天（第0天），将细胞聚集体转移到超低附件塑料菜肴（Corning ，CatalogNo
。3262）中
，并在必需的6个培养基（Thermo Fisher Scientific，CatalogNo。A1516401）中培养 ，并补充了带有反态的辅助（2.5 µm
，Sigma-Aldrich，Catalog catalog catalog .. p5499） ，（10 µm，R＆D系统
，目录编号1614）和XAV-939（1.25 µm，Tocris ，CatalogNo 。3748）。在第1天没有进行培养基变化
。从第2天到第5天
，在E6培养基中培养了器官，在第6天 ，有机体转移到含有神经质A的神经培养基（Thermo Fisher
，CatalogNo。10880022），没有维生素A的B-27补充（100 catalog catalog no.12587） ，Glut.12587
，Glut 。目录号35050061）和青霉素 - 链霉素（1：100，Thermo Fisher ，目录号15140163）
。从第6天到24天
，对神经培养基补充了20 ng mL -1 EGF（R＆D系统）和20 ng ml -1 fgf2（R＆D系统），在前10天 ，每天的介质变化，随后的9天
，每隔一天的变化。从第25天到第43天，将神经培养基补充20 ng-1脑衍生的神经营养因子（Peprotech ，CatalogNo 。450-02）和20 ng ML-1 NT-3（Peprotech
，CatalogNo
。450-03）。从第44天开始，每4天仅使用没有生长因子的神经培养基进行中等变化 。Gellan Gum（大约0.005％ ，Sigma
，目录号G1919-259G，Lot SLCF5726） 从第6天到第15天就添加在培养基中 ，以避免自发的类器官融合55
。HSO与臀部细胞的分化类似于HCO的分化
，以下图案上的差异：从第6天到第11天，EGF ，FGF2和XAV-939（1.25 µM
，Tocris，Tocris ，CatalogNo。3748）被补充为神经介质；从第12天到第24天，使用了EGF
，FGF2，XAV-939和SAG（100 nm ，EMD Millipore
，CatalogNo 。566660）
。从第6天到11号，在培养基中添加了Gellan Gum（大约0.005％） ，以避免自发的类器官融合。 　　为了产生HFA
，单独生成HCO和HSO，并通过将它们靠近24孔低附件板（Corning ，CatalogNo 。3473）放置
，并将其放置在孵化器56中。3天后更改了培养基
。然后将组件在24孔低的附着板中培养，直到使用 ，将板放在孵化器中。对于屏幕和验证
，第45天HSO与第60天的HCO融合在一起，HFA在隔离后大约30天使用HFA进行下游分析 。对于实验成像ER形态 ，如前所述6和HFA组装了第60天的HSO和HCO，如所述
，在组装后的特定天数成像
。 　　CAG :: CAS9; DLXI1/2 :: EGFP髋关节细胞在用慢病毒文库感染前1天用ACCUTASE（5 µg ML -1多紧甲烯）传递。三天后，通过FACS（收集约3.6×106个细胞）选择MCHERRY+细胞 ，然后播种到玻璃纤维蛋白涂层的板上以恢复并膨胀6天 。如上所述
，用这些臀部细胞生成HSO
。我们在第21-23天观察到EGFP+细胞，这表明成功分化。我们还监测了类器官的形态 。在第44天 ，收集了HSO中的HO中间神经元的生成屏幕
。在类似的时间
，HFA是通过与第45天HSO的第40天生成的60天HCA生成的。我们总共产生了1,008个组合 。组装后的30天，在荧光显微镜下检查了HFA是否迁移
。不通过质量控制的HFA（即 ，从HCO侧显示较低的GFP信号）被排除在外。然后将HFA在100毫米板上对齐
，左侧为HSO，右侧HCO对齐 ，并在解剖范围下在组合的边界上分裂 。在荧光显微镜下检查GFP表达后
，分别收集了HCO和HSO。HSO在整个器官中显示出强的GFP信号，而HCO显示出较少的GFP信号
。随后将样品解散 ，并将种群排序并存储在-80°C的冰箱中。我们在8天内处理了大约900个组合物 。此外，收集了从所有板上采样的5×106臀部细胞和第19天的类器官
。FACS门控策略在补充图1中总结了。 　　慢病毒是通过使用聚乙基亚胺（Polysciences
，CatalogNo 。24765-100）转染人类肾脏293T细胞，包装质粒和包膜质粒产生的
。转染后24
、48和72小时收获了转染细胞的培养基。通过在6°C下以17,000 rpm旋转1 h来浓缩病毒 。 　　通过使用Herculase II融合DNA聚合酶（Agilent ，Catalog
，CatalogNo
。600679）扩大和编码慢病毒的SGRNA间隔序列，从每个收集样品的提取的基因组DNA中制备样品特异性测序文库。在Illumina NextSeq 550流动细胞上以450–1,000倍的读取深度汇总样品并测序 。Bowtie v.1.2.2用于对测序读数
。 　　使用Castle Software54分析了屏幕结果54 ，这是一个提供每个基因的最大似然估计器：城堡得分
，一个对数的类似比率，它考虑了每个基因靶向SGRNA的相对富集或耗尽 ，与负面对照效应的分布相比
，castle效应的最大效果，估算了估算的估算值 ，该效应的最大对照组的分布是与另一个样品相比
，给定基因，将基因归一化为阴性对照SGRNA的中位差异。在中间元素中 ，至少两个SGRNA的基因效果小于或等于-1.57或大于或大于或等于+1.57，大约是S.D的两倍 。选择了负面对照和无阈值效果的SGRNA作为候选者。在中间神经元迁移屏幕中
，至少两个SGRNA的基因效果小于或等于-2.5或大于或大于+2.5，大约是S.D的两倍
。选择了负面对照和无阈值效果的SGRNA作为候选者。为了评估屏幕中的SGRNA脱落程度 ，我们评估了我们收集的最终样品中SGRNA的测序覆盖范围 。我们发现
，对于2,402个SGRNA中的93％以上，至少有十个测序计数 ，可用于计算SGRNA54的富集
。此外
，在中间神经元的生成屏幕中，超过96％的SGRNA至少具有100个测序计数 ，而在Interneuron迁移屏幕中
，超过78％的SGRNA至少具有100个测序计数。R V.4.1.1和Python v.3.8.5用于分析测序数据 。 　　将SGRNA（补充表6）克隆到屏幕上使用的同一慢病毒质粒载体中，该屏幕上用组成型表达SGRNA和MCHERRY
。CAG :: CAS9; DLXI1/2B :: EGFP髋关节细胞被表达每个SGRNA的慢病毒感染（带有5μgml -1多甲氧烯）。MCHERRY+细胞被FACS富集 ，并在10 cm的盘子上稀疏地种子
，然后从每个受感染样品中分离出48-60个克隆 。在48孔板中培养细胞（432个克隆）
。通过后，使用DNeasy 96血液和组织试剂盒（Qiagen ，Catalog No.69581）从细胞中提取基因组DNA，并使用GOTAQ G2 G2 FlexI DNA聚合酶（Promega
，Promega，Catalogno。M7805）进行PCR（补充表9） 。通过Sanger测序分析PCR产物
。每个突变体克隆的HET和/或纯合状态是通过冰分析（https://www.synthego.com/products/bioinformatics/crispr-analysis）决定与序列迹线相结合的。在我们分离的432个克隆中 ，有32个克隆未能生成有用的测序数据
，而31个克隆是来自几个菌落的混合克隆 。在369个顽强的克隆中，有217个突变的克隆和152个非突变克隆。 　　为了验证屏幕的候选基因 ，我们通过CRISPR -CAS9系统生成了KO HIPS细胞库
，以获得感兴趣的基因
。设计并通过Synthego设计并合成了针对特定基因早期外显子的三个SGRNA（有关SGRNA序列的补充表6，请参见补充表6） ，以诱导一个或多个片段缺失（扩展数据图4B）。简而言之
，将CAG :: Cas9; DLXI1/2 :: EGFP髋关节细胞与ACCUTASE分离，并将50万细胞与300 pmol的SGRNA和40 pmol的Cas9蛋白（Synthego ，Synthego
，synthego，synthego ，synthego，synthego
，synthego，synthego ，synthego
，synthego，spcas9 2nls nuclease（1,000 pmol）） 。使用P3主要细胞4D-核FectortMX试剂盒L（Lonza ，CatalogNo
。V4XP-3032）
，4D-核对器核心单元和X单元（Lonza，程序编号CA-137）进行核反射。然后将细胞在补充岩石抑制剂Y27632（10 µM）的必需的8培养基中 ，将细胞播种到涂有涂层的六孔板上 。必需的8培养基用于每日培养基
。为了从2242-1和1208-2臀部细胞产生SMAD4和CSDE1 KO细胞
，首先用表达DLXI1/2B :: EGFP的慢跑病毒感染了这两个对照细胞系，然后选择湿法霉素 ，然后选择在DLXI1/2B的对照中稳定地表达EGFP。For genotyping, DNA was extracted from hiPS cells using the DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen, catalogue no. 69506) and PCR was performed with GoTaq G2 Flexi DNA Polymerase (Promega, catalogue no. M7805) with primers to amplify DNA sequence around the sgRNA targeting sites of the gene of interest (Supplementary Table 9).PCR产物通过凝胶电泳分离
，图像实验室（V.6.0.1）用于凝胶图像采集 。 　　来自2242-1遗传背景的SMAD4 HET臀部细胞是由从SMAD4 KO细胞池分离的单个克隆产生的
。要在1205-4遗传背景中生成SMAD4 HET线，CAG :: cas9; dlxi1/2 :: EGFP髋关节细胞与Accutase分离 ，将50万个细胞与40 pmol的SGRNA（Aaaaaaaagaagaagaagaaagaaaguu）（aaaaaagaagaaaaguu）和5 µg cas9 protein casein（ID cas9 casly caseolated DNA Technologies（ID）混合。v3） 。与上述相同的方式进行核反射
。分离单个克隆，并通过Sanger测序确认HET线。 　　使用Dneasy血液和组织试剂盒从HSO中分离DNA（Qiagen
，目录No 。69506）。使用Illumina适配器的引物（补充表7）用于在感兴趣的基因的SGRNA靶向位点附近扩增大约300 bp的DNA序列
。PCR用Primestar Max DNA聚合酶2×Hot-Start PCR Master Mix（Takara Bio，CatalogNO。R045A）进行PCR 。使用Ampure XP PCR纯化系统（Beckman Coulter ，CatalogNo
。A63881）和96S超级磁铁（Alpaqua
，CatalogNo。A001322）纯化PCR产物，用于下一代测序（Azenta） 。 　　如先前所述的57 ，HCO和HSO通过一些修改解离
。简而言之
，将带有96孔板中培养的单器官或在六孔板中培养的多达八个器官）与含有10 U ML-1帕帕因（Worthington，CatalogNO。LS003127）的酶溶液一起孵育（+） - 葡萄糖（Sigma-Aldrich） ，26毫米Nahco3（Sigma-Aldrich）
，0.5 mm EDTA（Sigma-Aldrich），DNase（Worthington ，CatalogNo 。LS002007）
，6.1 mm- CySteine（Sigma-Aldrich）和岩石（SIGMA-ALDRICH）和岩石Inighifor Y27632（37 n27632）二氧化碳持续15分钟；将该溶液在37°C预热30分钟以激活木瓜蛋白酶，然后用预热的蛋白酶抑制剂溶液（1×Earle的平衡盐溶液 ，0.36％（+） - 葡萄糖，26 mM Nahco3
，26 mM Nahco3，26 mm Nahco3 ，0.2％frespinton抑制剂（worthonton
，catalog no
。lsoglag no。ls003086））洗涤细胞 。然后将类器官进行三杆，并以1,200 rpm的速度离心5分钟
。将沉淀重悬于3％BSA（Sigma-Aldrich） ，然后过滤。 　　为了在屏幕期间对MCHERRY+或GFP+细胞进行排序
，在BD-ARIA II仪器（Stanford FACS设施）上进行了FACS 。ACEA Novocyte Quanteon 4025流式细胞仪（Stanford FACS设施）用于分析GFP+细胞的百分比。NovoExpress（V.1.3.0）用于生成流式细胞仪数据
。在FlowJo（V.10.8.1）上分析了数据。 　　为了实时QPCR分析，将2-3个器官合并为样品 。使用Rneasy Mini Plus试剂盒（Qiagen ，CatalogNo
。74136）分离mRNA
，并使用逆转录使用Superscript III III第一链合成Supermix（Thermo Fisher Scientific，CatalogNo。117522550）来制备模板免费DNA 。使用SYBR Green PCR Master Mix（Thermo Fisher Scientific ，CatalogNo
。4312704）在QuantStudio 6 Flex实时PCR系统（Thermo Fisher Scientific
，CatalogNo。4485689）上进行实时QPCR 。使用QuantStudio RT -PCR软件（Applied Biosystems，v.1.7.1）处理数据
。为了绘制热图以呈现QPCR结果 ，将基因表达缩放并平均为中心（使用R中的“比例”函数），并使用“ ConspectHeatHeatMap ”软件包绘制热图。补充表8列出了本研究中使用的引物 。 　　如前所述58
，将清晰的，毫无疑问的大脑/身体成像鸡尾酒和计算分析（Cubic）方法应用于光学清晰的HFA
。简而言之 ，大约40天后的HFA在4°C下用4％多聚甲醛（PFA）固定过夜。第二天
，将样品用PBS（2 H×3，37°C）洗涤 ，然后与37°C的组织清除试剂立方体L（TCI
，目录No 。T3740）一起孵育约18小时。用PBS（2 h×3，37°C）洗涤后 ，将样品在核染色溶液中孵育（1：150 Reddot稀释
，生物40061-T），在37°C下为500 mm NaCl的PBS中孵育过夜
。然后用PBS（2 H×2 ，37°C）洗涤样品
，然后与HEPES-TSB（10 mM HEPES，10％TX-100 ，200 mm NaCl，0.5％BSA）在37°C孵育2小时。随后将样品用抗GFP抗体（GTX13970
，1：1,000）染色48小时，并进行二级抗体（Alexa Fluor 488 Affinipure驴驴抗Chicken Igy ，Jackson Immunoresearch Catalog No 。703-545-155
，1：300）
。在HEPES-TSB缓冲液中制备抗体，并在PBS（2 H×2 ，37°C）中用10％TX-100洗涤HFA
，在污渍之间制备HEPES-TSB（2 H×2，37°C） ，Hepes-TSB（2 H×1
，37°C）洗涤。继发抗体染色后，将样品用10％TX-100在PBS（30分钟×2 ，37°C）和PBS（1 H×1
，37°C）中洗涤，然后在室温下以1天的温度与50％和100％的组织清除型试剂（TCI ，Catalogno 。T3741）一起孵育50和100％的组织清除型试剂+（TCI）
。所有孵化步骤均在振动板上进行。将样品转移到带有清晰底部的96孔板中（同上，目录
，89626），并在Cubic-R+溶液中转移到Leica Stellaris共聚焦显微镜上的×10物镜 。将整个HCO和HCO-HSO边界成像（每HFA大约1 mm体积） ，以盲目地与样品的基因型成像
。 　　用Imaris（Oxford Instruments
，v.9.7.0）和斐济（ImageJ，V.1.0和V.1.53F51）分析图像。简而言之 ，在Imaris中编辑了Z-stack共聚焦图像
，以生成HFA的3D重建 。使用核染色信号（大约每40帧）手动划定单个帧中组合的边界；这些边界用于创建IMARIS“表面
”来定义HCO（补充视频1）
。然后，使用斐济中的最大强度函数将3D HCO简化为二维（2D）投影。为了以一致的方式测量DLXI1/2B :: EGFP强度 ，HCO-HSO边界是垂直对齐的 。与边界相邻的HCO的三分之一用于量化平均强度。还测量了平均强度的代表性区域
，并从HCO的测量值中减去
。 　　使用RIPA缓冲液系统（Santa Cruz，CatalogNO。SC-24948）制备全细胞蛋白裂解物 ，用于LNPK
，Syncrip和Terf2印迹 。对于CSDE1和SMAD4，使用SDS缓冲液（1.5％SDS ，25 mM Tris pH 7.5）制备样品中的全细胞蛋白裂解物
。简而言之，将50 µL的SDS缓冲液添加到1.5 mL管中的两个球体中。使用超声波（Qsonica Q500 Sonicator;脉冲3 s on
，3 s off;振幅20％）对样品进行超声处理7-9 s，直到样品不再是粘性为止 。使用二氨酸酸测定法（Pierce ，Thermo Fisher
，CatalogNo
。23225）对蛋白质浓度进行定量。对于电泳，将每条车道的20μg蛋白质加载 ，并在4–12％的Bis-Tris Page凝胶上运行（螺栓4–12％Bis-Tris蛋白凝胶
，Invitrogen，CatalogNO 。NW04122Box） ，并转移到聚乙烯基二氟化物膜膜上（Immbrane-brane-brane-Fore）上（Immbilon-fore）
。Membranes were blocked with 5% BSA in tris-buffered saline with Tween (TBST) for 1 h at room temperature and incubated with primary antibodies against TERF2 (rabbit 1:2,000, Novus Biologicals, catalogue no. NB110-57130SS), SYNCRIP (mouse 1:2,000, MilliporeSigma, catalogue no. 05-1517), Atlastin-1（鼠标
，1：500，Sigma ，CatalogNo。Mabn1831
，克隆3194）和GAPDH（3-磷酸甘油醛脱氢酶）（鼠标，1：5,000 ，Genetex，Genetex
，Catalogno 。GTX627408）过夜且LNPK（cabbit，1：500） ，1：500）CSDE-1（兔子
，1：500，ABCAM ，目录号AB201688）和SMAD4（鼠标1：250
，Santa Cruz Biotechnology，CatalogNo
。SC-7966）在4°C下持续72 h。将膜用TBST洗涤3次 ，然后与近红外荧光团偶联物种特异性二抗孵育：山羊抗小鼠IgG多克隆抗体（Irdye 680rd
，1：10,000（Irdye 800CW，1：10,000 ，Li-Cor Biosciences
，目录号926–32211） 在室温下持续1小时 。二级抗体应用后，用TBST将膜洗涤3次 ，一次用TBS洗涤，然后使用Li-Cor Odyssey Clx成像系统（LI-COR）成像
，并带有Image Studio Software（Licor，v.5.2）。使用Image Studio软件（Licor ，v.5.2）或ImageJ（v2.3.0）分析蛋白质印迹
。请参阅源数据以获取完整印迹。 　　在室温下
，将臀部细胞固定在4％PFA-PBS中20分钟 。将HSO和HFA固定在4％PFA-PBS中，在4°C中过夜 ，然后在30％蔗糖中脱水3天
。随后
，将样品嵌入最佳切割温度（OCT）化合物（Tissue-Tek Oct Compound 4583，Sakura Finetek）和30％的蔗糖– PBS（1：1）中 ，用于冷冻（25-μm-thick extions）使用Leica Cryostat（Leica
，Leica，Catalogno。Cm11860） 。对于免疫荧光染色 ，用PBS洗涤冷冻切片以去除多余的OCT
。将固定的臀部细胞和冷冻切片在10％正常驴血清（NDS）（Milliporesigma
，CatalogNo。S30-M）和0.3％Triton X-100（Milliporesigma，CatalogNO 。T9284-100ML）中封闭 ，在室温下在PBS中稀释1小时
。然后将切片在4°C下与含有10％NDS和0.3％Triton X-100的PBS稀释的原代抗体一起孵育过夜。PBS用于洗涤多余的初级抗体，并将冷冻切片与含有10％NDS和0.3％Triton X-100的PBS中的二抗孵育1小时 。使用以下主要抗体进行染色：抗切断的caspase-3（ASP175）抗体（1：500稀释
，兔子，细胞信号技术 ，目录号9661）
，抗SOX2抗体（1：200no
。ab104224），抗GFP抗体（1：1,000稀释 ，鸡
，遗传学，目录号GTX13970）和抗LNPK抗体（1：500 ，兔子
，Sigma，Sigma ，catalogno。HPA014205） 。Alexa Fluor 488 Affinipure驴抗chicken Igy（杰克逊免疫搜索
，目录号，703-545-155）和Alexa fluor 568驴抗兔IgG（H＆L）高度跨吸附的二级抗体（热渔民科学抗体）IgG（H＆L）高度跨吸附的二级抗体（Thermo Fisher Scientific ，CatalogNo。A32849）和Alexa Fluor 647驴抗小鼠IgG（H＆L）高度交叉吸附的二级抗体 （Thermo Fisher Scientific，目录A31571）在1：1,000稀释中使用
。用Hoechst33258（Thermo Fisher Science
，目录H3569，1：10,000稀释）可视化核。使用Aquamount（Polysciences ，CatalogNo 。18606）将固定的臀部细胞和冷冻切片安装在载玻片上
，并在Leica Stellaris共共聚焦显微镜上成像
。Las-X（Leica）软件用于获取显微镜数据。图像用斐济处理（ImageJ，v.1.0 ，v.2.3.0） 。通过从每个独立实验中成像三个随机选择的菌落来量化CCASP3+臀部细胞的分数
。通过对每个HSO的至少三个部分进行成像来量化HSO中CCASP3+
，SOX2+和NEUN+细胞的分数。在背景减法之后，使用Hoechst通道上的阈值和流域算法鉴定了核 。计算了每个通道内确定的核区域内的平均荧光强度
。从同一批次的样品中使用了相同的截止 ，以区分阳性细胞。将来自同一类器官的许多部分的数据进行平均
，然后在图中呈现 。 　　为了成像DLXI1/2B :: EGFP+细胞迁移，将HFA转移到了在500 µL神经培养基下（37°C ，5％CO2）的500 µL神经培养基中的96孔板的孔（IBIDI
，目录，89626）
。在共聚焦显微镜（Leica ，CatalogNo。SP8）上成像之前，将样品放置在这种情况下30-60分钟 。HFA在×10物镜下以50–150μm的深度进行成像
，每帧大约20分钟的速度为18–22 h。Fiji（ImageJ，V.1.0）用于量化DLXI1/2B :: EGFP+细胞的迁移
。为了估计单个盐的长度 ，鉴定出显示soma肿胀的DLXI1/2B :: EGFP+细胞
，并手动测量了与核代动物后SOMA新位置的距离（以μm为单位）。这种运动所需的时间用于计算盐频率 。在分析中，只有在成像过程中至少显示了至少两个完整跳跃的细胞 ，并且在统计分析中使用了每个细胞的平均盐长度
。分析对基因型进行了盲目进行。 　　为了成像Sec61b-MEGFP+细胞
，在环境控制的条件下（37°C，5％CO2） ，在共公共共聚率显微镜（leica Zercoom）上（leica Zertelliis
，leica stellaris actellaris，ac s race stellaris acy×20 20） ，在环境控制的条件下（37°C
，5％CO2）在环境控制条件下成像了HFA（SEC61B-MEGFP+ CTL，CAS9-CTL ，LNPK KO或ATL1 KO HSO） 。成像之前，将样品放在受控环境中1小时
。将样品的深度大约为12μm
，每帧10分钟的速率成像约20小时。鉴于×20物镜的工作距离短，并且3D浮动样品的性质 ，仅使用样品底部的图像 。获得每个HFA的一到三个图像进行分析
。排除包含密集包装的快速移动细胞的图像。为了分析HCO或HSO中的盐性迁移细胞的百分比显示出ER的位移
，选择了SEC61B-MEGFP+细胞显示出盐的迁移，在成像过程中选择了至少两次跳跃 ，并且在主要的核易位之前显示ER肿胀的细胞被认为是ER位移（如果认为这是ER的位移）
，则表现出了ER的位移（如果这是一个振奋物） 。包括至少三个盐酸移动细胞的HCO或HSO，以分析“ ER位移的细胞百分比”
。当估计SEC61B-MEGFP+迁移细胞的盐长度和盐频率时 ，使用了类似于测量DLXI1/2B :: EGFP+迁移细胞的策略。包括至少两个完整跳跃的细胞 。Fiji（ImageJ
，V1.0和V1.53F51和ImageJ2，V.2.3.0/1.53Q）用于分析SEC61B-EGFP+细胞的迁移。基因型的盲目用于分析
。 　　When examining Dlxi1/2b::mScarlet virally labelled hFA (SEC61B-mEGFP hSO assembled with unlabelled hCO), Dlxi1/2b::mScarlet+ cells were identified by the florescence signal filling the entire soma and extending to the leading branch (SEC61B-mEGFP hiPS line also expresses mTagRFP-T tagged LMNB1, which was在成像Mscarlet时被捕获）。如上所述 ，根据SEC61B-MEGFP信号检查了ER位移 。 　　HFA（sec61b-megfp HSO与未标记的HCO组装在一起）被编码DLXI1/2 :: MSCARLET的慢病毒感染
。简而言之
，在组装后30天，在24孔低固定板中培养的HFA用500μl的神经培养基在37°C下用5％CO2培养病毒过夜。第二天 ，添加了新鲜的神经介质（500μl） 。第二天，将培养基替换为新鲜培养基
。样品已准备好在感染后2周进行现场成像。 　　本研究中使用的ASO由IDT（/52moerc/*/i2moert/*/i2moert/*/i2moert/*/i2moerc/*/i2moerc/*a*a*a*a*c*c*c*c*c*c*a*a*a*a*a*a*a*a*a*a*a*a*a*t*a*a*a*a*t*/i2moert/i2moert/i2moert/i2moert/i2moert/i2moert/i2moert 。将ASO以1 mm的浓度在无核酸酶的水中重构
，然后在-20°C下储存
。在实验中，将用神经培养基稀释的5μMASO应用于HFA。 　　解剖了E13 -E14 CD1小鼠胚胎（未进行基因分型）的大脑 ，嵌入4％的低熔融温度琼脂糖中
，然后将其分割为汉克斯的平衡盐溶液（HBSS），补充了葡萄糖 ，葡萄糖补充了葡萄糖（100 ml
，100 ml CA或MG，2.5 mg ，1.5 ml of 1 m l of 1 m hbs
，1 m l.hbs of 1 m ph of 1.ml ph 7.4m n.4 g 。10毫升100毫米CaCl2，10毫升100毫米毫米毫米和4毫升1 M NAHCO3）或ACSF（125 mm NaCl ，2.5 mm KCl
，1 mm MGCl2，2 mm MgCl2 ，2 mm CaCl2，1.25 mm Nah2po4
，1.25 mm Nah2po4，25 mm Nahco3 ，25 mm Nahco3
，25 mm glucose and carben carcen and carcen carbegen carbegen carbegen carbegen carby carby carbled carbled carbled carbled carbled carbled an狮子纤维纤维组
。接下来，将300μm的冠状切片置于含有切片培养基的组织培养皿中（31％HBS ，60％的基础培养基鹰
，5％FBS，1％葡萄糖 ，1％N2补充剂（Thermo Fisher Scientific）
，1％Glutamax（1％Glutamax（Thermo Fisher Fisherific）controptorycorconiccincincincincincincincincincincincincincincircin和1％strepticcin。使用无菌，拉动的玻璃微管 ，在局部与CAG驱动的GFP质粒（PCAG-IRES-GFP
，C 。Cepko的礼物，通过Addgene ，质粒编号11159，11159
，Ref。59）一起将神经节透介到本地共同注射
。使用BTX平方脉冲电孔器在50 V处用水平方向的桨电电极对随机采摘的切片进行电穿孔，然后在Millicell Cell培养物（Millipore Catalog NO. PICM03050）上在空气液体界面上生长3天 ，直到实时成像或实时成像或实时QPCR。为了确定LNPK敲低的效率
，将切片仔细地分解为隔离含有EGFP表达EGFP细胞的区域，然后将其直接放在裂解缓冲液中以进行RNA提取（Qiagen rneasy Micro Kit） 。根据国立卫生研究院（NIH）进行动物实验 根据斯坦福大学实验室动物护理行政小组和加利福尼亚大学 ，旧金山机构动物护理和使用委员会批准的协议指南
，指南的实验动物指南
。将小鼠以12 h/12 h的光/黑暗周期饲养在动物设施中，湿度为20–22°C（68–72°F） ，湿度为30–70％。有关用于在扩展数据中生成条形图的数据
，请参见源数据5图6 。 　　除非另有说明，否则用GraphPad Prism（v.9.1.0）分析数据
。除非另有说明 ，否则数据表示为平均值±S.E.M.。原始数据的分布测试了分布的正态性 。使用学生的T检验
，Mann-Whitney测试，Kruskal-Wallis检验和一单或双向方差分析（ANOVA）进行统计分析 ，并使用多重比较测试进行了指示
。样本量通过经验估计。基因型的失明用于成像分析，流式细胞仪分析和器官大小测量 。 　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得
。