在纪念斯隆·凯特林癌症中心（MSKCC）的机构审查委员会（IACUC 15-04-006）遵守中，进行了动物程序。ROSA26LSL-YFP（参考55） ，Rosa26LSL-TDT（参考文献56）
，FLT3CRE（参考57），TNFRSF11ACER（REF 。58） ，ID3F/F（REF
。59），ID3 - / - （REF。60）
，CX3CR1GFP/+（参考文献/+（Ref）30/+（Ref 。61），CX3 CR1GFP/+。CSF1RF/F（参考文献62） ，SPI1F/F（参考文献63）
，CXCR4GFP/+（参考文献64），CXCR4CREERT2（参考文献65） ，CLEC4FCRE-TDT（Ref
。25）
，Rosa26LSLSL-DTR（ROSA26LSL-DTR（ROSA26），参考文献66） ，p4172ls（ref。672ls（ref 。67）
，tr
。68），KRASLSL-G12D（参考文献69） ，CD45.1小鼠和C57BL/6J小鼠购自杰克逊实验室。小鼠在SPF条件下
，在12 h – 12 h的浅色周期下，在21-22°C左右 ，湿度为30–70％ 。补充数据4中提供了小鼠菌株和基因分型方案的列表
。 　　根据赫尔辛基的宣言，在涉及人类参与者的研究中执行的所有程序均进行。通过纪念斯隆·凯特林癌症中心（IRB方案
，15-021）的机构审查委员会的批准，通过患者知情同意获得了人体组织 。 　　补充数据5中提供了在本研究中购买和使用的试剂 ，质粒
，抗体和QPCR引物的清单
。 　　KPC-1和KPC-2细胞系70是从P48CRETRP53LSL-R172HKRASLSLSLSL-G12D小鼠中获得的胰腺组织。PAN0272,73（DCTD肿瘤存储库）由D. Lyden提供 。结肠腺癌细胞系MC3873,74和黑色素瘤细胞系B16F1075（ATCC，CRL-6475是J. D. Wolchok的礼物）
。刘易斯肺癌系LLC1细胞76（ATCC ，CRL-1642）购自ATCC。将KPC-1
，KPC-2和PANC-1细胞在补充的DMEM（Gibco）中培养，并补充了10％胎牛血清 ，100 U ML-1青霉素和100μgML-1链霉素（Invitrogen） 。panc02细胞
，LLC1细胞，MC38细胞和B16F10细胞在补充的RPMI 1640（GIBCO）中培养 ，含有10％的胎牛血清
，100 U ML -1 Penicillin和100μgMl -1链霉菌素（Invintrogen）（Invintrogen）（Invintrogen）（Invintrogen），并在37°C下于5％二代行孵育。 　　如下获得了小鼠BMDM
。Femur, tibia and iliac bones from C57BL/6J mice were flushed with PBS, red blood cells were lysed using red blood cell lysis buffer (eBioscience) and bone marrow cells were seeded per 15 cm non-tissue culture plate in DMEM (Thermo Fisher Scientific) with 10% FBS (Thermo Fisher Scientific), 20 ng ml−1 M-CSF (315-02-50ug,Peprotech） ，100 U ML -1青霉素 - 链霉素（Thermo Fisher Scientific）7天。 　　如下获得小鼠脾脏NK细胞 。将来自C57BL/6J小鼠的脾细胞悬浮液解离并通过100μM细胞滤网（BD），使用红细胞裂解缓冲液（EBISOSCIENCE）裂解红细胞
，并将50μL含有抗小鼠CD16/32抗体（1：1：1：1：1：1：1的抗小鼠）的阻塞中重悬于50μl的阻止缓冲液中，持续抗体在4°C和抗PE微粒（Miltenyi Biotec）分别在4°C下持续30分钟
。通过根据制造商的说明 ，使用LS柱通过Miltenyi Biotec磁分离系统将NKP46+ NK细胞通过Miltenyi Biotec磁分离系统分离。 　　PANC-1细胞77（ATCC
，CRL-1469）购自ATCC 。人类巨噬细胞是从两个独立健康供体的冷冻外周血单核细胞中得出的臀部细胞系获得的
。根据赫尔辛基公约获得书面知情同意。该研究得到了圣托马斯医院机构审查委员会的批准；盖伊医院；国王学院伦敦大学和纪念斯隆·凯特林癌症中心 。使用仙台病毒载体（Thermo Fisher Scientific; A16517）根据已发表的方案78得出臀部细胞
。新得出的IPS细胞克隆在培养物中维持了10段（2-3个月），以去除任何仙境病毒颗粒的痕迹 ，并确保在长时间的培养期内细胞保持稳定。使用流式细胞仪确定
，超过90％的IPSC表达了高水平的多能标记Nanog和Oct4 。核分型分析显示正常的核型（46，XX）
。IPS细胞系使用Mycoalert Plus套件（LONZA）测试了支原体污染的阴性。通过所有质量控制检查的IPS细胞克隆被冷冻并用于下游实验 。将臀部细胞维持在辐照的CF1小鼠胚胎成纤维细胞（MEFS; Thermo Fisher Scientific; A34181）中 ，该胚胎（ES）细胞（ES）细胞培养基
，这些细胞（ES）细胞培养基，含有10 ng-1碱性成纤维细胞生长因子（BFGF ，BFGF
，PEPROTECH; PEPROTECH; 100-18B; 100-18B）。媒介每隔一天更改
。每7天以1/4–1/6稀释比进行一次传代，具体取决于菌落的大小。在传递过程中 ，IPS细胞通过在37°C下与IV型胶原酶（250 UI ML -1最终浓度）（Thermo Fisher Scientific; 17104019）孵育13分钟，将IPS细胞脱离为簇
，并在室温下通过150g的中心散热 。 　　将IPS细胞簇重悬于补充的ES细胞培养基中，该培养基补充了10 ng ml-1 bfgf（peprotech; 100-18b） ，并将其镀到含有12,500至16,000 MEF的NUNC板上
，每CM2
。使用先前发布的协议79获得HIPSC-MAC，如下所示。在分化的第0天 ，如上所述
，扩展的臀部细胞被脱离，并在补充10μm岩石抑制剂（Sigma-Aldrich; y0503）的ES细胞培养基中转移（从150 mm板到四口井） ，以在六孔低粘附板中培养 。将板以100 rpm的速度保持在轨道振荡器上6天
，以允许自发形成具有造血潜力的胚胎体
。在分化的第6天，在解剖显微镜下挑选了200-500μM囊性胚胎体 ，并转移到粘附的组织培养板（每CM2约2.5个胚胎体）中
，以在HD培养基中培养。在分化的第18天，从悬浮液中收集了由胚胎物体产生的巨噬细胞 ，并在MC培养基中以每CM2约10,000个细胞的密度在组织培养板上培养6天，用于下游实验 。在标准组织培养孵化器中
，将所有细胞在37°C，5％CO2培养
。 　　人类NK细胞（IQ Biosciences ，IQB-HU1-NK5）在补充10％热灭活的合并的人AB血清（Sigma-Aldrich）
，100 U ML-1 PENICILIN和100μgML-1链霉素（Incitrycin）和20 HIL-1 HIL-ML-1 Incod-1 hIL-ML-1中，在NK MacS培养基（Miltenyi Biotec）中培养。5％CO2 。 　　将人CD8 T细胞（IQ Biosciences ，IQB-HU1-CD8T10）培养
，并补充了10％热灭活的合并的人AB血清，100 U ML-1 Penicillin和100μgml-1链霉素和20 ng ML-1 Hil-1 Hil-1 HIL-2在5％CO2中孵育
。 　　对于KCS的DT介导的耗竭 ，腹膜内注射100 ng dt（D0564-1mg
，Sigma-Aldrich）作为单剂量或每周注射剂，将100 ng dt（d0564-1mg ，sigma-aldrich）注入100 ng dt（d0564-1mg
，sigma-aldrich），以单剂量或每周的注射25 ，in Pracotiation in Prienastions in Prienastions in Prienastions in Prienastions in Prienastions in Prienastions in Prienastions in Prienase，将Clec4fcrerosa26lsl-dtr小鼠和rosa26lsl-dtr小鼠腹膜内注射。在扩展数据中确定了KC耗竭的效率图1J 。 　　对于CSF1R抑制剂对PLX562231的处理
，用PLX5622浸渍的Chow（由Plex Toxicon提供的1,200毫克）或对照Chow喂食C57BL/6J小鼠，或在注射肿瘤细胞前2周喂食CHOW（每公斤1,200 mg）或控制盘。 　　对于SIRPA阻塞测定 ，CLEC4FCREID3F/F小鼠和ID3F/F同窝室在腹膜内注射对照IgG（HRPN
，Bioxcell）或250μg抗SIRPA（P84，Bioxcell）（P84 ，Bioxcell）（P84
，Bioxcell），每2天后2天 ，然后在Tumeor cellor后两天进行散热
。 　　对于磷脂酰丝氨酸封锁80
，将C57BL/6J小鼠注射i.v.在注射肿瘤细胞前6小时，使用PBS或1μgMFG-E8（D89E）81（来自S. Nagata的礼物）。 　　对于NK细胞和CD8 T细胞耗竭 ，将8-12周的CLEC4FCREID3F/F小鼠和ID3F/F同窝室腹膜内注射
，并注入对照IgG（HRPN，Bioxcell） ，或200μganti-NK1.1（BE0036，BIOXCELL）和20036
，BE0061，BP ANT和200°C ANTbioxcell）在肿瘤注射前1天 ，每4天一次 。 　　通过对每个井的1,000个CD9+ CD133+ KPC-1细胞排序1,000个CD9+ CD133+ KPC-1细胞
，每孔和1,000 CD9-CD133- kpc-1细胞进行每个孔的细胞形成测定82，然后将其镀在超低连接96孔板（Corning）中 ，以DMEM/F-12培养基中的B-27 Serum（1:50）添加DMEM/F-12培养基
。系统）和50 U ML -1青霉素 - 链霉素总计7天。使用Leica Application Suitex软件使用Leica DM IL倒相对比显微镜获取图像
，并使用ImageJ进行了量化 。 　　通过对5×104或2×105 CD47BRIGHTCD9+ CD133+肿瘤细胞和CD47LOWCD9LOWCD133LOW肿瘤细胞进行排序，从KPC-1-GFP TALOR细胞中排序 ，然后对C57BL/6J小鼠的体内注入
。通过生物发光成像分析确定转移电位（请参阅下面的“短期肝转移模型（肿瘤细胞系内注射） ”部分。 　　为了产生LUCI-TDT-
，LUCI-GFP-和MTDT表达肿瘤细胞系，KPC-1 ，KPC-2
，PAN02，MC38 ，MC38，B16F10和LLC1细胞的密度为5×105细胞的密度为5×105细胞
，每个孔中的六孔培养板中的每个孔中的细胞为5×105 。携带荧光素酶-GFP基因（质粒PFUGW-FERH-FFLUC2-EGFP，ADDGENE ，71393）或荧光素酶-TDT基因（质粒PULTRA-CHILI-CHILI-CHILI-luc
，addgene，Addgene ，48688）和10 µg ml-1 proy-brene（Mill-1 trumig breene for tumerma）的慢病毒上场12 h
。然后更换培养基
，72小时后，将GFP+或TDT+肿瘤细胞在小鼠的体内注射前进行了三次分组。 　　为了产生表达MTDT的肿瘤细胞 ，将KPC-1和PANC-1细胞以每孔5×105细胞的密度在六孔培养板中接种 。表达MTDT基因（质粒PQC膜TDTomato IX
，Addgene，37351）和10 µg mL-1多紧甲酸酯（Millipore-Sigma）的慢病毒上清液（质粒PQC PQC膜TDTOMATO IX）被添加到Tumor细胞培养基中12小时
。然后更换培养基 ，72小时后
，在使用实验前将TDT+肿瘤细胞分为三次。 　　To generate Cd47-KO KPC tumour cells, sgRNAs targeting Cd47 sequence, sgCD47 5′-CCTTGCATCGTCCGTAATG-3′83 were cloned into pSpCas9(BB)-2A-Puro (PX459) V2.0 (Addgene, 62988) according to the Addgene cloning protocol.为了建立CD47-KO KPC细胞系，根据霓虹灯转染系统协议 ，进行了PSPCAS9-SGCD47质粒到1×106 kpc-1-luci-TDT细胞中的电穿孔 。基于抗小鼠CD47-AF647抗体（1：200，biolegend）的CD47染色的损失
，对细胞进行了FACS分类，以获取三轮CD47-KO细胞的纯种群。 　　对于BMDM的慢病毒转导 ，在5天的骨髓细胞培养了5天后
，将BMDMS的密度为每孔的1×106细胞的密度为1×106细胞
。慢病毒上清液携带对照，小鼠ID3基因 ，小鼠SHMYC
，Shhes1，She2a ，Shelk1
，Cramble（Santa Cruz）和10 µg ML-1多紧甲烯（Millipore-Sigma）被添加到BMDM培养基中12小时。然后更换培养基，48小时后 ，用2μgml -1紫霉素选择转导的细胞4天 。通过FACS
，RT-QPCR，延时成像或体内救援实验分析了转导的BMDM
。 　　For lentiviral transduction of KCs, KCs were seeded at a density of 8 × 105 cells per well of six-well plates in the presence of 20 ng ml−1 M-CSF and transduced with lentiviral supernatant carrying control, mouse shE2A, shELK1, VPX supernatant (pSIV3-VPX plasmids, a gift by M. Ménager) and10 µg mL -1聚甲烯12小时。然后更换培养基 ，48小时后，用1μgml -1嘌呤霉素选择转导的细胞3天 。通过FACS分析了转导的KC
。 　　对于HIPSC-MAC的慢病毒转导
，在20 ng ML-1 M-CSF的情况下，将HIPSC-MAC以5×105个细胞的密度为5×105个细胞 ，并用杀病毒上清液的转导
，人ID3基因，人ID3基因 ，VPX超级中段和10 µG ML-1 µG ML-forne forbrene forbrene forbrene forbrene。然后更换培养基
，48小时后，用1μgml -1嘌呤霉素选择转导的细胞3-4天 。通过RT-QPCR和延时成像分析了转导的HIPSC-MAC
。 　　如下获得了小鼠血细胞。通过腹膜内注射氯胺酮/甲基噻嗪/阿斯丙嗪麻醉鸡尾酒来麻醉小鼠 。使用心脏穿刺方法收集血液
。简而言之 ，将小鼠放在背部
，并在肋骨笼下插入1 ml注射器的针头（用1 ml 100 mM EDTA缓冲液进行预处理）。柱柱被轻轻拉出以收集血液 。使用红细胞裂解缓冲液（EBISoscience）裂解红细胞。如下获得小鼠骨髓细胞
。将小鼠的股骨，胫骨和小骨与PBS冲洗 ，并使用红细胞裂解缓冲液裂解红细胞。 　　在末端麻醉下用10 mL PB灌注小鼠
，将组织样品切成小块，并在含有1×PBS ，胶原酶D（1 mg ml-1，Sigma-1
，Sigma-Aldrich）的消化缓冲液中孵育热灭活的胎牛血清（FBS，Invitrogen）在37°C下持续30分钟 。分离细胞悬浮液并通过100μM细胞过滤器（BD） ，并重悬于50μl的阻止缓冲液中
，其中包含1×PBS，0.5％BSA ，2 mM EDTA
，抗小鼠CD16/32（1：100）（1：100），5％正常大鼠 ，5％正常小鼠和5％正常小鼠和5％正常小鼠Immunered（Jackson Immuneare）（15％）
，15分钟15分钟
。将样品用指定的抗体（在补充数据5; 1：200中提供的列表）在4°C下染色30分钟。使用BD Biosciences LSR Fortessa流式细胞仪使用Diva软件进行流式细胞仪 。使用FlowJo V.10.6（树星）分析了所有数据
。 　　小鼠肝巨噬细胞/髓样细胞板如下：POP1巨噬细胞，Hoechst -CD45+CD3 -CD19 -NKP46 -LY6G -LY6G -F4/80+TIM4+;POP2巨噬细胞 ，Hoechst -CD45+CD3 -CD19 -NKP46 -LY6G -F4/80+TIM4 -MHCII+;POP3髓样细胞
，Hoechst -CD45+CD3 -CD19 -NKP46 -LY6G -F4/80+TIM4 -MHCII-。KC子集：KC子集1，HOECHST -CD45+CD3 -CD19 -NKP46 -LY6G -F4/80+TIM4+CD206+;KC子集2 ，Hoechst -CD45+CD3 -CD19 -NKP46 -LY6G -F4/80+TIM4+CD206High 。其他小鼠巨噬细胞面板如下：肾脏巨噬细胞，Hoechst -CD45+CD3 -CD19 -NKP46 -CD11BLOWF4/80BRIGHT
。脑巨噬细胞
，Hoechst -CD45+CD3 -CD19 -NKP46 -CD11B+F4/80+。肺肺泡巨噬细胞，HOECHST -CD45+CD11b -CD11C+CD64+SIGLECF+ 。肺间隙巨噬细胞 ，Hoechst -CD45+CD11b+ly6g -cd64+
。皮肤巨噬细胞
，Hoechst -CD45+CD3 -CD19 -NKP46 -CD11B+F4/80+。Spleen rpm，Hoechst -CD45+CD3 -CD19 -NKP46 -CD11BLOWF4/80+ 。胰腺巨噬细胞 ，Hoechst -CD45+CD3 -CD19 -NKP46 -F4/80+。小鼠髓样细胞面板如下：CDC1
，HOECHST -CD45+F4/80 -LY6G -CD11B -CD11C+MHCII+
。Cdc2，Hoechst -CD45+F4/80 -LY6G -CD11B+CD11C+MHCII+。LY6C+单核细胞（血液） ，HOECHST -CD3 -CD19 -NKP46 -CD11B+CD115+LY6C+ 。LY6C+单核细胞（脾脏
，肝脏），Hoechst -CD45+CD3 -CD19 -NKP46 -F4/80 -LY6G -CD11B+LY6CHIGH
。LY6G+粒细胞（血液） ，Hoechst -CD3 -CD19 -NKP46 -LY6G+。LY6G+粒细胞（脾脏
，肝脏），Hoechst -CD45+CD3 -CD19 -F4/80 -NKP46 -F4/80 -LY6G+ 。小鼠淋巴细胞板如下：NKT细胞（肝脏） ，Hoechst -CD45+F4/80 -TCRβ+CD1DTETRAMERS+；γδT细胞（肝），Hoechst -CD45+F4/80 -CD3+TCRβ -TCRγδ+;CD3+T细胞（脾脏
，肝脏），Hoechst -CD45+F4/80 -CD3+
。CD8+T细胞（脾脏 ，肝脏）
，Hoechst -CD45+F4/80 -CD3+CD8+;CD4+T细胞（脾脏，肝脏） ，Hoechst -CD45+F4/80 -CD3+CD4+;CD19+细胞（脾脏
，肝脏），Hoechst -CD45+F4/80 -CD3 -CD19+;NKP46+细胞（脾脏 ，肝脏）
，Hoechst -CD45+F4/80 -CD3 -NKP46+。CD3+ T细胞（血液），HOECHST -LY6G -NKP46 -CD19 -CD3+ 。CD8+T细胞（血液） ，HOECHST -LY6G -NKP46 -CD19 -CD3+CD8+;CD4+T细胞（血液）
，HOECHST -LY6G -NKP46 -CD19 -CD3+CD4+;CD19+细胞（血液），HOECHST -LY6G -NKP46 -CD19+； NKP46+细胞（血液） ，HOECHST -LY6G -CD19 -CD3 -NKP46+
。小鼠骨髓面板如下：长期HSC（LT-HSC），HOECHST-CD3-CD19-NKP46-LY6G-KIT+SCA1+SCA1+CD150+CD48-;短期HSC（ST-HSC）
，HOECHST-CD3-CD19-NKP46-LY6G-KIT+SCA1+CD150-CD48-;多能祖细胞（MPP），HOECHST -CD3 -CD19 -NKP46 -LY6G -KIT+SCA1+CD150 -CD48+。人淋巴细胞内染色面板如下：CD8+T细胞 ，Hoechst -CD8+IFNγ+TNF+ 。CD56+NK细胞
，HOECHST -CD56+IFNγ+
。参见补充无花果。1-3和补充表1和2 。 　　使用细胞计数器（Guava Easycyte HT）评估细胞数量。 　　使用ARIA III BD细胞分选蛋白进行细胞分选
。将单个活细胞在DAPI-上门控，并使用正向散射宽度（FSC-W）和FSC-A排除双重动力。 　　对于CD8+和CD8- T细胞中的IFNγ和TNF细胞内染色 ，小鼠肝细胞悬浮液和人CD8+ T细胞用Phorbol的鸡尾酒12-麦糖酸酯13-乙酸盐（PMA）
，离子霉素，Brefeldin A和Brefeldin A和Monensin A和Monensin（Thermo Fisher Scientific）进行4-12 h 。根据制造商的说明 ，使用Ebioscience转录因子染色试剂盒（Thermo Fisher Scientific）进行IFNγ和TNF的染色
。通过流式细胞仪分析IFNγ和TNF的产生。 　　根据制造商的说明
，使用EBISOSCIENT转录因子染色试剂盒进行小鼠脾脏NK细胞和人CD56+ NK细胞的IFNγ细胞内染色 。使用流式细胞仪分析IFNγ的产生
。 　　Bone-marrow-derived cells are labelled in Cxcr4gfp/+and Cx3cr1gfp/+ mice, and by a single injection of 4-OH TAM (37.5 mg per kg body weight) supplemented with progesterone (18.75 mg per kg body weight) in 6-week-old Cxcr4creERT2Rosa26LSL-tdTmice (ref. 65) (Extended Data图2K，O）。4-OH TAM注射后2周 ，将CXCR4GFP/+和CX3CR1GFP/+小鼠以及CXCR4CROERT2ROSA26LSL-TDT小鼠小鼠注射1×106 kpc-1细胞
，通过门静脉注射1×106 kpc-1细胞，并在2周后通过门固醇进行了2周的e醇 ，以分析TDT+细胞+细胞+ GFP+ MM+ GFP+ GFP+ GFP 。 　　女性6-8周龄的CD45.2 ID3+/+和CD45.2 ID3 - / - 宿主对抛物线是通过先前描述的抛物性手术与年龄和体重匹配的雌性CD45.1小鼠一起产生的
。84。手术后，将小鼠维持在甲氧苄啶/磺胺甲氧唑饮食中
，以最大程度地减少感染 。8周后，将降落伞小鼠分离并用磷酸盐缓冲盐水（PBS）灌注
。通过流式细胞仪分析确定TIM4+ KC中伴侣的CD45.1+细胞。 　　女性6-8周龄的先天性CD45.1和CD45.2小鼠通过抛物线手术连接 。8周后 ，将CD45.2对抛物线通过门静脉注射1×106 kpc-1-luci-TDT细胞
，以诱导肝转移。肿瘤注射后2周收集肝样品
。进行了流式细胞仪和免疫荧光成像，以分析肝巨噬细胞交换比率。 　　根据制造商的说明 ，将小鼠KC和BMDM和人IPSC巨噬细胞直接在组织培养板上裂解
，并使用Quick-RNA MicroPREP KIT（Zymo Research; r1050）提取RNA 。根据制造商的协议，使用定量逆转录试剂盒（Qiagen; 205313）进行cDNA制备
。根据制造商的说明 ，使用探针（补充数据5）和Taqman Fast Advance Mastermix（Thermo Fisher Scientific; 4444557）或Powerup Sybr Green Master Mix（Thermo Fisher Scientifific; A25742）
，使用探针（补充数据5）和Taqman Fast Advance Mastermix（补充数据5）和Taqman Fast Advance Mastermix（A25742）进行RT -QPCR。根据公式，使用ΔΔCT方法计算每个测试基因相对于GAPDH内源对照的每个测试基因的表达值： 。 　　使用Cytospin 3（Thermo Fisher Scientific ，Shandon）和Cytofunnels（Thermo Fisher Scientific
，BMP-CYTO-DB25）进行细胞替素制剂，通过离心分类的细胞在800 rpm的超级弗罗斯特幻灯片（Thermo Fisher Scientific ，12-550-15）上以800 rpm的速度（培养基科学，12-550-15）进行10分钟（培养基培养基）
。将载玻片至少30分钟
，并在100％甲醇（Thermo Fisher Scientific，A412SK-4）中固定10分钟。将甲醇固定的细胞在50％May-Grünwald溶液（Sigma-Aldrich ，MG500-500ML）中染色5分钟
，持续5％Giemsa（Sigma-Aldrich，48900-500ML-F）15分钟 ，并用Sorensons蒸馏水（ph 6.8）洗15分钟
，每次洗涤3次，以后2分钟 。载玻片在空气干燥后用Entellan New（Millipore ，1079610100）安装
，使用Axio Lab.A1显微镜（Zeiss）在N-ACHROPLAN×100/01.25目标下拍摄代表性图片
。 　　取决于实验，在长期的原位型胰腺肿瘤实验中 ，在分离的器官（Ex vivo）上进行生物发光成像
，或在短期模型中（在体内）在体内成像系统谱（Perkin perkin elmer）上的短期模型中（体内）中进行生物发光成像。使用Libeimage（V.2.60.1; Perkin Elmer）进行生物发光图像的定量 。光增强度为光子S -1 cm -2 sr -1
。 　　用10 mL PBS灌注小鼠，剖析肝样品 ，并在4°C下用PLP固定剂在磷酸盐缓冲液中固定过夜。PBS洗涤后，将肝脏在PBS中的30％蔗糖中脱水
，并嵌入OCT中 。在厚度为16μm的厚度下切除冷冻块，并用含有5％正常山羊血清（Jackson Immunoresearch） ，1％BSA和0.3％Triton X-100（Sigma-Aldrich）的PBS阻塞1小时。将样品与抗小鼠F4/80-EF450/AF647/AF488/EF570（1：200
，BM8，EBISOSCIENCE） ，抗小鼠TIM4-AF647/PE（1：1：200
，RMT4-54，BIOLEGEND） ，BIOLEGEND
，BIOLEGEND），ANTI cD45.1-1-1-1-AF488（1：200 ，A200
，A20，A ANTIE）(1:500, A10262, Invitrogen, recognize YFP), rabbit-anti-RFP (1:200, 600-401-379, Rockland), goat-anti mouse CLEC4F (1:200, AF2784, R&D Systems), anti-mouse CCL3 (1:200, 50-7532-82, Thermo Fisher Scientific), anti-mouse CCL4（1：200 ，AF-451-NA，Thermo Fisher Scientific）
，反小鼠CCL5（1：200，701030 ，Thermo Fisher Scientific）
，抗小鼠IL-12P70（1：200，MM121B ，Thermo Fisher ScientificPA5-79481
，在室温下抗体2 h，抗体2小时
。使用抗Chicken-Alexa Fluor 488（1：500; A11039 ，Thermo Fisher Scientific）
，抗兔-Alexa Fluor 555（1：500，A32794 ，Thermo Fisher Scientific）使用二抗染色抗山羊 - 艾xaFluor 555（1：500
，A32816，Thermo Fisher Scientific） ，抗山羊 - 阿雷克斯荧光647（1：500，A21447
，Thermo Fisher Scientific），Thermo Fisher Scientific） ，抗goat-Goat-alexa fluor 488（1：1：1：1：1：500
，A32814，Thermo Scientific） ，alther 56（1：500
，A21099，Thermo Fisher Scientific） ，Strettavidin-Alexa Fluor 647（1：500
，405237，Biolegend）在室温下进行1小时。将核与DAPI（Invitrogen）对抗 。将部分用Fluoromount-G（Ebiosciences）安装
。使用石油放水×40/1.4 NA物镜 ，在Zeiss LSM880共聚焦显微镜上获取图像。 　　PDAC患者的转移性肝脏样本嵌入OCT中 。将冷冻块以16μm的厚度切割
，用4％多聚甲醛（PFA）固定30分钟，用含有5％正常山羊血清（Jackson Immunoresearch）的PBS阻塞 ，1％BSA和0.3％Triton X-100（Sigma-Aldrich）（Sigma-Aldrich）持续1小时
。 　　将样品与抗人CD14-AF488（1：200，bd）
，绵羊-Anti-Human CK19（1：200，AF3506 ，R＆D Systems）
，Rabbit-Anti-Human Tim4（1：200，1：200 ，Pa5-53346Systems), goat-anti-human IL-18 (1:200, AF2548, R&D Systems), mouse-anti-human IL-15 (1:200, MAB2471, R&D Systems), goat-anti-human CCL3 (1:200, AF-270-NA, R&D Systems), goat-anti-human CCL4 (1:200, AF-271-NA, R&D Systems)和山羊 - 抗山脉CCl5（1：200
，AF-278-NA，研发系统）抗体在室温下持续2小时。然后将样品与抗兔-Alexa Fluor 647（1：500 ，A32795
，Thermo Fisher Scientific），抗兔-Alexa Fluor 555（1：500 ，A32794
，Thermo Fisher Scientifice），抗鼠尾草科学） ，抗Sheep-aleep-aleep-alex-alexa fluor 568（1：500）抗山羊-Alexa Fluor 647（1：500，A21447
，Thermo Fisher Scientific）和抗小鼠 - 埃拉克萨荧光555（1：500，A-31570 ，Thermo Fisher Scientific）持续1小时 。将核用DAPI染色10分钟
。将部分用荧光量G（Ebiosciences）安装。使用石油放水×40/1.4 NA物镜
，在Zeiss LSM880共聚焦显微镜上获取图像 。 　　将肝脏固定在4％PFA中在PBS中稀释30分钟，并在室温下搅拌
。将样品与1×PBS透化 ，含有0.3％Triton X-100
，在室温下1小时4％BSA，并与抗F4/80-EF450（1：100 ，Ebioscience）
，抗TIM4-AF647（1：100，Biolegend ，Biolegend）抗体混合物孵育2小时。使用LSM880蔡司显微镜获取数据 。Imaris v.9.3.1（Bitplane）用于分析获得的图像。 　　对1×106 kpc-1-TDT细胞的2周后
，对F4/80，TIM4 ，LAMP1+和TDT进行F4/80，TIM4
，LAMP1+和TDT的免疫荧光染色
。图像是在蔡司LSM880共聚焦显微镜上获取的。Imaris v.9.3.1（BITPLANE）用于重建TDT+ KC中的LAMP1+溶酶体的3D表面或97.5μm2non-LAMP1-区域 。LAMP1+溶酶体中的TDT相对平均荧光强度（MFI）通过标准化为1个非LAMP1-区域MFI确定
。 　　CCL3，CCL4 ，CCL5
，IL-12P70，IL-15 ，IL-15
，IL-18，GFP ，F4/80和TIM4的免疫荧光染色在C57BL/6J小鼠的冷冻肝脏上进行KPC-1-GFP细胞。图像是在蔡司LSM880共聚焦显微镜上获取的 。Imaris v.9.3.1（BITPLANE）用于重建F4/80+ TIM4+ KC的3D表面
。在C57BL/6J小鼠或ID3F/F小鼠中
，通过将F4/80+ TIM4+ KC中的趋化因子/细胞因子相对MFI归一化为1（距肿瘤>50μM）的MFI（距肿瘤>50μm）来确定。 　　CCL3，CCL4 ，CCL5
，IL-12，IL-15 ，IL-15，CK19
，CCK19，CD14和TIM4对CCL3 ，CCL4
，CCL5，IL-12 ，IL-12
，IL-12，IL-12 ，IL-12
，IL-12，IL-12 ，IL-12
，IL-12，IL-12 ，IL-12，IL-12
，IL-12，IL-12 ，IL-12
，IL-12，IL-12 ，IL-12
，CCC14和TIM4的免疫荧光染色 。图像是在蔡司LSM880共聚焦显微镜上获取的
。Imaris v.9.3.1（BITPLANE）用于重建CD14+ TIM4+ KC的3D表面。CD14+ TIM4+ KC中的趋化因子/细胞因子和CK19+肿瘤材料相对MFI通过标准化为1的背景MFI确定 。 　　P48CRE，TRP53LSL-R172H和KRASLSL-G12D等位基因71的KPC小鼠是通过穿越P48CRE（参考文献67） ，TRP53LSL-R172H（Ref
。68）和Kraslsl-G12D（kraslsl-g12d（ref。69）的条件来产生 。定期监测KPC小鼠以检查腹部张力的症状；根据IACUC指南
，通过二氧化碳窒息对垂死动物安乐死。在6个月时对小鼠进行安乐死，并如上所述收集肝脏并固定
。进行CK19+肿瘤材料 ，趋化因子和细胞因子相对MFI的定量如下。来自KPC小鼠的冷冻肝切片和对照（KRASLSL-G12DTRP53LSL-R172H）小鼠对CCL3
，CCL4，CCL5 ，IL-12P70，IL-12P70
，IL-15，IL-15 ，IL-18
，IL-18，CK19 ，CK19
，F4/80和TIM4进行免疫荧光染色 。图像是在蔡司LSM880共聚焦显微镜上获取的
。Imaris v.9.3.1（BITPLANE）用于重建F4/80+ TIM4+ KC的3D表面。CK19+ F4/80+ TIM4+ KC中的肿瘤材料，趋化因子和细胞因子相对MFI通过归一化至KRASLSLSLSLSLSL-G12DTRP53LSL-R172H小鼠MFI为1 。 　　根据已发表的方案85进行胰腺细胞系的原始注射胰腺细胞系
。Mice were anaesthetized under isoflurane gas, sterile sharp scissors were used to cut a single incision off the abdominal skin and muscle above the pancreas, the pancreas was gently positioned to allow slow injection into the pancreas of 2 × 105 KPC-2-luci-tdT or 2 × 105 KPC-2-luci-GFP cells per mouse, resuspended in 50 μl of PBS and使用31 g胰岛素注射器（BD）以2/1的比例Matrigel（354234 ，Corning）。胰腺被轻轻地放回腹腔 。使用无菌吸收的Vicryl缝合线（J463G
，Ethicf ON）关闭肌肉层
。用无菌9毫米伤口夹（Braintree Scientific）封闭皮肤边缘。然后，在胰腺原位注射后8周 ，在100μl无菌水中接受了1 mg- luciferin（Goldbio Technology）的恢复轨道注射
，并通过生物发光成像溶解了肝脏，脾脏 ，肺和胰腺，以进行活体分析 。如上所述收集肝脏并固定肝脏
，并通​​过“全安装式免疫荧光成像
”部分中所述进行TIM4+ KCS中TDT+ TIM4+细胞的百分比
。（扩展数据图3F）。 　　对于DT对KC的有条件耗竭，在指定的实验中 ，Clec4fcrerosa26LSL-DTR和RosA26LSL-DTR静脉液液在每周腹膜内注射100 ng DT
，从胰腺原性注入肿瘤细胞后接受100 ng dt 。 　　In total, 1 × 106 KPC-1-luci-GFP cells, 5 × 105 B16F10-luci-GFP cells, 1 × 106 LLC1-luci-GFP cells, 1 × 106 MC38-luci-GFP cells, or 1 × 106 KPC-1-luci-tdT cells, 5 × 105 B16F10-luci-tdT cells, 1 × 106将LLC1-LUCI-TDT细胞或1×106 PAN02-LUCI-TDT细胞重悬于50μlPBS中。用异氟烷气体对小鼠进行麻醉，并使用无菌锋利的剪刀切开单个切口 ，从腹部皮肤和肌肉切开
。在用镊子（包括皮肤和腹膜衬里）将切口的中间侧伸到一边时
，使用无菌棉签小心地将大型和小肠拉出，直到将门静脉静脉可视化为止。用浸泡在无菌PBS中的无菌纱布覆盖肠后 ，将装有肿瘤细胞的31 g针（BD）插入肝脏下方的门静脉中
，并缓慢注入全部体积（50 µL） 。然后将针头移除，同时将无菌棉尖的涂抹器在静脉上施加压力 ，持续5分钟
，以使注射部位保持完整
。将内部器官轻轻放回腹腔中。使用无菌吸收的Vicryl缝合线（J463G，Ethicon）关闭肌肉层 。用无菌9毫米伤口夹（Braintree Scientific）封闭皮肤边缘
。如下分析含有肿瘤的小鼠。 　　在指定的实验中 ，Clec4fcrerosa26LSL-DTR和RosA26LSL-DTR同窝仔腹膜内注射100 ng dt之前和/或之后，如上所述 。 　　在指定的实验中
，每周两次兽医两次检查含有肿瘤的小鼠的队列，持续5周
。垂死动物由兽医确定 ，并根据IACUC指南通过二氧化碳窒息而安乐死。使用对数秩（Mantel-Cox）测试（图1G
，3J和6G）进行生存曲线的比较 。 　　在指定的实验中，通过流式细胞仪分析了含肿瘤小鼠的CD45-GFP+或CD45-TDT+肝肿瘤细胞数
。通过免疫荧光染色分析了GFP+ TIM4+细胞的百分比或KCS中TDT+ TIM4+细胞的百分比。 　　在指定的实验中 ，通过体内生物发光成像评估了2周的肝肿瘤负担 。使用RT -QPCR和免疫荧光染色分析了KCS的趋化因子和细胞因子的产生
，并通过免疫荧光构成分析了KCS中GFP+ TIM4+细胞的百分比或KCS中TDT+ TIM4+细胞的百分比。使用流式细胞仪和免疫荧光染色分析免疫细胞的数量
。使用流式细胞仪分析NK细胞或CD8 T细胞的IFNγ和TNF的产生。 　　CLEC4FCREID3F/F小鼠（6–12周）通过体内注射接受了1×106 kpc-1-luci-GFP细胞，然后在1周后（肿瘤注射后的第7天）通过术中注射1×106 BMDMS表达Lenti-Conti-control或lenti-M-M-M-M-Mi-Mid3细胞 。肿瘤负担是在肿瘤注射后14天通过上述生物发光图像进行的
。 　　C57BL/6J小鼠（6-8周）通过体内注射接受1×106 LLC1-LUCI细胞 ，随后在一周后（肿瘤注射后的第7天）通过术中注射1×106 BMDM
，表达Lenti-contol，Lenti-Control ，Lenti-Mid3细胞或没有。如上所述
，通过生物发光成像对肿瘤注射后14天分析了肿瘤负担 。如上所述分析生存
。使用对数秩（Mantel – Cox）测试对生存曲线进行比较。 　　C57/BL6J小鼠（6-12周）接受了皮下注射1×106 B16F10-Luci-GFP细胞，进入左右侧面 ，然后在肿瘤内表达5×105 BMDM，在Tumor射击后表达Lenti-Mid3细胞 。然后
，7天后，如上所述 ，通过体内生物发光成像评估了肿瘤负担
。使用流式细胞仪分析了NK细胞或CD8+ T细胞的免疫细胞数量以及IFNγ和TNF的产生。 　　如上所述
，将C57BL/6J小鼠（6-12周）通过体内注射注射1×106 kpc-1-MTDT细胞 。然后，在肿瘤细胞注射后2周 ，通过连续吸入异氟烷（0.5 L min -1）在氧气中通过鼻锥中的异氟烷（0.5 L min -1）通过连续吸入异氟烷（0.5 L min -1）来维持麻醉的小鼠
。The mice were then injected retro-orbitally with 5 μl CellEvent caspase-3/7-green reagent (Invitrogen), a four-amino-acid peptide (DEVD) caspase-3/7 cleavage reporter conjugated to a nucleic-acid-binding dye that becomes fluorescent when bound to DNA (Cas-Green) to monitor tumour cell apoptosis and death86,在50μlPBS中分别标记凋亡/死细胞和KC的10μl抗TIM4-AF647抗体（Biolegend）。将无菌眼润滑剂应用于两只眼睛
，以防止实验过程中角膜干燥 。切开1.5厘米的水平切口，将肝脏上方的皮肤和肌肉切开 ，并轻轻挤出肝左叶。然后将鼠标倒置并放在插入的定制铝制托盘阶段
，该托盘通过圆形2.5 cm直径的孔插入，上面覆盖着玻璃盖玻片 ，该玻璃盖上与有机硅油脂连接在一起
。在盖子上介绍了涂料的PBS浸泡的纸张
，以围绕裸露的肝脏区域，然后将小鼠准备好进行浸润成像。在整个成像期间 ，在小鼠两侧轻轻添加PBS每20分钟，以保持区域湿润 。恒温器控制的加热室将整个显微镜
，小鼠，托盘和显微镜目标保持在32°C ，以防止实验期间体温过低
。使用Zeiss LSM880共聚焦激光扫描显微镜进行成像。在单个通道中对Cellevent Caspase-3/7绿色
，TDT和AF647荧光信号的采集进行 。每条激光线使用的功率如下；1％，488 nm;1％ ，568 nm;和5％
， 647 nm - 为每个荧光探针获得足够信号所需的最低信号并选择以最大程度地减少光毒性
。使用Zeiss Plan-Apochromat×20/0.75物镜捕获七个连续的堆栈，间隔为2.5 µm ，数字变焦设置为1
，每位位置每位位置每位1分钟持续8小时。使用Imaris v.9.3.1（Bitplane）生成延时视频和3D表面重建 。 　　使用消化缓冲液和“流式细胞仪，细胞分类和细胞计数”部分中描述的F4/80+ TIM4+ KC从C57BL/6J或ID3 - / - 小鼠的新鲜分离的肝脏中进行排序
。总共将1×104 kc与2×103 kpc-1-MTDT细胞（5：1比率）混合 ，嵌入生长因子还原的Matrigel（356231
，康宁）中，并在24孔µ-plate（Ibidi）中与DMEM培养基中的DMEM培养基中培养过夜 ，并在20 ng ml-ml-ml-ml-sl-ng ml-ml ng Ml-1 ml和D89E，60 mM latrunculin A
，50 µg ML-1抗SIRPA（P84，Bioxcell）或20μgml-1抗Dectin-1（R1-8G7 ，Invivogen）。成像之前
，将共培养用2μMCellevent caspase-3/7绿色试剂（Invitrogen）和抗F4/80-AF647抗体（1：200，Biolegend）染色30分钟 。使用蔡司LSM880共聚焦激光扫描显微镜进行成像 ，该显微镜配备了37°C
，5％CO2，20％O2和90％相对湿度的成像室
。使用Zeiss LD C-Apochromat×40/1.1捕获2.5 µm的连续堆栈 ，每5分钟每5分钟每5分钟每5分钟捕获20小时。使用Imaris v.9.3.1（BITPLANE）分析数据 。对于每个样品
，通过平均F4/80+细胞的百分比吞没了活肿瘤细胞（Cellevent，Cellevent ，裂解caspase-3/7-肿瘤细胞）
，从而确定了吞噬KC的百分比。确定吞噬值的时间是从巨噬细胞和肿瘤细胞之间稳定相互作用到肿瘤细胞吞噬的时间
。确定CAS裂解的时间是从巨噬细胞和肿瘤细胞之间稳定相互作用到检测caspase-3/7裂解的时间。指示每个样品跟踪的巨噬细胞的总N数量 。 　　对于BMDM/KPC-1-MTDT肿瘤细胞延时成像，将表达Lenti-Control或Lenti-Mouse-ID3表达1×104 BMDM与2×103 kPc-1-MTDT细胞（5：1比）混合 ，并嵌入生长因素因素降低的Matrigel（356231，cor）中
，并在生长因素因素范围（IBIDI）在存在20 ng ml-1 M-CSF的情况下使用DMEM培养基，并在指示50 µg ML-1抗SIRPA（p84 ，bioxcell）时
。在成像之前
，将共培养用2μMCellevent caspase-3/7绿色试剂（Invitrogen），抗F4/80-AF647抗体（1：200 ，Biolegend）染色30分钟。使用Zeiss LSM880共聚焦激光扫描显微镜进行成像
，并如“吞噬分析：Ex Vivo 3D共培养和KCS和KPC-1-MTDT肿瘤细胞的延时成像 ”中所述进行分析 。 　　总共将ID3F/F或Clec4fcreid3f/F小鼠的3×105 kcs播种在具有1.5×105 kpc肿瘤细胞的12孔板中
。然后，48小时后 ，收集了来自共培养的上清液进行以下研究。使用上述RT – QPCR分析了KCS趋化因子和细胞因子的产生 。 　　在100μlNK培养基中
，将来自C57BL/6J小鼠的小鼠脾脏NK细胞以每孔的3×104细胞为3×104个细胞（在100μlNK培养基中的3×104细胞中）（补充了10％FBS，100 u mL-1青霉素 ，100μgml-1链霉素和20 ng ml-1 mil-2）
。然后
，3天后，使用流式细胞仪分析了NK细胞产生的IFNγ。 　　对于HIPSC-MAC/PANC-1-MTDT肿瘤细胞延时成像 ，将表达Lenti-Control或Lenti-Human-ID3表达的1×104 HIPSC-MAC与2×103 Panc-1-MTDT细胞（5：1）混合在生长中及其生长的A 24-innirten Annirten Intring Intring Intring IntriNting IntriNting IntriNting IntriNting IntriNting IntriNting IntriNting IntriNting IntriNting IntriNting IntriNting（356231）中在100 ng ml-1 m-CSF的情况下，µ板（IBIDI）具有RPMI1640培养基 。在成像之前
，将共培养用2μMCellevent caspase-3/7绿色试剂（Invitrogen），抗CD14-AF647抗体（1：200 ，Biolegend）染色30分钟
。使用Zeiss LSM880共聚焦激光扫描显微镜进行成像
，并如“吞噬分析：Ex Vivo 3D共培养和KCS和KPC-1-MTDT肿瘤细胞的延时成像”中所述进行分析。 　　总共将表达Lenti-Contol或Lenti-Human-ID3的105个hipsC-MAC播种在12孔板中，并用5 x 104 Panc-1肿瘤细胞处理或不处理或不处理 。然后 ，48小时后
，收集了共培养上清液以进行以下研究。使用上述RT – QPCR分析了HIPSC-MAC的趋化因子和细胞因子的产生
。 　　对于人类NK细胞/上清液共培养分析，将人NK细胞在100μLNK培养基中的每孔104细胞中的96孔圆底板中播种（见上文） ，在上述上述上清液中有100μL。然后
，3天后，通过流式细胞仪分析了IFNγ的产生 。对于人类CD8 T细胞/上清液共培养分析 ，将用CFSE染色的人CD8+ T细胞在100μlCD8培养基中的104个细胞中以104个细胞的形式播种在100μlCD8培养基中（见上文）
，在上述上述上述超级中，PBS添加了100μL ，然后添加了pBS pead peact anti-HCD3/HCD28
。然后，3天后
，将样品用PMA，离子霉素 ，Brefeldin A和Monensin的鸡尾酒处理6小时。使用流式细胞术分析CD8 T细胞的CFSE增殖
，TNF和IFNγ产生 。 　　E2A/TCF3和ELK1图案的位置权重矩阵（PWM）分别从Jaspar数据库下载，分别具有Motif IDS MA0522.1和MA0028.2 ，分别为87
。为了找到图案匹配
，我们首先计算了SIRPA基因座KC的所有推定调节元素的主题分数或PWM分数 <0.2%. We then computed the DeepLIFT scores based on a deep learning model (see below) at every regulatory element and overlaid these scores with motif matches for E2A and ELK1 to predict functional motifs. Our final set of functional motifs all have a PWM score exceeding the score cut-off and at least three positions within top 20% based on DeepLIFT scores. 　　The deep learning model was trained and interpreted as described previously88. In brief, we adapted a strategy of AgentBind89 and fine-tuned a pretrained DeepSEA model90 using all active enhancers in KCs on the basis of previously published ATAC–seq and H3K27ac ChIP–seq data under Gene Expression Omnibus (GEO) GSE128338 (ref. 91). The AgentBind model consists of (1) pretraining convolutional neural networks, which infer important sequence context features and learn combinations and orientations of these features that are predictive of binding, using ChIP–seq and DNase-I-sequencing profiles collected from ENCODE18 and the Epigenomics Roadmap Project20 across dozens of cell types; and (2) fine-tuning an individual model for each transcription factor to identify bound versus unbound sequences, described previously38. The DeepSEA model (deep learning–based sequence analyzer) is a fully sequence-based algorithmic framework for non-coding-variant effect prediction, described previously39. The software used for this methodology was as follows: Python (v.3), Keras (v.2.3.1), tensorflow (v.2.1.0), scikit-learn (v.0.21.3), deeplift (v.0.6.10.0) and biopython (v.1.76). Training data were prepared as follows. Positive data labelled as 1 were 300 bp sequences of ATAC–seq peaks associated with strong levels of H3K27ac. We first obtained the processed data file from GEO GSE128338, which includes the reproducible ATAC–seq peaks merged from KCs of both healthy and NASH-diet mice and their tag counts of H3K27ac ChIP–seq in the expanded 2,000 bp regions91. We removed sex chromosomes and filtered the peaks with a minimum cut-off of 32 tags of H3K27ac ChIP–seq. The positive sequences were balanced with the same number of 300 bp negative sequences, which were GC-content-matched random genomic regions selected from the mm10 genome and were labelled as 0. During the training, we left out sequences on chromosome 8 for cross-validation and those on chromosome 9 for testing. The final model had an area under the receiver operating characteristic curve (auROC) equal to 0.828 on the testing data. We next used DeepLIFT92 to generate importance scores with single-nucleotide resolution using uniform nucleotide backgrounds. For each input sequence, we generated two sets of scores, one for the original sequence and the other for its reverse complement. The final scores were the absolute maximum at each aligned position. We defined predicted functional nucleotides by the top 20% (that is, top 60) positions within each input 300 bp sequence. 　　CUT&RUN was performed using the Epicypher (14-1048) kit according to the manufacturer’s protocol with modifications. A total of 2 × 105 TIM4+ KCs was sorted from the liver and resuspended in 1 ml nucleus isolation buffer (0.5 mM Tris, pH 8.0, 0.5 mM EDTA, 5 mM magnesium chloride, 0.1 M sucrose, 0.05% Triton X-100, 1× EDTA-free protease inhibitor (11836170001, Sigma-Aldrich)) and incubated on ice for 10 min. Nuclei were resuspended in 100 μl wash buffer, DNA was purified using the QIAamp DNA Micro Kit, using 5 µl of the sample as the input. The rest of the sample was mixed with 10 µl concanavalin A beads and rotated at room temperature for 30 min. The supernatant was removed by placing beads and nuclei mixture on a magnetic stand. Nuclei were resuspended in 50 µl antibody buffer mixed with 3 µl rabbit-anti-E2A (gift from the K. Murre laboratory, made by D. Wiest), or 4 µl rabbit-anti-Elk1 (Cell Signaling Technology, 9182 S) and incubated overnight at 4 °C. The next morning, nuclei were washed in wash buffer twice, resuspended in 50 µl cell permeabilization buffer containing 2.5 µl pAG-MNase and incubated for 10 min at room temperature. After two washes, 1 µl of chromatin digest additive was added, and the samples were incubated at 4 °C for 2 h with rotation. After addition of 33 µl of stop buffer, the samples were incubated for 10 min at 37 °C. The tubes were then placed onto a magnetic stand and the supernatant containing enriched DNA was transferred to 1.5 ml tubes. DNA was purified using the Chip DNA Clean&Concentrator kit (Zymo research). CUT&RUN-enriched DNA and input DNA were analysed by qPCR on the QuantStudio (TM) 6 Flex System (Applied Biosystems) with the Power SYBR Green PCR Master Mix (Thermo Fisher Scientific, A25742) and calculated as the percentage of input. 　　In total, 80,000 KCs per sample were FACS-sorted into 1.5 ml Eppendorf tubes with 800 µl TRIzol LS Reagent (Thermo Fisher Scientific, 15596018) or in 1.5 ml Eppendorf tubes precoated with 10% BSA. RNA samples were submitted to the Integrated Genomics Operation (IGO) at MSKCC for quality and quantity analysis, library preparation and sequencing. In brief, phase separation in cells lysed in TRIzol Reagent was induced with chloroform. RNA was precipitated with isopropanol and linear acrylamide and washed with 75% ethanol. The samples were resuspended in RNase-free water. After RiboGreen quantification and quality control using the Agilent BioAnalyzer, 2 ng total RNA with RNA integrity numbers ranging from 9.4 to 10 underwent amplification using the SMART-Seq v4 Ultra Low Input RNA Kit (Clonetech, 63488), with 12 cycles of amplification. Subsequently, 10 ng of amplified cDNA was used to prepare libraries with the KAPA Hyper Prep Kit (Kapa Biosystems KK8504) using 8 cycles of PCR. The samples were barcoded and run on the HiSeq 4000 system in a paired-end 100 bp run, using the HiSeq 3000/4000 SBS Kit (Illumina). For RNA-seq data processing and analysis, sequenced reads from the RNA-seq were aligned to the mouse reference genome GRCm39 or mm10 using STAR (v.2.7.10a)93. The aligned reads were quantified as gene counts using HTSeq94 with GENCODE release M3095. DESeq296 was applied to the gene counts table to identify differentially expressed genes (DEGs). Adjusted P values were determined with DEseq2 using the Benjamini–Hochberg method for multiple comparisons with two-sided tests. DEGs were ranked on the basis of their log2-transformed fold change and associated P values (Padj < 0.05). For gene set enrichment analysis, pathways enriched in the ranked DEGs were identified against the mouse Molecular Signatures Database (MSigDB)97 pathway collection (Padj < 0.25) using the fgsea package in R, and the most biologically informative lists are shown. 　　The CRC dataset (GSE146409)98 contained three patients with colorectal liver metastasis and a non-tumour individual. The PDAC dataset (GSE205013)99 contained three patients with PDAC liver metastasis. The non-tumour dataset (GSE115469)51 control contained five non-tumour individuals. scRNA-seq analysis was conducted using the Seurat package (v.4.3.0) in R studio (4.2.0). For each dataset, quality control was performed by retaining cells with nFeature_RNA >200但<10,000，线粒体含量<10％。使用SCTRANSFORM工作流程集成了PDAC和非肿瘤数据集 。首先 ，将两个Seurat对象合并
，标准化并缩放为2,000个功能
。随后，将SCTRANSFORM（）函数应用于合并对象 ，数据集源会回归。线性尺寸降低应用于SCT分析和前50个主要成分 。和谐（V.0.1.1）用于纠正数据集和样品
。聚类分析基于统一的seurat对象。在Runtsne（）和FindNeighbors（）函数中使用了前40个主要组件
，而分辨率参数在Findcluster（）函数中设置为1.8 。对于上面未指定的其他参数，在Seurat工作流中使用了默认值。CRC数据集由作者预先整合 ，因此我们使用标准Seurat管道进行了分析
。在二维T-分布的随机邻居嵌入（T-SNE）中可视化簇，并使用基于人类蛋白质图集（https://www.proteinatlas.org/）的差分表达标记基因注释。特征基因的表达模式显示在T-SNE图中 。使用GGPLOT2软件包（v.3.4.1）提取了KC和TAM簇中特征基因的表达数据
。每个簇中的平均表达水平都在小提琴图上标记。根据数据集中的基因总数
，使用Wilcoxon测试和Bonferroni校正获得了调整后的P值 。 　　相应的部分包括大量RNA-SEQ和SCRNA-SEQ数据的分析
。对于其他实验，图形数据中的误差线代表平均值±S.D.使用两尾学生的t检验和ANOVA确定统计显着性 ，用于正态分布的数据
，Mann-Whitney U检验和Kruskal-Wallis测试，当数据未正态分布 ，基于Shapiro – Wilk Test或Anderson-Wilk Test（Anderson-Wilk test）（p <0.05）（p <0.05）（补充表1和2）。使用对数秩（Mantel – Cox）测试对生存曲线进行比较 。P <0.05被认为具有统计学意义
。使用GraphPad Prism进行统计分析。除非在传说中另有说明
，否则n值代表生物学重复 。重复实验以确保观测值的可重复性
。没有使用统计方法来预先确定样本量。Results were obtained from at least three (Figs. 1a–e, 2a,f,g, 3h,e, 4g, 5e and 6a,h and Extended Data Figs. 1c, 2a–g, 4a,b, 5b,d,e, 6c–h, 7b–d,f, 8b and 10a,c) and two (Figs. 1h–j, 2b,d,e,h, 3a,c,d,j,4F，H ，I
，L，K ，5C
，G和6G和扩展数据无花果 。 　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得。