对于DNase I足迹实验 ，在30°C生长的Sure2大肠杆菌细胞中扩增了含有360 bp的端粒DNA的2.8 kb质粒
，并使用QIAGEN质粒最大化剂进行提取。通过BSMFI消化在37°C下通过BSMFI消化线性化1小时，而端粒Ttaggg重复均具有一端 。将DNA用快速-CIP在37°C下去磷酸化30分钟 ，并通过苯酚氯仿提取和乙醇沉淀进行清洁
。随后使用PNK和[γ-32P] ATP磷酸化的DNA在37°C下磷酸化1小时
，经过G-50脱盐柱和提取的苯酚氯仿。将标记的DNA用SACI在37°C下消化1小时，以分离出390 bp的DNA片段 ，以从其余的质粒中重复60 ttaggg重复 。在10％TBE-PAGE凝胶（Invitrogen）上运行消化的DNA
，然后在10 mm Tris pH 8.0 pH 8.0，300 mm NaCl中摇动端粒片段 ，并在21°C下搅拌凝胶
。将最终的DNA片段（PE1；有关序列的补充表1参见补充表1）用异丙醇沉淀，并重悬于1×TE缓冲液中。通过使用非telomeric质粒制备了一个非telomeric DNA片段（PE2；有关序列的补充表1）
，该序列含有360 bp的随机DNA序列，以代替Ttaggg重复序列 。在图2C中制备了用于扩展数据的实验的端粒DNA模板 ，如上所述
，但通过ESP3I而不是BSMFI消化，从而产生了与SSDNA悬垂连接兼容的不同DNA末端
。为了制备15 nt的悬垂模板 ，将去磷酸化的DNA与寡核苷酸PE5一起以1:75 DNA：寡核苷酸摩尔比
，并在16°C与T4 DNA Ligase（NEB）孵育过夜。随后使用两轮高PREP PCR清理珠（MAGBIO）从多余的寡核苷酸（MAGBIO）中清除了连接的模板，并将其重悬于TE缓冲液中 ，并在上述如上所述γ-32P标记 。 　　通过将寡核苷酸PE3和PE4混合以1：1摩尔比
，加热至95°C并在2小时内冷却至室温，用于冷冻EM ，交联和DNA-PK下拉实验的端粒DNA底物。 　　对人Ku70/80
，Rap1或Trf2的开放式读取帧被用于spodoptera frugiperda的密码子，并将其克隆到PaceBAC1矢量中
。使用基于PCR的诱变产生了指示的突变体（有关突变细节 ，请参见补充表2）。庇护蛋白基因（Terf1，Terf1
，Rap1，Tinf2 ，Acd（也称为TPP1）和POT1）
，由Genscript合成，并通过划分的克隆系统将其克隆到PaceBAC1中 ，并将其克隆到PaceBac1中 。向量转置DH10 MultiBAC胜任的大肠杆菌细胞中
，并在LB培养基中生长在37°C时在200 rpm摇动
。提取Bacmid DNA并用于转染SF9昆虫细胞，后来在27°C下生长 ，在几个细胞通道上以130 rpm的速度摇动。在第三（P3）时
，将200 ml的高五个昆虫细胞以1.5×106的密度感染了杆状病毒以进行蛋白质表达，并在27°C下与130 rpm一起孵育 。3天后 ，检查细胞计数
，并通过在4°C下以760g离心20分钟来收集细胞
。然后将细胞颗粒重悬于PBS中，转移到50 ml猎鹰管中 ，并通过470G离心25分钟。将上清液丢弃，颗粒在液氮中闪烁
，并将其放置在-80°C下直至需要 。 　　将HELA细胞颗粒重悬于缓冲液A（10 mM HEPES pH 8.0 、10 mM KCl，1.5 mm MGCL2
、0.5 mm DTT ，0.5 mm AEBSF）中
，并在4°C下孵育10分钟
。在4°C下以1,033G离心10分钟后，将沉淀重悬于两个弹药体积的缓冲液A中 ，并在Dounce匀浆器中被20笔冲程（Pestle type b）中的20杆。将裂解物在4°C下以25,000克离心20分钟
，然后将沉淀（含有核）重悬于缓冲液C的1.3×颗粒体积中（20 mM HEPES pH 8.0，420 mm NaCl ，NaCl
，NaCl，1.5 mmmgcl2 ，0.2 mm MmMMMMMMMM EDTA
，25％Glycerol，0.5 mm ，0.5 mm，0.5 mm n.5 mm dtt 。在Dounce均匀剂（B型B）中进行20杆后
，将核在4°C下孵育30分钟，并在4°C下以25,000g离心30分钟
。收集上清液并在液氮中闪烁。 　　将HELA细胞核提取物稀释到DPKQ缓冲液中（20 mM HEPES pH 7.6、100 mM NaCl ，2 mM MGCL2 、0.5 mM EDTA
，10％甘油，0.5 mM DTT ，0.5 mm DTT
，0.5 mm AEBSF）和在40,000g的4°c处于50,000g的超敏机 。收集上清液并通过0.45 µm注射器过滤器进行过滤，然后再注入DPKQ缓冲液中平衡的Q-Sepharose柱。将色谱柱在DPKQ缓冲液中洗涤 ，并在100 mm – 1 m NaCl梯度上洗脱
。将馏分被发现到硝酸纤维素膜上
，并呈蛋白质，以鉴定含DNA-PKCS的含量 ，将其合并
，将其稀释到DPKQ缓冲液中，并将其加载到同一缓冲液中平衡的肝素柱上。用DPKQ缓冲液洗涤色谱柱 ，并在100 mm – 1 m NaCl梯度上洗脱 。DNA-PKcs-containing fractions were pooled, dialysed into DPKC buffer (50 mM Tris pH 7.3, 0.5 mM EDTA, 5% glycerol, 2.5 mM DTT, 0.5 mM AEBSF) with 50 mM KCl, and loaded onto a dsDNA-conjugated CNBr-activated Sepharose column equilibrated in the same buffer.用50 mM KCl在DPKC缓冲液中洗涤该色谱柱，并用411 mM KCl洗脱绑定的蛋白质
。将含DNA-PKC的分数合并
，用100 mM KCl和0.02％的Tween-20稀释到DPKC缓冲液中，并将其加载到同一缓冲液中平衡的MonoQ柱上。将色谱柱在DPKC缓冲液中用100 mM KCl洗涤 ，并在0.02％的Tween-20中洗涤
，并在100 mm – 1 M KCl梯度上洗脱蛋白质 。将DNA-PKC分数合并，用100 mM KCl和0.02％的Tween-20稀释到DPKC缓冲液中 ，并加载到在同一缓冲液中平衡的单声道柱
。将色谱柱在DPKC缓冲液中用100 mM KCl洗涤
，并在0.02％的Tween-20中洗涤，并在100 mm – 1 M KCl梯度上洗脱蛋白质。将最终的DNA-PKCS分数合并 ，使用100 kDa Amicon Ultra离心过滤器浓缩
，在液氮中冷冻闪光并储存在-80°C下 。 　　将细胞颗粒重悬于50 mM Tris pH 8.0，2 mMβ-甲醇乙醇中 ，蛋白酶抑制剂片剂
，并在4°C下孵育20分钟
。通过添加16.7％的甘油和300 mM NaCl裂解细胞，在4°C下搅拌30分钟。将裂解的细胞在4°C下以125,000g的速率在125,000g下进行30分钟 ，并将上清液与抗FLAG树脂在4°C下孵育2小时 。将珠连续洗涤在KU缓冲液（50 mM Tris pH 8.0，5％甘油
，2 mMβ-马er乙醇）中，用300 mM NaCl洗涤 ，然后是150 mM NaCl的KU缓冲液
。使用补充了0.5 mg ml -1 3×FLAG肽的后一种缓冲液洗脱蛋白质。随后将蛋白质分离在SuperDex 200凝胶过滤柱上
，并使用具有150 mM NaCl的KU缓冲液平衡并运行 。将最终的KU70/80馏分合并，使用30 kDa Amicon Ultra离心过滤器浓缩 ，在液氮中闪烁
，并储存在-80°C下。 　　对于TRF2和RAP1，将细胞颗粒重悬于50 mM HEPES pH 7.6
、1 mM DTT中 ，用无EDTA的蛋白酶抑制剂片剂（每50毫升
，Roche 1个），并在4°C搅拌20分钟
。通过添加16.7％的甘油和300 mM NaCl提取蛋白质 ，在4°C下搅拌30分钟。通过在4°C下以125,000g的超速离心进行30分钟来清除提取物 。将上清液应用于在庇护蛋白缓冲液中平衡的链球菌tactin XT 4Flow树脂（50 mM HEPES pH 7.6
，500 mm NaCl，10％甘油 ，1 mm DTT）
。在庇护所缓冲液中洗涤珠，并用补充10 mm生物素的相同缓冲液洗脱蛋白质。随后
，将蛋白质分离在超级dex 200 10/300柱上，并在庇护所缓冲液中运行 。将最终的TRF2或RAP1分数合并 ，使用30 kDa Amicon Ultra离心滤器浓缩
，在液氮中闪烁并储存在-80°C下
。为了裂解TEB1 -RAP1融合蛋白，在实验之前 ，将0.24 µM预缩蛋白酶与1.2 µM Teb1 -Rap1在4°C下孵育2小时。 　　For the shelterin complex with and without POT1–TPP1, cell pellets containing all 6 shelterin subunits or all subunits except POT1 and TPP1 overexpressed were resuspended in lysis buffer (50 mM Hepes pH 8.0, 300 mM NaCl, 10% glycerol, 1 mM MgCl2, 10 mM beta-mercaptoethanol, 0.1 µl ml−1 Base muncher nuclease,8 µg mL-1抗生物素
，1 mM AEBSF和无EDTA蛋白酶抑制剂片剂（每50 mL，Roche 1））和细胞通过超声处理裂解 。通过在48,380克离心1 h ，4°C来清除裂解液
。Cleared lysate was passed through a 0.45-µm filter and applied to a StrepTrap column equilibrated with StrepTrap wash buffer (50 mM Hepes 8.0, 300 mM NaCl, 10 glycerol and 1 mM tris-2-carboxyethyl phosphine (TCEP)), which was washed with 20 column volumes StrepTrap wash buffer prior to elution with 5 column volumes StrepTrap wash buffer补充10毫米-desthiobiotin。将洗脱剂（含有最高庇护素浓度的0.5 mL洗脱素）应用于超级糖6 10/300柱以50 mm HEPES pH 8.0
，300 mm NaCl，10％甘油和1 mM TCEP进行预先校准 ，并在同一缓冲液中运行 。将所需的分数等分并闪烁以存放
。全部庇护所综合体的进一步表征将在其他地方报道。 　　将细胞颗粒重悬于50 mM HEPES pH 7.6、1 mM DTT
，1 mM EDTA中，用无EDTA的无EDTA蛋白酶抑制剂片剂（Roche ，每50 mL缓冲液1），并在4°C下搅拌20分钟 。通过将甘油添加到16.7％
，在4°C搅拌30分钟中提取蛋白质。将提取物在41,656g下在4°C下离心30分钟，并将上清液应用于X4缓冲液（50 mm HEPES pH 7.6 ，300 mm NaCl
，NaCl，10％甘油 ，10％甘油
，1 mm DTT，1 mm DTT ，1 mm EDTA）中平衡的链球菌tactin XT 4Flow树脂
。在X4缓冲液中洗涤珠
，并用补充30毫米生物素的相同缓冲液洗脱蛋白质。合并蛋白质级分，将NaCl浓度稀释至100 mM ，然后应用于1 mL肝素柱
，并在20列体积上遵循0.1 m至1 m NaCl的线性梯度 。随后将蛋白质分离在超级螺旋200凝胶过滤柱上平衡并以100 mM NaCl缓冲液（50 mM HEPES pH 7.6，100 mm NaCl ，10％甘油，1 mm DTT
，1 mm EDTA）运行
。将最终的XRCC4 – LIG4分数合并，使用30 kDa Amicon Ultra离心滤器浓缩 ，在液氮中冷冻并储存在-80°C下。 　　通过纳米差异扫描荧光法对所示的纯化蛋白质进行分析
，以使用10 µL毛细血管使用Tycho NT.6（纳米Emper）评估热蛋白稳定性，从而在330°C温度坡道上以330和350 nm的速度监测荧光（35-95°C温度下降） 。 　　[γ-32P] - 标记的PE1（端粒）或PE2（非telomeric）模板（2 nm）与30 nm DNA-PKC和50 nm KU70/80在25 mm HEPES pH 7.6 ，80 mm KCl中混合在一起DTT并在冰上孵育5分钟
。将5 nm庇护素或TRF2-RAP1（TRF2的二聚体浓度）添加到结合​​DNA结合的DNA-PK中
，并在37°C下孵育10分钟。通过将DNase I添加到0.5 U mL -1中开始核酸酶切割，并在37°C下再孵育2分钟 ，然后用25 mM EDTA淬灭
，0.2％SDS，0.2 mg Ml -1蛋白酶K 。在37°C下孵育10分钟后 ，将其固定在37°C下孵育2分钟
，将景点凝聚在phine液中，凝聚力量 ，凝聚液含量，凝聚力量
，凝聚素，凝聚液 ，凝聚成分
。99％甲酰胺
，5 mM EDTA，溴酚蓝。将样品煮沸2分钟 ，并在1×TBE的8％尿素页测序凝胶上运行 。随后使用台风生物分子成像仪（Amersham）将凝胶干燥并暴露于BAS-MS成像板上
。在ImageJ2（V.2.14.0）和Adobe Photoshop（V.25.0.0）中分析了图像
，并使用Adobe Illustrator（V.25.0.0）制备图像。在扩展数据中进行的足迹实验图2B，C如上所述 ，但具有较高的蛋白质和/或DNA浓度
，如图图中所示 。扩展的数据图2C还与sheptin，Ku和DNA-PKC的同时添加进行了进行。 　　[γ-32P]-labelled PE1 (telomeric) template (1 nM) was mixed with 2, 15 or 40 nM TRF2 in 25 mM HEPES pH 7.6, 80 mM KCl, 1.5 mM CaCl2, 1.5 mM MgCl2, 5% glycerol, 50 µg ml−1 BSA, 2 mM DTT.将10 µL反应在37°C下孵育15分钟
。将样品补充1％的蔗糖 ，橙色G
，并在0.5×TBE的1.5％琼脂糖凝胶上运行。与DNase I足迹实验一样，通过磷光成像干燥并分析凝胶 。 　　KU70/80（200 nm）与200 nm RAP1在20 mM HEPES pH 7.6 、200 nm NaCl ，2 mM MGCL2中将其混合，0.5 mM EDTA
，10％甘油，0.5 mm DTT ，0.5 mm DTT
，0.5 mm AEBSF，并在4°C下孵育5分钟
。通过100 nm退火的PE3/PE4 DNA底物补充样品 ，并在4°C下孵育10分钟。通过添加2 mM DSSO交联蛋白
，并在室温下孵育60分钟 。用20 mM Tris pH 7.6停止反应
。样品以标准XT XT 3-8％的三乙酸盐凝胶在1×XT三环中进行，并通过银色染色（Silverquest ，Invitrogen）或免疫印迹分析
，探测KU70（FLAG）或RAP1（strep）（strep）（请参阅“抗体 ”和“抗体
”和“免疫印迹”）。在扩展数据中的交联实验图2i如上所述，使用200 nm TRF2（ΔBΔTRFH）（割裂链球菌标签）与RAP1一起进行 。 　　将链霉亲和蛋白链霉亲和蛋白链霉菌素（IBA）预孵育的PE3/PE4 DNA底物（5 nm）与10 nm Ku70/80/80和15 nm DNA-PKC在30°C下在20°C下在20 mm hepes pH 7.6 ，80 mm kcl
，5％glycerol，0.01％和0卷中 ，在30°C下孵育3分钟
。蛋白质低结合管（α实验室）中的25 µL。加入了5 nm TRF2 -RAP1复合物（TRF2的二聚体浓度），并在3分钟后加入30 nm XRCC4 -LIG4复合物 。再过3分钟后
，将完整的反应添加到1 µl抗FLAG M2磁珠（Sigma）中，并在4°C下在摇动30分钟内孵育30分钟
。将珠子放在磁架上 ，用50 µL 25 mm HEPES pH 7.6
、80 mM KCl
，10％甘油，0.02％NP-40和1 mM DTT洗涤3× ，每次洗涤都有短暂的涡流。将珠重悬于洗涤缓冲液中
，补充了0.25 mg ml -1 3×flag肽，并在18°C下孵化20分钟 。洗脱的蛋白质用SDS载荷缓冲液补充 ，在4–12％TGX预制凝胶（Biio-Rad）上运行
，在80 V上转移至硝酸纤维素膜上90分钟，并通过指示的抗体进行免疫印迹检测（请参阅“抗体和“ Immunopoy ”）。图7b ，C中的下拉实验如上所述
，但具有30-120 nm XRCC4 -Lig4，如所示
。 　　将退火的PE3/PE4 DNA底物（请参见“ DNA模板
”）与TE缓冲链链霉素混合1：1 ，并在室温下孵育30分钟。在40 mM HEPES pH 7.6、100 mM NaCl，3 mM MGCL2 、1 mM DTT中将链霉亲和素结合的DNA稀释至250 nm
，并在4°C下与250 nm Ku70/80/80和250 nm DNA-PKC一起孵育10分钟 。加入250 nm TRF2 -RAP1（TRF2的二聚体浓度），并在4°C下再孵育5分钟
。在冷冻EM准备之前 ，将样品补充了0.05％的CHAP。 　　将铜R1.2/1.3网格（300英寸
，量化）用薄层或碳覆盖，并在15 mA处发光递减30 s（Pelco Easiglow） 。将三个微量的样品应用于发光的电网 ，并使用在4°C和100％湿度下运行的Vitrobot Mark IV（Thermo Scientific）孵育5 s
，然后孵育3 s
。随后在液态乙烷中陷入液化网格。在配备Falcon 4i直接电子检测器（Thermo Scientific）的Glacios Cryo-Tem（Thermo Scientific）上以200 kV的形式获取冷冻EM数据 。总共以150,000×放大倍率（0.94Å像素尺寸）收集了30,604部电影，总电子剂量为50 e -Å -2 ，democus范围为-1.0至-2.5μm（请参阅扩展数据表1）
。随后的图像处理在CryoSparc（v4.3.1）45中进行。使用所有框架
，然后进行贴片对比传输函数估计，使用贴片对齐进行校正电影 。通过基于自动模板的采摘（模板EMD-6803）挑选颗粒 ，并使用96像素的盒子大小以4×binning提取颗粒
。在2D分类之后
，选择了1,464,362个DNA-PK颗粒以重建Ab Initio 3D模型，随后用作使用5个类的异质细化的起始模型。选择了最突出的DNA-PK类 ，并进行均匀的精炼，然后使用包含KU70/80 – DNA核心的聚焦面膜进行局部细化 。使用相同的掩码和十个类别进行了无对准的3D分类
，以识别含有其他RAP1和KU密度的粒子。缺乏RAP1 BRCT的类Rap1 Myb域或Ku70 SAP域被排除在外
。总共526，885个选定的颗粒被重新提取 ，并没有384像素盒的大小
，并通过均匀的细化重建了3D地图。遵循全局对比度转移函数完善，使用均匀的细化将完整DNA末端结合复合物的结构分辨至3.58Å 。KU – RAP1 – DNA核心使用不包括DNA-PKC的聚焦面膜将局部完善至3.32Å
。类似地 ，使用不包括KU – RAP1 – DNA核心的掩码来精制DNA-PKCS – DNA密度
，并使用相同的掩码进行3D分类。观察到DNA-PKC构象的某些灵活性，并选择了最突出的构象的类别 ，其中包含370,172个颗粒 。这些颗粒的DNA-PKCS-DNA结构通过均匀的细化将这些颗粒的DNA结构分辨至3.40Å
，然后使用DNA-PKCS聚焦掩码进行局部细化
。全端结合络合物和局部精制密度的地图在冷冻PARC中得到锐化，并使用phenix（v1.20.1）组合组合combine_focused_maps46。随后 ，Composite Map（EMD-19065）用于COOT47中的模型构建和Chimerax48中的图生成 。 　　使用Chimerax48中的MAP命令
，将人DNA-PK（PBD 7K1K），RAP1 MYB（PDB 1FEX）和KU70 SAP（PDB 1JJR）（PDB 1JJR）的分子模型停靠到冷冻EM图中
。类似地 ，将RAP1 BRCT域（请参阅“ Alphafold建模”）类似地停靠到Cryo-EM图中。使用NAMDINATOR49对地图进行了改进，然后在COOT47中进行了手动检查 。从头开始建模未占用的蛋白质密度和核酸
。最终的模型是使用phenix（v1.20.1）real_space_refinement 50进行了迭代精制
，具有几何和二级结构约束，然后在COOT中进行了手动调整。最终原子模型（PDB 8RD4）的质量通过Molprobity51在Phenix中评估（请参见扩展数据表1） 。 　　使用Alphafold 3在在线Alphafold服务器上使用Alphafold 3分析了全长的Human Rap1 ，Ku70和Ku80
，其中显示了最高的预测。对于扩展数据图9，分析的其他序列如下
。Salmo Salar：NP_001133439.1 ，XP_014030197.1和XP_045561280.1;StrongyLocentrotus purpuratus：XP_030845408.1
，XP_030843748.1，XP_001198957.2;Nematostella vectensis：XP_001641354.1 ，EDO36674.1
，EDO444451.1;Trichoplax Adhaerens：XP_002117640.1，XP_002117043.1 ，XP_002112721.1。 　　使用Proviz Online Tool52分析了预计的蛋白质比对 。 　　用抗体18-2（Invitrogen MA5-13238）在1：100稀释下检测到人DNA-PKC
，用抗体A300-306a（伯特基实验室）的人RAP1在1：4,000稀释下，人类TRF2 ，抗体D1Y5D（抗体D1Y5D）（在1：1，000年）的抗体D1Y5D（抗体d1y5d）
，人为1：1,000的apolla，人为1 ，
，000年349
。抗体）在1：100稀释和抗体T9026（Sigma）1：1,000稀释的人类α-微管蛋白。通过1：1,000稀释的N末端标志（Sigma F1804）通过N末端标记标签检测到重组人Ku70 。重组人LIG4，TRF2和RAP1通过以1：1,000稀释的方式使用抗体AB76949（ABCAM）通过双链球菌标签检测到
。通过1：500稀释使用抗体C-4（Santa Cruz SC-271087）检测到重组人XRCC4。用山羊抗兔IgG-毛radish酶（HRP）（细胞信号7074）或马抗小鼠IgG-HRP（细胞信号7076）二级抗体检测到人蛋白的一抗 。用抗体D9H4（细胞信号5433）以1：1,000稀释 ，用抗体D1Y5D（细胞信号13136）以1：1,000稀释和用抗体8H10D10的鼠标β-肌动蛋白（细胞信号8H10D10（细胞信号3700）以1：4,000的Nakey Anteke Antike antike antike antike antiki antik-rbitig ig
，用抗体d1y5d（细胞信号13136）检测小鼠RAP1，用抗体D1Y5D（细胞信号13136）检测到小鼠RAP1
。Cytiva） ，山羊抗兔IgG-HRP（31460
，Invitrogen）或山羊抗小鼠IgG-HRP过氧化物酶（31430，Invitroen）二抗。 　　先前已经描述了SV40-LT apollofl/fl lig4+/+ ，apollofl/fl lig4 - / - 和trf2fl/flrosa26cre-ert1 mefs先前已经描述了10,53 。先前已经描述了不朽的RPE-1细胞54
。All MEFs were immortalized with pBabeSV40LargeT and cultured in Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM, Cytiva) supplemented with 15% fetal bovine serum (FBS, Gibco), non-essential amino acids (Cytiva), -glutamine (Cytiva), penicillin-streptomycin (Cytiva), 50 µMβ-羟基乙醇（Sigma）。将293 T和凤凰生态细胞（ATCC）培养在DMEM（Cytiva）中
，并补充了10％Hyclone牛Calf血清（Cytiva），非必需氨基酸（Cytiva） ，-glutamine（cytiva）（cytiva）和Penicillin-treptheptycin（cyttiva） 。将RPE-1细胞培养在补充10％（v/v）FBS，1％（v/v）青霉素 - 链霉菌蛋白
，1％谷氨酸，0.5 µg mL-1两栖动物霉素B和0.26％苯甲酸钠的DMEM/F12培养基中。为了通过CRISPR – CAS9介导的基因编辑生成TP53 - / - RPE-1克隆 ，用Cas9 – Sgrna Ribonucleoparticles将细胞靶向序列5'-AAATTTGCGTGTGGTGGAGAGTATT-3'和5'-TCCATCATCATCATCATCGGATATGATGCTGGCTG-3'55'的序列5'-AAATTTGCGTGTGGTGGAGTATT-3'和5'-aATTTGCGTGTGTGGAGTATT-3'55
。4天后
，将单个细胞分类为含有10 µM Nutlin-3A的培养基的96孔板。14天后，扩展了存活的克隆 ，并通过所述TP53基因座的免疫印迹和测序分析了p53状态 。CRISPR – CAS9在TP53 - / - RPE-1中对人RAP1的介导的编辑
，使用磷化型的单链DNA修复模板（SSODN）和OUABAIN的阳性整合体进行选择，如所述57,58
。简而言之 ，将RAP1指南RNA 5'-GGCCCCGCGCGCGCCAGCGT-3'克隆到Addgene Vector 86613的BSPI位点中。ATPA1和RAP1的维修模板由集成DNA Technologies（IDT）合成 。c*a*atgttactgtggtggatgatgagcgattttttttttctttgcttatagcatcatcagctgctgctgctcagaagaagaaggaaggaagaaggaacctcaaaaacgatgacgtgagtgtgtgtgtctgtaattcagcagcatatcatatcgattcgattgattgtgtgtagtagtagtacatacatcagagatc*t*t*t*t*t*t; RAP1：c*a*ttcctcgactctgttcgtcgtgagggaggaggcgcagctcctccatgtccttctctcgtgcggcggccgccccgccgcgcgcgcgcgcgcgcgcgcctctcgacgctcatcatcatcctgcacg
，GCGGCGGCCACGTGTGCGCGGTGCAGGCCCCCGGGCCGGCGCGCGCGCGCTGCTGCCCCAGCCCGCGGGGGCGGCGCGCGCGCGCGCCGCCGCCTCGGGTGTGTGTGTGTGTGATTTCATCTCCACG*c*a，其中 *表示磷酸化碱
。为了生成RAP1（KR/DE）克隆 ，使用10 µL尖端将300,000 TP53 - / - RPE-1细胞用霓虹灯转染系统进行电穿孔
，并在1,350 V和20 ms的两个脉冲中使用500 ng RAP1 RAP1指南RNA/ADDGENE质粒/addgene质粒＃866613，2 pmol of Atp1a Atp1a1a和6 pmodn和6 pmol Rapn和6 pmol Rapn和6 pmodn。为了产生RAP1 - / - 克隆 ，重复该过程省略RAP1 SSODN 。3-4天后，将细胞膨胀成15厘米菜
，并用0.25 µm ouabain处理，然后在药物选择后7-12天分离单个克隆
。根据制造商的说明 ，使用EZNA组织DNA试剂盒制备基因组DNA。使用PCR使用寡核苷酸序列AgtGCTGCGCTTCGCGGC和CGCCTTCCGCTTGAGCTTG进行了RAP1 。通过使用Sali和Sanger测序进行限制消化来分析编辑
，并在冷冻之前对阳性克隆进行单细胞分类和扩展
。对于复古或慢病毒转导，分别使用CAPO4沉淀将总共20 µg的质粒DNA转染分别转染到Phoenix Eco或293个T细胞中。将病毒上清液通过0.45-μm滤光片过滤 ，并补充有4μgml-1聚甲烯
，并用于靶细胞的转导 。lenticrispr v2中含有sgRNA的菌病颗粒（目标：5'-GCAGTCTAGGATGTACTGCG-3'）（addgene质粒＃52961），来自F. Zhang的礼物 ，来自F. Zhang的礼物）
，在目标MEF细胞中引入目标MEF细胞中，每天有三个感染（超过2天）2天或2天2天 ，以4-12 h的速度匹配2天
，并将340 µm湿霉素。使用同样的方法，用含有宽松的颗粒靶向TP53 - / - rpe-1细胞中的人apollo ，其中含有宽松的颗粒，该颗粒含有指南序列5'-CTGGTTCCACAACGCAGCAGCAGCAGCATGT-3'23
， 或非目标控制序列5'-CGCCAAACGTGCCCTGACGG-3'
。对于MEF实验，CRE在两天内每天三种感染（间隔6-12小时） ，PMMP命中和运行的CRE逆转录病毒在凤凰城生态细胞中产生。时间点0是在第一次命中和运行CRE感染后设置的 。对于RAP1补充测定
，用含Rap1，Rap1Kr/de或Rap1r130e的逆转录病毒颗粒转导的ApolloFL/FL MEF在PLPC载体中克隆 ，以6-12-H的间隔总共4个感染
，在2-4 µM Puropy中，在2-4 µM Puropy中选择2-3天 ，以2-4 µm的蛋白paprna proap1 clny clronclna clronclnna clronclna clny
。（Addgene质粒＃91977
，来自J. Mendell的礼物），在340 µm湿霉素中选择了2天 ，然后用PMMP HIT＆RUN CRE转导
，如前所述。对于TRF2弥补测定，用含有TRF2突变体的逆转录病毒颗粒转导TRF2FL/FLROSA26CRE-ERT1 MEF ，在2-4 µM嘌呤霉素中选择2天，然后用1μm4-OHT处理24 h 。时间点0是在4-OHT添加时设置的
。这项研究中的所有细胞系常规测试了支原体污染的阴性。通过全基因组测序验证了RPE-1细胞
，而通过Transnetyx分离后，将MEF自动基因分型 ，以在Apollo或TRF2 Flox等位基因和/或连接酶4删除或RSCRE中存在 。 　　PCR用于删除RAP1结合图案（RBM）或将S367A突变插入MYC标记的TRF2
，TRF2F120A，TRF2ΔIDDR和TRF2F120AΔIDDR等位基因 ，使用PLPC逆转录病毒Vector13中的PLPC逆转录病毒vector13使用以下Primers：TRF2ΔRBMM-F：5'-aatctggcatcccccatcatcac-3';TRF2ΔRBM-R：5'-TCTGCTTGGGGCTCTAAG-3';TRF2S367A-F：5'-GCGCCCAGCCACAACAACAAGAGAGACC-3';TRF2S367A-R：5'-TGATGGGGGGATGCCAGATTAGCAAG-3'
。 　　如前所述59进行小鼠和人类细胞上的端粒鱼。简而言之
，在通过胰蛋白酶消耗收集之前，用0.2 µg ml -1 colcemid（Biowest/Roche）处理细胞2小时 。收集的细胞在37°C的75 mM KCL的低音溶液中肿胀10–20分钟 ，然后在甲醇中固定：乙酸（3：1）在4°C下过夜
。将细胞滴入载玻片上
，并允许过夜。然后将载玻片通过70％，95％和100％的乙醇系列脱水 ，并允许风干 。在杂交溶液（70％甲酰胺
，1 mg Ml-1阻断试剂（1109617601，Roche）和10 mM Tris-HCl pH 7.2）中 ，将端粒末端与Cy3-oo-（ttaggg）3杂交2小时，在最初的5-10 min定型
，在80°°C，两次两次均匀的形式形式上0.1％BSA；10毫米Tris-HCl ，pH 7.2
，每次15分钟，三次介于0.08％的Tween-20；0.15 m NaCl;0.1 M Tris-HCl ，pH 7.2或PBS每个5分钟。对于MEF而言
，将DAPI（D1306，Invitrogen）添加到第二次洗涤中 ，对染色体DNA进行了染色
。将载玻片保持干燥
，并安装在抗剂试剂中（延长金抗p36934，费舍尔）。对于RPE-1单元 ，将气流的载玻片安装在DAPI补充的载体安装介质（矢量实验室）显微照片上
，用于在Deltavision RT显微镜上收集用于小鼠细胞实验的显微照片，RPE-1细胞实验的显微照片与Zeiss axio Opserver Z1 Marianas TM Marospope（Opser Z1 Marianas TM Maroscope（Oppif）（运行旋转磁盘（横川） 。在斐济分析了中期 ，并使用GraphPad Prism绘制了评分融合
。数字是在Adobe Illustrator（V25.0.0）中制备的。如先前所述23对RPE-1细胞的共分析，并对以下修饰进行了修改：用BRDU：BRDC处理RPE-1细胞14小时
，使用BLAK RAY Model UV-21 365 nm手持灯以8 cm的距离用UV处理10分钟的载玻片，并以8 cm的距离进行cy3-cy3-fitcggg-（fitcggg）3（ttcggg）（Ttcaggg）（Ttcggg）（ttcaggg）（CCCTAA）3 。 　　将细胞以5×103或1×104细胞在2×Laemmli缓冲液中裂解 ，并用胰岛素针或超声处理在95°C下在95°C下裂解10分钟
。使用SDS -PAGE分辨出相当于1-2×105细胞的裂解物
，并转移到硝酸纤维素膜中。对于小鼠细胞实验，在含有0.1％（v/v）Tween-20（PBS-T）的PBS中用5％牛奶进行蛋白质印迹 。对于RPE-1细胞实验 ，在补充了0.1％Tween-20的TBS缓冲液中进行了蛋白质印迹
。“抗体 ”部分中描述了其他试剂。使用化学发光蛋白质印迹检测试剂（Cytiva或细胞信号传导或Millipore）开发免疫印迹
，并在Chemidoc（Bio-Rad）成像系统上成像，或使用Amersham HyperFILM MP（Cytiva）和Curix 60 Processor（AGFA） 。在Adobe Photoshop（V25.0.0）中分析了图像 ，并使用Adobe Illustrator（V25.0.0）制备图像
。 　　如“交联
”中所述进行复杂的组装和与DSSO的交联。交联反应后
，将碳酸氢盐缓冲液（TEAB）以100 mm的最终浓度添加到样品中 。用5 mM TCEP和10 mM碘乙酰胺同时降低蛋白质并烷基化，并在最终浓度为50ngμl -1（Pierce）中用胰蛋白酶消化过夜。将样品干燥 ，并使用Xbridge C18色谱柱（1.0×100 mm
，3.5μm，水域）在最终3000 HPLC系统上用高pH反相（RP）色谱分离肽
。流动期A为0.1％V/V氢氧化铵 ，流动相B为乙腈，0.1％V/V氢氧化铵。The peptides were fractionated at 70 μl min−1 with the following gradient: 5 min at 5% B, up to 15% B in 3 min, for 32 min gradient to 40% B, gradient to 90% B in 5 min, isocratic for 5 min and re-equilibration to 5% B. Fractions were collected every 100 s, SpeedVac dried and pooled into 12 samples for mass spectrometry analysis.液相色谱 - 质谱分析在最终的3000 UHPLC系统上与Orbitrap上升质谱仪（Thermo）进行 。将每个肽级分在30μl0.1％甲酸中重组
，并将15μL加载到Apraim Pepmap 100、100μM×2 cm C18
、5μM捕获柱的0.1％最小值流速为0.1％的0.1％formic酸负荷载液
。然后，将肽在赞誉的PEPMAP（75μm×50 cm ，2μm
，100Å）上进行梯度洗脱，C18 C18毛细管柱在45°C下连接到易于涂片的源 ，并带有易于涂抹的发射器（Thermo
，ES991）。流动相位为0.1％甲酸，流动相B为80％乙腈 ，0.1％甲酸 。流速300 nl min-1的梯度分离方法如下：在5-35％B中梯度为80分钟
，5分钟，至95％B ，在95％B处5分钟的Isocratic
，在5分钟内将5％B重新平衡至5％B，在5％的5％B. 380和1 ，1，1
，1，1 ，1
，1，1 ，1
，1，1 ，1
，1，1 ，1分钟内
。在3 s的最高速度模式下以120,000分辨率选择了400 m/z和电荷状态3-8
，并在3 s的最高速度模式下分辨出来，用于踩踏的HCD碎片（碰撞能量（％）= 21 ，27，34）
，四极隔离宽度1.6，OrbitRap检测为30,000分辨率和70毫秒的最大注射时间。将靶向质谱前体动态排除在进一步的分离和激活中 ，为45 s
，质量公差为10 ppm 。在DSSO/+158.004 DA（k）的MS2模式下，在蛋白质组发现器2.4（Thermo）中鉴定交联肽的鉴定
。前体和碎片质量公差分别为10 ppm和0.02 dA ，最多2胰蛋白酶遗漏了裂解。在C处选择氨基甲米甲基作为静态修饰 。搜索光谱与包含Homo Sapiens评论条目的Uniprot Fasta文件
。使用Percolator节点和目标– execoy数据库搜索在FDR <0.01中过滤交联的肽。 　　除了扩展数据中的图1H
，i，重复两次的数据外 ，进行了三个生物学重复 。除了图3C和扩展数据图
，所有其他实验至少要独立复制三次。重复两次的2F，G和7C
。所有复制尝试都是成功的。 　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得 。