VEOE6/TMPRSS2（JCRB 1819）细胞31,50在存在1 mg Ml -1遗传素（G418; Invivogen）和5μgml -1等离生蛋白预苯甲酸（Invivogen）的情况下传播。在补充10％FC，10 mM HEPES pH 7.3和100 U ML-1的青霉素 - 链霉素 ，10 µg ML-1的puly霉素的DMEM中培养Vero-HACE2-TMPRSS2细胞 。VEOE6/TMPRSS2和VERO-HACE2-TMPRSS2细胞在37°C下使用5％CO2保持 。
将中国仓鼠卵巢（CHO）细胞保持在含有10％FC和抗生素的DMEM中 ，在37°C下，使用5％CO2。在8％CO2下 ，将EXPI293F细胞（Thermo Fisher Scientific）保持在37°C的Expi293表达培养基（Thermo Fisher Scientific）中 。使用PCR定期测试细胞对支原体污染的测试 ，并确认不含支原体 。
获得知情同意后，从SARS-COV-2感染的个体中收集了呼吸标本 ，并从Covid-19-19的康复个体和疫苗中收集血浆标本。该研究方案得到了东京大学医学研究所研究伦理审查委员会的批准（批准编号：2019-71-0201和2020-74-0226） 。
获得知情同意后 ，从接收mRNA疫苗BNT162B2（辉瑞-biontech）的个体中收集了标本，与SARS-COV-2（IASO）同类研究的免疫相关 。该研究方案得到了密歇根大学医学院的机构审查委员会的批准（协议编号HUM00184533）。
HCOV-19/日本/UT-NCD1288-2N/2022（OMICRON BA.2; NCD1288） ，HCOV-19/JAPAN/ut-HP353-1N/2022（OMICRON BA.2; HP353; HP353） ，HCOV-19/JAPAN/JAGAN/JAGAN/JAGAN/UT-HP354-1N/20222（OMICICRON BA.2; 254）HCOV-19/日本/TY40-385/2022（OMICRON BA.2; TY40-385），HCOV-19/JAPEN/NC928-2N/2021（OMICRON BA.1; NC928）15 ，HCOV-19/HCOV-19/HCOV-19/USA/USA/WI-WIWSLH-2221686/2021（OMICRON BA）WI221686）15 ，HCOV-19/日本/NC929-1N/2021（Omicron BA.1.1; NC929）39，SARS-COV-2/UT-HP095-1N/HUMEN/HUMEN/HUMEN/2020/TOKYO/TOKYO（D614G; HP095; HP095; HP095; HP095）31，HCOV-31 ，HCOV-COV-19/MD-HPA/MD-HP02/M. MD-HP02/USA/USA/USA/USA/USA/USA/USA/USA/USA/USA/USA/USA/USA/USA/USA/USA/USA;HP01542） ，HCOV-19/USA/WI-UW-5250/2021（Delta; UW-5250）和SARS-COV-2/UT-NC002-1T/HUMAN/2020/TOKYO（NC002）在VPMFM（Thereo Fisher Scientixic）中的VerOE6/TMPRSS2细胞中播种 。先前描述了带有取代的SARS-COV-2/USA-WA1/2020（WA1/2020）重组菌株（D614G） 。如上所述，BA.2（NCD1288） ，BA.2（HP353） ，BA.2（HP354）和BA.2（TY40-385）遭受了NGS的所述15,52的约束。
所有具有SARS-COV-2的实验均在东京大学的增强生物安全3级（BSL3）遏制实验室中进行，日本的日本传染病研究所批准了这种使用 。华盛顿大学的动物研究使用适当的个人保护和正压呼吸器在经认可的A-BSL3设施中进行 。
用于基因合成的以下人单克隆抗体的重链的可变区域的氨基酸序列用于基因合成：克隆Tixagevimab（COV2-2196/AZD8895; GenBank访问; GenBank访问量6XDG_B和6XDG_D） ，Cilgavimab（COV2-2130/AZD1061; GenBank登录号QKY76296和QKY75909） ，IMDEVIMAB（regn10987; PDB访问号码; PDB访问号码6xdg_a and 6xdg_a and 6xdg_a and 6xdg_a and cactesce and and s309（pdb_A）6WS6_F）。人造信号序列和恒定的伽玛重（IgG1，Uniprotkb/swiss-Prot登录号P01857）和Kappa（Uniprotkb/Swiss-Prot登录号P01834）或LAMBDA（UniprotkB/swiss-Prot consection nuble p0doy2）。在CHO细胞中的表达优化了密码子的使用 。将合成的基因克隆到质粒中以进行蛋白质表达 ，并转染到CHO细胞中 。在37°C下孵育10-14天后收集细胞培养基。先前将一种针对流感B病毒血凝素的人单克隆抗体（1430E3/9）克隆到表达载体哺乳动物功率快递系统（TOYOBO）53中 ，并用Expi293f细胞暂时表达 。通过使用MabSelect肯定LX（Cytiva）或蛋白A柱纯化单克隆抗体 。使用前通过SDS -PAGE和/或HPLC确认纯度。这些针对SARS-COV-2的抗体的反应性，包括Alpha ，Beta ，Delta，Gamma和Omicron变体，先前已经进行了测试 。
Molnupiravir（EIDD-2801）和Nirmatrelvir（PF-07321332）购自Medchemexpress 。S-217622由Shionogi提供。在体内实验中使用之前 ，将所有化合物溶于0.5％甲基纤维素 。
根据《国家卫生研究院的实验动物的护理和使用指南》中的建议进行了动物研究 。该方案得到了华盛顿大学医学院的机构动物护理和使用委员会的批准（A3381-01的保证） ，威斯康星大学，麦迪逊大学（V006426）（V006426）和东京大学医学学院的动物实验委员会（批准号PA19-72和PA19-19-75）。所有动物均在温度控制环境中以12 h：12h的光：黑暗循环为特定的无病原体条件 ，湿度为50％ ，并且随意获得水和标准实验室杂志 。病毒接种是在麻醉下进行的，并竭尽全力最大程度地减少动物痛苦 。体内研究并未盲目 ，动物被随机分配到感染组。未进行样品大小的计算以为每项研究供电。取而代之的是 ，根据先前的体内病毒挑战实验确定样本量 。
在这项研究中，使用了五到六周的男性野生仓鼠（日本SLC） 。在感染前测量基线体重。在异氟烷麻醉下 ，每组四个仓鼠在室内接种了103 PFU（以30μl） ，104.7 PFU（30μL）或105 pfu（以30μl）为ba.2（30μL）的BA.2（NCD1288），NCD1288） ，BA.2（HP353） ，BA.2（HP353），BA.2（Hp354），ba.2（bap354）BA.1（NC928） 。每天监测体重10天 。对于病毒学和病理检查 ，每组4个仓鼠被室内感染103 PFU或105 PFU病毒。3和6 dpi ，将动物安乐死，并收集鼻涡流和肺 。通过在VEROE6/TMPRSS2细胞上使用斑块测定法确定鼻涡轮和肺中的病毒滴度 。
对于共感染研究 ，将BA.1（NC928）和BA.2（NCD1288）以相等的比率和病毒混合物（在60μL或2×103 PFU中的30μl中总计2×105 PFU）混合在30μl中。将动物安乐死 ，并在4 dpi处收集鼻涡轮和肺 。
使用PiggyBac介导的转基因方法开发了K18-HACE2转基因仓鼠线（M51线；与我们以前的研究7和M41相同的线） 。将来自PK18-HACE2质粒的K18-HACE2盒转移到Piggybac载体PMYGENIE-3中，进行核注射。HACE2转基因仓鼠将在其他地方详细描述32 。八至九周龄的女性（M41）或16个月大的雄性（M51）K18-HACE2转基因仓鼠（确认HACE2的表达）被室内接种了103 PFU D614G（HP095）（HP095） ，BA.1 ，BA.1（WI2221686）或BA.2（WI221686）或BA.2（NCD1288） 。每天监测体重和存活率，并在3和5 DPI下收集鼻涡轮和肺 ，以进行病毒学分析。
从杰克逊实验室获得了杂合子K18-HACE2 C57BL/6J小鼠（2B6.CG-TG（K18-ACE2）2PRLMN/J）。BALB/C小鼠购自日本SLC 。
通过鼻内途径接种了十二周大的雌性K18-HACE2小鼠 ，其鼻内途径使用103 PFU（50μl）BA.1（NC928），BA.2（NCD1288）或WA1/2020 D614G接种；在3 DPI时 ，将小鼠安乐死并收集肺 。通过Veroe6/TMPRSS2-HACE2细胞上的斑块测定确定鼻涡轮和肺中的病毒滴度。为了测量病毒RNA水平 ，在0.5 mL的PBS中收集鼻腔洗涤，并在1 mL补充2％FBS的1 mL DMEM中称重组织并用锆石珠（Roche Life Science）中的氧化锆珠（Roche Life Science）匀浆 。通过以10,000 rpm离心5分钟来阐明组织匀浆，并储存在-80°C下 。通过使用Magmax病毒RNA分离试剂盒（Thermo Fisher）分离出来自均质组织或鼻腔洗涤的病毒RNA ，并通过Taqman一步定量PCR测量 ，并在ABI 7500快速仪器上进行逆转录。通过使用先前发表的测定法确定样品中SARS-COV-2 N基因RNA的副本54 。简而言之，塔克曼测定法旨在靶向n基因的高度保守区域（正向引物：atgctgcaatcgtgctacaa;反向引物：gactgccgcctctgctc; probe;探针：56-fam – tam-taCaaggaac – tcaaggaac – zen – aacattgccaa – aacattgccaa – 3iabiabkfq） 。该区域包括在RNA标准中 ，以使每个反应的拷贝数确定至10份。反应混合物分别含有底漆的最终浓度和500和100 nm的探针 。
在异氟烷麻醉下 ，将五周大的雌性BALB/C小鼠室内接种了105 PFU（以50μl）的BA.1（NC928）或BA.2（NCD1288） 。体重是在感染前和每天测量的。在2和5 dPI时，将小鼠安乐死 ，并收集鼻涡流和肺 。通过Veroe6/TMPRSS2细胞上的斑块测定确定鼻涡轮和肺中的病毒滴度 。
根据制造商的说明 ，使用全身多体积学系统（PrimeBioscience）测量呼吸参数。简而言之，将仓鼠放置在不受约束的散布室中 ，并允许使用FinePointe软件在3分钟内获取数据 ，然后再进行1分钟。将小鼠放在不受约束的散布室中，并允许使用FinePointe软件在5分钟内获取数据之前 ，使其适应5分钟 。
用103 PFU（以30μl）或105 PFU（以30μl）为单位接种仓鼠BA.1（NC928） ，BA.2（NCD1288），BA.2（HP353）或PBS 。通过使用体内微CT扫描仪（Cosmoscan FX； Rigaku）对感染动物的肺进行成像。在氯胺酮 - 二甲苯麻醉下，将动物放在图像室中 ，并在90 kV ，88μa，Fov 45 mm和像素大小90.0μm处扫描2分钟 。扫描后 ，使用Micro-CT（Rigaku Corporation）的Cosmoscan数据库软件重建了肺图像 ，并使用制造商提供的软件进行了分析 。
CT严重程度得分是根据人类评分系统进行的，用于对肺部异常的严重程度进行评分。55 。分析每个肺叶的参与度 ，并根据严重程度从0-4分析：0（无 ，0％），1（最小 ，1％–25％） ，2（轻度，26％–50％） ，3（中度 ，51％–75％）或4（严重，76％–100％） 。求和5个肺叶的得分以获得0-20的总严重程度得分，这反映了5组异常的严重程度。图像是匿名和随机的；得分手对小组分配视而不见 。
切除的动物组织固定在PBS中的4％多聚甲醛中 ，并加工以嵌入石蜡 。将石蜡块切成3 µm厚的部分 ，并安装在硅烷涂层的载玻片上进行组织病理学检查。通过使用RNASCOPE 2.5 HD红色检测试剂盒（高级细胞诊断）通过原位杂交检测SARS-COV-2 RNA，其针对SARS-COV-2的核素基因（高级细胞诊断； RNASCOPE探针V-NCOV-NCOV-N ，846081）以及以前描述的制造商的指令 。还对组织切片进行了对SARS-COV核苷酸蛋白的兔多克隆抗体进行免疫组织化学染色（prospec; ant-180 ，1：500稀释，rebohovot） ，该抗体与SARS-COV-2-2核糖西蛋白交叉反应 。使用Dako Envision System（Dako cytomation; K4001 ，1：1稀释），通过3,3'-二氨基苯胺四氢氯化物染色可视化特定的抗原抗体反应。
使用QIAAMP病毒RNA迷你试剂盒（Qiagen）提取病毒RNA。SARS-COV-2的整个基因组通过使用修改的交通网络协议进行扩增 ，其中替换了一些引物或添加了56,57 。简而言之 ，通过使用Lunarscript RT SuperMix套件（新英格兰Biolabs）从提取的RNA中合成病毒cDNA 。通过使用ARTIC-N1引物V558和Q5热启动DNA聚合酶（新英格兰Biolabs）在两个池中进行多重PCR（新英格兰Biolabs）来扩增DNA。通过使用QIASEQ FX DNA库试剂盒（Qiagen）从合并的扩增子制备Illumina NGS的DNA文库，然后使用Miseq或ISEQ 100 System（Illumina）分析 。读取由CLC基因组工作台（21版 ，Qiagen）组装 ，并作为参考（GenBank登录号NO 。MN908947）作为参考。BA.1和BA.2的比率是根据9个区域的这两种病毒之间的差异计算得出的 。The nucleotide numbers in these 9 regions are: 21762, 21765–21770, 21846, 21987–21995, 22775, 22786, 23202, 24130 and 24503 in the SARS-CoV-2 genome, which correspond to amino acids 67, 69–70, 95, 143–145, 405, 408, 547, 856 and981分别在尖峰蛋白中 。分析了具有100多个读取深度的样品。
这项研究使用了五到六周大的叙利亚仓鼠（日本SLC） 。为了评估仓鼠中的单克隆抗体功效，在异氟烷麻醉下，每组4或5个仓鼠在室内用103 PFU（以30μL）的BA.2（NCD1288）或D614G或D614G（HP095）接种 。感染二十四小时后 ，将仓鼠用1 ml单克隆抗体制备（5 mg kg-1）注入腹膜内。将仓鼠定为4 dpi ，并通过VEROE6/TMPRSS2细胞上的斑块分析确定鼻涡流和肺中的病毒滴度 。
为了评估仓鼠的抗病毒化合物疗效，在异氟烷麻醉下 ，每组8仓鼠在内部接种了103 PFU（30μL）BA.2（NCD1288） 。接种后24小时 ，用以下抗病毒化合物处理仓鼠：（1）每天口服两次口服的Molnupiravir，500 mg kg -1（以1毫升为单位）；（2）Nirmatrelvir ，1,000 mg kg -1（以1毫升为单位）每天口服两次；（3）S-217622 ，60 mg kg-1（以1毫升为单位）每天口服两次；或（4）甲基纤维素（1 mL）作为口服处理的对照。将动物在4 dpi下安乐死，并通过VEROE6/TMPRSS2细胞上的斑块分析确定鼻涡轮和肺中的病毒滴度。
在异氟烷麻醉下 ，用105 PFU（以50μl）（HP01542） ，BA.1（NC928）或BA.2（NCD1288）室内接种了五周大的雌性BALB/C小鼠；1、2和3 DPI，将小鼠安乐死 ，并收集肺 。对于细胞因子和趋化因子测量 ，用生物质量小鼠细胞因子23-plex（Bio-Rad Laboratories）处理小鼠肺的匀浆 。
对于K18-HACE2小鼠的研究，将肺匀浆与Triton X-100（终浓度1％）在室温下孵育1小时，以使SARS-COV-2灭活。EVE Technologies Corporation使用其小鼠细胞因子阵列/趋化因子阵列31-PLEX（MD31）平台分析了EVE Technologies Corporation的细胞因子和趋化因子 。
如先前报道的59 ，进行了酶联免疫吸附测定（ELISA） 。In brief, 96-well Maxisorp microplates (Nunc) were incubated with the recombinant RBD of the S protein or HexaPro prefusion-stabilized versions of the S ectodomain (S6pro) (prototype virus or omicron variant) (50 μl per well at 2 μg ml−1), or with PBS at 4 °C overnight and were then incubated with 5% skim在室温下 ，牛奶中含有0.05％Tween-20（PBS-T）1小时的PBS中的牛奶。The microplates were reacted for 1 h at room temperature with hamster serum samples that has been diluted 40-fold or with 1 µg ml−1 monoclonal antibody in PBS-T containing 5% skim milk and subsequently serially diluted twofold, followed by peroxidase-conjugated goat anti-human IgG, Fcγ Fragment specific antibody (Jackson Immuno-Research) (1:5,000稀释）在室温下持续1小时 。然后，将1步超过TMB吸引溶液（Thermo Fisher Scientific）添加到每个井中 ，并在室温下孵育3分钟 。通过添加2 M H2SO4来停止反应 ，并立即测量450 nm（OD450）的光密度。从两个RBD或S6PRO井的平均OD450值中减去两个PBS孔的平均OD450值，以进行背景校正 。减去OD450值为0.1或更多的值被认为是正的 。给出阳性结果的最小稀释度被用作ELISA滴度（仓鼠血清）或最小浓度以结合S蛋白（单克隆抗体）。
如先前所述15 ，使用FRNT确定SARS-COV-2的中和活性 。将血浆的连续稀释液与1,000个焦点形成的病毒单位混合 ，并在37°C下孵育1小时 。将抗体 - 病毒混合物在96孔板中的VEOE6/TMPRSS2细胞上接种，并在37°C下孵育1小时。在每个孔中添加了培养基中培养基中培养基的1.2％Avicel RC-581（杜邦营养）。将细胞在37°C下孵育24小时 ，然后用福尔马林固定 。去除福尔马林后 ，用小鼠单克隆抗体对SARS-COV-1/2核蛋白蛋白（克隆1C7C7（Sigma-Aldrich））进行免疫染色（1：2,000稀释），然后是辣根过氧化物过氧化物酶标记的goat Anti Anti-Goat抗小鼠Immunogloblobin（Serimution serimution sericaincence sericiencence concence）（1估计）将感染的细胞用TrueBlue底物（Seracare Life Sciences）染色 ，然后用蒸馏水洗涤 。细胞干燥后 ，通过使用免疫孔S6分析仪，免疫接种软件和Biospot软件（Cellular Technologn）来量化焦点数量。结果表示为50％的焦点减少中和滴度（FRNT50） 。通过使用GraphPad Prism（GraphPad软件）计算FRNT50值 。
除临床标本外，所有材料均可从作者或市售来源获得。由于这些临床标本的数量极有限 ，因此我们无法提供它们 。
GraphPad Prism用于分析所有数据 。统计分析包括未配对的t检验 ，Mann-Whitney测试，对数秩（MANTEL – COX）测试和具有多个校正后测试后的ANOVA。群体之间的差异对于p <0.05被认为是显着的 。
有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然研究报告摘要中获得 。
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本文概览： VEOE6/TMPRSS2（JCRB 1819）细胞31,50在存在1 mg Ml -1遗传素（G418; Invivogen）和5μgml -1等离生蛋白预苯甲酸（Inv...
文章不错《SARS-COV-2 OMICRON BA.2的表征和抗病毒敏感性》内容很有帮助