化学标准是从以下供应商那里购买的（列出的目录编号）：Taxusin（Targetmol; TN6763），1-羟基苯甲酸I（LKT Labs; T0092） ，Baccatin VI，Santa Cruz Biotechnology; SC-503244）
，10-deacetylbaccatin iiiiiiiiiiiiiiiiiii;D3676），Baccatin III（Medchemexpress; hy-N6985）和9-二氢-13-乙酰基甲虫III（Targetmol; T5132） 。如前所述18 ，合成Taxadien-5α-OL。出租车媒体变量
。hicksii是从快速生长树获得的。 　　与许多植物一样
，出租车物种的细胞通常比标准10倍基因组铬单细胞库设备的直径35 µm的限制大两到三倍 。因此，单细胞隔离方法（例如原生质化）冒着引入严重的细胞型偏差的风险 ，而我们相反
，我们对先前描述的核分离方法52进行了调整为与针叶树兼容的SNRNA-SEQ方案
。出租车媒体变量。Hicksii空中组织（针，茎和芽尺）通过剃须刀和洗涤剂处理手动破坏 ，然后在10x铬平台中进行DNA染色
，荧光激活的细胞排序（FACS）纯化和库合成 。核提取缓冲液（NIB）由5 mM MGCL2，10 mM HEPES pH 7.6、0.8 M蔗糖 ，0.1％Triton X-100和（对于密度匹配以防止在流动过程中的核匹配）1％Dextran T40和2％Ficoll
。在使用当天
，NIB补充了1毫米二硫代醇。在4°C下进行所有Nuclei-traction步骤，并在处理核时使用宽孔移液尖端 。组织收集和加载到铬设备之间的步骤在90分钟内完成 ，以避免RNA丢失
。为了分离核，将大约1 g的T.培养基组织从植物中取出
，并立即将其放在带有10 mL Nib的培养皿中。用新鲜的剃须刀在200 rpm左右手动切碎组织，持续5分钟 ，直到大部分大组织被分解
，然后在4°C轻轻摇动15分钟 。为了去除大碎屑，然后通过堆叠在40μm细胞滤网顶部的100μm细胞滤网中通过干扰组织
。将核在4°C下在300G中轻轻颗粒5分钟 ，并用5ngμl-1 4,6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI
，Thermo Fisher Scientific）和5ngμl-1丙二酰丙二酰胺重悬于1 ml NIB中。使用具有70μm芯片的Sony SH800细胞分选仪，将140,000–200,000个核分类为包含1 ml PBS+的管（PBS ，PBS
， 0.1％牛血清白蛋白和20个U ML -1 Invitrogen核糖核酸酶抑制剂） 。在补充图22中显示了门控策略。在4°C下以300g离心5分钟，然后轻轻重悬于40μlPBS+中
。将核立即加载到10倍基因组铬控制器上 ，并使用V3化学产生文库。图书馆在Illumina NextSeq 3000上进行了测序 。 　　对于多路复用的启发实验
，将出租车针头在深孔96孔板中扰动，并用200μlS培养基（7.5 g l-1 murashige和skoog大量营养素（Fisher） ，3 g L-1蔗糖，pH 5.7）
，并补充了elicitor
。每个时间点（1 、2、2
、3和4天）的每个启发条件（补充表2中列出的17个条件）处理了两个针对两个发育阶段（年轻和成熟）的针（年轻和成熟的条件（在补充表2中列出的17条条件），导致272个组织样品（2个复制为136次扰动） ，对两个针（生物学重复）进行了处理。为了最大程度地减少污染
，将针完全在无菌水中彻底洗涤，然后移至MS板 ，然后将其用透气的人造丝膜（VWR）密封
，并放置在18小时的光周期下 。组织诱导是在交错的时间开始的，因此可以同时收集所有组织
。为了从引起的组织中提取核 ，将所有组织均组合在电线网中
，用水洗涤并遵守上述核 - 萃取方案。 　　Reads were cleaned with Trimmomatic53 and mapped to the genomes of T. chinensis5 with STARsolo (v.2.7.10b)54 (STAR…–runThreadN 32–alignIntronMax 10000–soloUMIlen 12–soloCellFilter EmptyDrops_CR–soloFeatures GeneFull–soloMultiMappers EM–soloTypecb_umi_simple） 。用蜂窝式（V.0.3.0）55去除环境RNA
。使用DoubleTeTection（v.4.2）库56，删除双重组 ，以及具有读数较高的单元格
，或者大多数读取是最表达的基因（PCT_COUNTS_IN_TOP_20_GENES <25）。如果在少于50个细胞中表达，则将基因从分析中除去 。对于集成的UMAP图 ，SCVI用于整合来自多个单细胞实验的细胞57
。Scanpy（V.1.10.1）58用于处理和绘制过滤后的核转录组。为了共表达分析和基因 - 基因相关计算，SCVI归一化57个转录组（8,039个引起的转录组
，3,027个来自年轻组织的天真转录组和6,077个幼稚的转录组，而来自成熟组织的6,077个天真的转录组被聚集在每个状态下的细胞状态（左右） ，并被绕过10个细胞（左右） 。汇总以产生伪库尔克转录组。这些伪库尔克转录组用于计算基因 - 基因相关性
。为了进行模块分析
，通过CNMF Package28运行具有默认参数的CNMF Package28，除了“总模块”）以产生基因模块及其跨单元的用法。分解将观察到的数据集近似为两个较小 ，有意义的矩阵的乘积：（i）基因 - 模块矩阵（每个模块中每个基因的重量值）；（ii）一个单元 - 模块矩阵（每个细胞中每个模块的表达值）（图2C） 。基因 - 模块矩阵的重量值可以用作识别主导每个模块的基因的得分
。 来自同一模块的最高得分基因具有协调的表达模式
，并且可能是同一分子过程的一部分。这种方法适应了单细胞分析中固有的丰富但嘈杂的数据，并揭示了协调基因表达的模式 ，这在线性相关分析中可能并不明显 。例如
，它允许基因处于多个重叠的模块中，这很可能更好地表示如何表达高度分支代谢中的基因
。将“总模块 ”参数从k = 50扫描到k = 400 ，以确定结果对此参数的敏感性（补充图1）。 　　从NCBI（PRJNA493167
，PRJNA251671，PRJNA733140 ，PRJNA427840，PRJNA497542
，PRJNA497542，PRJNA499080和PRJNA49080和PRJNA080和PRJNA NARINGED 53）下载 ，从NCBI（PRJNA493167
，PRJNA251671，PRJNA251671 ，PRJNA427840和PRJNA46408333）下载了先前六项研究的RAW FASTQ文件 。T. chinensis Genome5（Star Map64）
。用numpy计算基因 - 基因相关性。用于计算基因链接图的相互等级（MR）定义为： 　　其中rankij表示基因I与Gene J的Pearson相关等级 。 　　先前已经描述了胞质二萜的促进基因（THMGR和GGPPS）
，胞质TDS1和TDDS2，T5αH ，TAT
，T10βη，DBAT ，T13αη和税务19基因的克隆
。Candidate genes were amplified from T. media gDNA or cDNA (generated with SuperScript IV, Thermo Fisher Scientific) by PCR (PrimeStar, Takara Bio R045B, primers in Supplementary Table 13), and the PCR products were ligated with AgeI- and XhoI- (New England Biolabs) linearized pEAQ-HT vector66 using HiFi DNA assembly mix (New EnglandBiolabs）。默认情况下
，用于克隆的基因注释是从T. chinensis Genome5取出的，但对T.培养基基因组（NCBI PRJNA1136025）进行了爆炸搜索 ，以确定是否可用替代基因模型 。将构建体转化为10β胜任的大肠杆菌细胞（新英格兰生物群）。使用QIAPREP自旋微型套件（Qiagen）分离质粒DNA，并通过全质质粒测序（质粒）验证序列
。 　　使用Freeze-Thaw方法将含有出租车基因的PEAQ-HT质粒转化为tumefaciens（菌株GV3101）细胞。在细菌筛选培养基523-Agar（植物学实验室）上生长
，分别在30°C下为30°C，分别为523个培养基 ，分别为523培养基
，分别为523μgml-1 。然后在523-卡纳米霉素 - 金胺液培养基中在30°C下拾取单个菌落并在30°C下生长
。过夜培养物用于在-80°C冰箱中长期存储二甲基亚磺氧化二甲基（DMSO）（7％DMSO）。对于常规的本塔米亚省浸润实验，将单个农杆菌DMSO库存在含有卡纳米霉素和庆大霉素的523- agar上划分 ，并在30°C下生长约一到两天 。使用10μl接种环从单个板中刮下细胞斑块
，并重悬于大约1-2 ml的农杆菌诱导缓冲液中（10 mM MES pH 5.6、10 mM MGCL2和150μm乙酰灵酮； ACROS Organics）中的2-mL单个2-mL Safe-Lock-lockics（Acros Organics）
。将悬浮液短暂涡旋至均匀性，并在室温下孵育2小时。测量了单个农杆菌悬浮液的600 nm（OD600 nm）的光密度 ，并且最终的浸润溶液在每个菌株中的OD600 nm为0.2（TDS
，TDS，T7AT和T7DA除外 ，OD600 nm除外
，分别为0.6 、0.4和0.1），是通过混合了单个和散布的 。使用无针头的注射器从弱点浸润四周大的本塔米亚氏菌叶
。每个实验在同一n. benthamiana植物的叶子6
、7和8（通过计数）上进行了测试 ，作为三个生物学重复。 　　对于涉及TBT的途径的重构，对上述程序进行了以下修改
，以增加所需的苯甲酰化产品的产生：在水中用2 mM苯甲酸在水中用2 mM苯甲酸浇水（pH 5.6 pH 5.6）（pH 5.6）（pH 5.6），在农业浸润前的ph and anzoic condict and ph to to ph 。农杆菌的重悬和最终浸润溶液的制备
。 　　通过扫描使用Jackhmmer36（命令：Jackhmmer -o tempout.txt -e 1e -5 -n 4） ，通过扫描千植物转录组（1KP）67
，RefSeq植物和Uniprot viridiplantae数据库来鉴定FOTO1同源物。丢弃了与原始查询的序列差距大于40％的命中 。使用FastTree68的剩余蛋白质序列生成系统发育树。 　　农杆菌浸润五天后，使用直径为1 cm的叶盘切割器收集到本米亚氏菌叶组织 ，并放置在2-ML安全锁管（Eppendorf）内
。每个生物复制由同一叶子的四张叶盘组成（大约40毫克新鲜重量）。叶盘闪烁并冻干过夜 。通过GC – MS进行了更疏水的代谢产物（例如
，化合物1-6）的分析，对更亲水的代谢产物（例如 ，化合物4-18）进行了分析
，是通过液相色谱 - 质量 - 质量光谱法（LC – MS）进行的
。为了提取代谢物，将乙酸乙酯（ACS试剂级； J.T.面包师）或75％的乙腈（高性能液相色谱（HPLC）级； Fisher Chemical）在500μl水中分别与GC – MS或LC – MS分析的5 mm不锈钢一起 ，将500μl水加入每个样品中。将样品在25 Hz的球厂（RETSCH MM 400）中匀浆2分钟 。均质化后
，将样品以18,200克离心10分钟
。对于GC – MS样品，将上清液转移到50μl玻璃插入物中 ，放置在2 mL小瓶中，并通过GC-MS仪器进行分析。对于LC-MS样品
，使用96孔亲水性PTFE过滤器过滤上清液，孔径为0.45μm（Millipore） ，并通过LC-MS仪器进行分析 。 　　使用Agilent 7820a气相色谱系统分析GC -MS样品
，该系统耦合到Agilent 5977b单四极杆质谱仪
。用Agilent增强的MassHunter收集数据，并通过MassHunter定性分析B.07.00进行分析。使用Agilent VF-5HT色谱柱（30 m×0.25 mm×0.1μm）进行分离 ，恒定流速为每分钟1 ml 。以10：1的拆分比例设置在280°C的分裂模式下将入口设置为
。注射体积为1μL。烤箱条件如下：在130°C下启动并保持2分钟
，每分钟8°C坡道至250°C，以每分钟10°C的速度坡道至310°C ，并在310°C下保持5分钟 。后运行状况设置为320°C 3分钟。在4分钟溶剂延迟后
，以50-550 m/z的质量范围为50-550 m/z收集MS数据
。MSD传输线设置为250°C，将MS源设置为230°C ，并将MS Quad设置为150°C。 　　在我们的两种仪器中分析了LC – MS样品：（1）与安捷伦6520 Q-TOF质谱仪耦合的Agilent 1260 HPLC系统
，或（2）Agilent 1290 HPLC系统耦合到敏捷6546 Q-TOF质谱仪 。通常，6520系统对更多的疏水代谢产物（例如4-6）显示出更好的敏感性 ，而6546系统则可以更好地效果，可以使更多的亲水性
，高度改良的紫杉烷越来越有效
。使用Agilent Masshunter工作站数据采集收集数据，并通过Masshunter定性分析10.0进行分析。使用Gemini 5-μmNX-C18 110-Å色谱柱（2×100 mm; Phenomenex）与水中（a）中的0.1％甲酸的混合物（a）和0.1％甲酸（B）中的0.1％甲酸（B）在室温下为400μl的恒定流量 。对于6520或​​6546系统 ，注射体积分别为2μL或1μL
。The following gradient of solvent B was used: 3% 0–1 min, 3%–50% 1–2 min, 50%–97% 2–12 min, 97% 12–14 min, 97%–3% 14–14.5 min and 3% 14.5–21 min (6520 system) and 3% 0–1 min, 3%–50% 1–5 min, 50%–97% 5–10 min, 97% 10–12 min,97％–3％12–12.5分钟和3％12.5–15分钟（6546系统）。使用电喷雾电离（ESI）以正态模式收集MS数据
，质量范围为50–1,200 m/z，速率为每秒一个频谱（6520系统） ，或以100-1,700 m/z的质量范围为正模式的双AJS ESI
，每秒质量为100-1,700 m/z，每秒频谱速率为每秒（6546个系统） 。The ionization source was set as follows: 325 °C gas temperature, 10 l min−1 drying gas, 35 psi nebulizer, 3,500 V VCap, 150 V fragmentor, 65 V skimmer and 750 V octupole 1 RF Vpp (6520 system), or 325 °C gas temperature, 10 l min−1 drying gas, 20 psi nebulizer, 3,500 V VCap, 150 VFragmentor ，65 V撇渣器和750 V Octupole 1 RF VPP（6546系统）
。除非另有说明
，否则使用[M+ Na]+作为前体离子生成MS/MS片段，并用碰撞能量为30 eV。 　　图5i中的样品通过安捷伦1290 HPLC系统进行分析 ，该系统耦合到Agilent 6470三倍四极杆（QQQ）质谱仪
，以准确量化Baccatin III的浓度 。通过Agilent Masshunter工作站数据采集收集数据，并通过MassHunter定量分析10.1和Microsoft Excel进行分析
。使用Zorbax RRHD Eclipse加上C18柱（2.1×50 mm ，1.8 µm； Agilent），在水（A）中的0.1％甲酸的混合物（A）和0.1％甲酸（B）中的0.1％甲酸在30°C的恒定流量下以恒定的流速为600μl。注射体积为0.5μl 。使用了以下溶剂B梯度：30％0-1分钟
，30％–100％1-5分钟，100％5–6.5分钟 ，100％–30％6.5-7分钟和30％7-8分钟。使用AJS ESI以正模式收集MS数据
。多重反应监测用于监测24 eV的碰撞能量的609.2至549.2离子过渡
，而在32 eV的碰撞能量为预选赛时，在24 eV的碰撞能量中监测609.2至427.1离子过渡。将电离源设置为如下：250°C气温 ，12 l min -1干燥气体
，25 psi雾化器，300°C的鞘温度 ，12升Min -1鞘液流量
，3,500 V VCAP，0 V喷嘴电压 。 　　补充表12中所示的生物合成基因的组合 ，用于纯化出租车（6）
，Taxusin（6'），1β-羟基taxusin（6-O1）（6-O1）和15-Hydroxy-11和15-羟基-11（15→1）Abeo-Taxusin（6- abeo-taxusin（6- a--o）
。将冻干的本奈米亚乳杆菌材料切成小块 ，并用1 l乙酸乙酯（ACS试剂级； J.T. Baker）在室温下以2-L烧瓶的形式萃取48小时，并持续搅拌。使用真空过滤过滤提取物
，并使用旋转蒸发干燥 。两轮色谱法用于分离感兴趣的化合物
。补充表12中总结了每种化合物的色谱条件。简而言之，使用装有P60硅胶（Silicycle）的7厘米直径柱进行了第一个色谱法 ，并使用己烷（HPLC等级； VWR； VWR）和乙酸乙酯作为移动相 。第二种色谱法在使用Milli-Q水和乙腈作为移动相的自动生物生物赛SELEKT系统上进行
，其SFärC18Duo 6-G色谱柱进行
。LC -MS分析了分数，以鉴定包含感兴趣化合物的人。使用旋转蒸发（第一轮）或冻干（第二轮）将所需的部分合并并干燥 。通过NMR分析纯化的产品
。 　　CDCL3（ACROS Organics）用作所有NMR样品的溶剂。使用VNMRJ 4.2在室温下在Varian Inova 600-MHz或Bruker NEO 500-MHz光谱仪上获取1H ，13C和2D-NMR光谱
，并在Mestrenova v.14.3.14.3.1-31739上处理和可视化数据 。通过使用残留溶剂（CDCL3）峰作为内标（1H的77.16 ppm，13C化学移位为77.16 ppm） ，通过使用残留溶剂（CDCL3）峰来报告化学位移。使用Mestrenova V.14.3.1-31739分析并处理光谱
。 　　出租车基因使用上述农杆菌介导的浸润方法在本氏乳杆菌叶片中表达。农杆菌浸润后三天（纯化的3O2A（4）
，Taxusin（6），10-二甲基巴accatin III或9-Dihydro-13-13-乙酰基苯甲蛋白III III（13）；除非另有指定 ，除非另有指定
，否则使用了10 mm dmso的储备，否则将其溶解为100-μm 。每片叶子使用大约150μl的溶液产生直径约3厘米的圆 ，该圆被标记为参考
。18-24小时后，用直径为1厘米的切割机收集了四个叶盘
，并按照上述方法制备LC-MS样品。 　　使用PFAM选择了来自T. Chinensis基因组的序列以鉴定672 P450（PF00067），218 2-ODD（PF03171）和195个酰基转移酶（PF02458） 。将P450进一步过滤到超过300个氨基酸（467 P450）的那些P450
。使用Clustal Omega对每个家族进行了多个序列比对 ，并使用基因素（V.2024.0.4）中的邻居加入方法（V.2024.0.4）构建系统发育树
，并具有100个自举重复次数以进行初步分析。拟南芥肉桂4-羟化酶（ATC4H，登录NP_180607.1） ，A 。Thalianagibberellin 20-氧化酶1（ATGA20OX1
，登录NP_194272.1）作为P450、2-ODD和酰基转移酶家族的外群
。除非另有说明，否则使用默认设置进行所有分析。然后选择来自初始分析和紫杉醇生物合成基因的代表性基因 ，以使用1000个自举重复的邻居加入方法选择最终的系统发育树（扩展数据图9） 。 　　所有蛋白质均从BL21DE3细胞（新英格兰Biolabs
，C2527H）中表达的标准PET28A载体纯化
。将FOTO1和FOTO1（ΔCTERM）纯化为C末端融合：HIS6-3×FLAG-TEV-TEV-MTURQ2-GSG-FOTO1。用N末端纯化标签（His6-3×FLAG-TEV-enzyme）纯化T5αH和TD，除去了N末端信号肽（去除T5αH ，47个氨基酸；去除TDS2
，60氨基酸） 。如前所述，将蛋白质纯化 ，并在4°C下进行溶液后步骤。简而言之，以0.3 mM IPTG诱导的OD600 nm生长1升OD600 nm
，并在18°C下过夜16小时
。将细胞颗粒裂解在裂解缓冲液（0.5 m NaCl，20 mM HEPES pH 8.0 ，0.1％Triton X-100
，1 mg Ml-1溶菌酶，Halt Protease Cocktail（Thermo Fisher Scientific）和1μlML-1 DNase I（New England bailland babs）中的1μlML-1 DNase I（New England Biolabs）通过Sclimicative ，Clarifified
，Clarififified，Clarifified ，Clarifified
，Clarifififififified，Clarrifififif。将蛋白质纯化在经过平衡的Ni-NTA珠（新英格兰Biolabs）上 ，并换成蛋白质储存缓冲液（10 mM HEPES-KOH pH 8.0
，50 mm KCl，10％甘油 ，1 mm DTT和1 mm EDTA） 。通过Bradford分析对纯化的蛋白质进行定量，并使用SDS -PAGE凝胶来验证蛋白质大小和正确的蛋白质浓度
。 　　对于每个多尺度热体实验
，首先将一种蛋白质用纳米机HIS标签标签试剂盒（红色Tris-NTA V2，MO-L018）标记为30分钟 ，在室温下根据试剂协议。MST实验在100 nm的PBS中
，具有0.05％Tween-20的PBS，其标记的查询蛋白（T5αH-或TDS标记）和靶蛋白的滴定系列 。 　　渗透后四天收获了烟熏本米亚叶
。将叶组织在液氮中匀浆 ，并在提取缓冲液（50 mM Tris pH 7.5 、150 mM NaCl
，0.6％NP-40
、0.6％CHAPS和1 mMβ-羟基乙醇）中重悬于70。将裂解物保持在冰上，并在4°C下以20,000克离心10分钟 。澄清提取物的蛋白质含量由布拉德福德测定法（ABCAM ，119216）确定
。在结合缓冲液（50 mM Na2HPO4
，25 mm柠檬酸，pH 5.0）中 ，将十微晶的蛋白质G涂层磁珠（Invitrogen
，10003d）洗涤，然后在用1μL抗V5抗体在室温下在室温下孵育1小时。在搅拌下将裂解物与指定化合物孵育15分钟 。然后将抗体结合的珠在萃取缓冲液中洗涤两次 ，并在室温下搅拌15分钟，裂解液对应于100μg的总蛋白质含量（约40μl）
。孵育后
，将珠子复合物在提取缓冲液中洗涤3次，并与LDS样品缓冲液（Invitrogen ，np0007）混合
，以通过免疫印迹进行后续分析。 　　在使用Bio-Rad Trans-trans-blot涡轮转移系统（Bio-Rad，1704150）转移到PVDF膜上之前 ，将裂解物在80 V（Invitrogen
，np0321）上分离1.5 h 。将免疫印迹与指定的抗体（1：1,000的抗V5在1：1,000时，抗HA-HRP在1：2,500时）在搅拌下在室温下3小时。随后将印迹洗涤并与HRP - 蛋白G（Genscript ，M00090）孵育1小时
，然后在Ibright FL1500成像系统上成像（Invitrogen，A444241）
。提取缓冲液是根据先前发表的程序进行调整的70。 　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得 。