人A1R，人β1AR ，标记的人β2AR，鼠CB1R
，人D1R，人M1R ，人PTH1R和人V1AR构建体遵循标准克隆程序
，将其克隆到pcDNA5/frt骨架中 。痉挛传感器构建体的组装如前所述，在域之间用Gly-ser-gly重复序列（受体-4×GSG-MCITRINE-4×GSG-10 NM ER/K Linker-4×GSG-Mcerulean-4×GSG-GSG-GSG-G肽）28。通过2×GSG接头分离受体荧光蛋白融合构建体
。PTH1R荧光素酶互补报道构建体具有与带有LGBIT/SMBIT荧光素酶片段（Promega N2014）的痉挛传感器构建体相同的基本拓扑结构。Linker-4×GSG-TAGRFP-3×GSG-SMBIT-4×GSG-G肽） 。使用修改的位置定向诱变程序对各种构建体进行了各种受体构建体的点突变44
。使用Q5位置的诱变方法（新英格兰Biolabs E0554）将大量的ICL3缺失引入受体构建体中。使用基于BSMBI-V2的载体组装方法（新英格兰Biolabs E1602）引入PTH1R插入 。根据标准克隆程序 ，将NB6B9（NB6B9-2×GSG-SNAP TAG-FLAG-2×GSG-6×HIS）克隆到PBIEX1骨架中
。tRNA/合成酶质粒（PIRE4-azi）是艾琳硬币（Addgene质粒＃105829
，rrid：addgene_105829）的礼物。卡马酰胆碱氯化物（14486）购自Cayman Chemical 。合成精氨酸8加压素（CIFQNCPRG-NH2），SPEP（dtenirrvfndcrdiiiqrmhlrqyell） ，qpep（dtenirfvfaavkdqlnkeynlv）（n-Biotin-dtenirrvfndiiiqrmhlrqyell）和pth1-34（svSeiqlmhnlgKhlnSmerveWlrkKlqdvHnf）购自Genscript
。3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（IBMX）
，阿普那洛尔，抗坏血酸 ，牛血清白蛋白
，铜II硫酸盐，福斯科林 ，异丙肾上腺素（+） - 比特拉特酸盐盐，鸡蛋白溶菌盐
，鸡蛋白，鸡蛋白 ，马otoprolololate
，Motopolololatarate，Motopolololate ，Motopolol tartarate
，Motopolololate 抗坏血酸钠和X-三分法HP转染试剂购自Sigma-Aldrich。[125i]（±） - 丙糖旋酚（NEX174）购自Perkinelmer 。4-azido--phenylalanine (1406), AZDye488-Alkyne (1277), AZDye546-Alkyne (1285), 2-(4-((bis((1-(tert-butyl)-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl)amino)methyl)-1H-1,2,3-triazol-1-yl)acetic酸（BTTAA； 1236），CY3-Alkyne（TA117）和OG 488-Alkyne（1397）是从Click Chemistry工具中购买的
。Atto488-Alkyne（AD 488-141）购自Atto-Tec。聚乙烯亚胺（PEI）25 kDa线性聚合物购自PolySciences（23966） 。通过在80°C的无内毒素水中重构聚合物 ，并通过0.2 µM注射器滤光片将聚合物重新构成1 mg ML-1溶液；无菌PEI溶液存储在-20°C。Ni-nta琼脂糖（QIA30210）购自Qiagen
。PNGase F（P0704）Snap-Surface 488（BG-488
，S9124S）和链霉亲和素涂层的磁珠（S1420S）购自新英格兰Biolabs。DNase I（04716728001），纤连蛋白（F1141）和正常山羊血清（G9023）购自Millipore Sigma 。抗Ha-Alexa488（A-21287） ，甲醛（CAT＃pi28908）和延长钻石抗fade山脉（P36970）购自Thermofisher
。2-芳基甘油甘油（1298）
，盐酸多巴胺（3548）和N6-环戊酰腺苷（1702）购自Tocris。所有试剂均根据制造商的规格进行了重构和储存 。 　　HEK 293T FLP-IN T-REX细胞（Thermofisher，R78007）在Dulbecco的改良鹰培养基中培养 ，该培养基补充了10％（v/v）胎牛血清，20 mM HEPES pH 7.4
，并在37°C的5％CO2以37°C培养
。细胞未经认证，也没有对支原体污染进行测试。 　　对于膜制剂 ，将细胞转移到约50％汇合处的15 cm菜肴上 。对于每15厘米盘
，将18 µg DNA，63 µL PEI和900​​ µL Opti-MEM组合在一起 ，孵育15-30分钟
，并与重悬的细胞结合
。转染和传递后4小时，更换培养基。将受体转染（β2AR-霉菌）孵育20小时 ，将GS肽传感器转染孵育23小时
，然后将GQ肽传感器转染孵育26小时 。 　　对于第二枚信使分析，在转染前一天以30–40％的汇合度接种细胞
。对于一个6孔板的每个孔 ，将1 µg DNA
，3 µL X-三分元HP和100 µL Opti-Mem组合在一起，将其孵育15-20分钟 ，并添加到种子井中。随着每个构建体的最佳表达时间变化，并且随着单元格数的数量
，每秒允许分析的多个时间点进行转染 。 　　对于PTH1R荧光素酶互补报道测定法，在12孔板上转染25–30％汇合的前一天 ，将细胞播种。对于每次转染
，将0.5 µg DNA，1.5 µL X-三分法HP和100 µL Opti-MEM组合在一起 ，孵育15-20分钟
，并添加到种子井中
。对于每个突变体，PTH1R – GS肽 ，PTH1R -GQ肽和PTH1R-（无肽）构建体的构建体被平行转染。在收集前24小时转染了SPEP和QPEP构建体
，在收集前18小时转染NO肽构建体 。 　　通过用琥珀（TAG）终止密码子代替单个氨基酸来产生β2Ar-On-nosensense突变体
。为了最大程度地减少非结构化β2ARC-tail对FRET测量的影响，所有β2AR构建体均使用截短的受体C末端（Δ350–413）。按照先前描述的程序20进行停止密码子置换转染 。简而言之 ，在0.5 m NaOH中以0.5 m的库存制备了0.5 m的Azi
，并通过0.2 µm的注射器过滤器过滤
。将新鲜的AZI储备量加入约50％汇合15 cm菜肴中，并在0.5 mm的最终浓度下孵育1-2小时。按照与膜制剂相同的转染程序 ，与β2AR胡说八道突变质粒和pire4-azi共转染 。将0.5 mM Azi添加到变化的培养基中
。收集前40-44小时转染。在没有AZI和PIRE4-AZI的情况下，进行了野生型对照（扩展数据图2和3A – D） 。在AZI和PIRE4-AZI的存在下进行了标记对照（扩展数据图3E – G）
。 　　通过在室温下在PBBS中稀释的0.01 mg ML-1纤连蛋白在室温下稀释的0.01 mg ml-1纤连蛋白中孵育覆盖片
，制备纤连蛋白包被的盖玻片。孵育后，将盖玻片转移到细胞培养皿中 。将HEK293细胞以30％的融合播种并孵育24小时。按照“终止密码子更换”的方法转染细胞 ，缩小到6孔盘（1 µg DNA
，3.5 µL PEI和100 µL Opti-MEM）
。表达24小时后，将培养基从培养皿中吸出 ，并用PBS洗涤3次。使用在室温下在PBS中稀释的4％甲醛的溶液固定细胞 。用PBS将盖玻片洗涤3次
，以去除剩余的甲醛
。 　　用延长的钻石抗弹药安装的盖板在室温下左钻，过夜以治愈。为了进行成像 ，将盖玻片用凡士林/羊脂/石蜡密封 。使用60倍油浸入物镜（Nikon）上的尼康A1RSI激光扫描共聚焦显微镜上获取图像
。 　　通过用培养基刮擦和移液吸管来收集细胞
，并在磷酸盐缓冲盐水（PBS；每15 cm 10 cm菜肴10 mL）中洗涤两次（300G，5分钟 ，室温）。Cell pellets were resuspended in chilled hypotonic buffer (10 mM HEPES pH 7.4, 1 mM EGTA, 1 mM DTT, 1.5 µg ml−1 aprotinin, 1.5 µg ml−1 leupeptin, 5 µg ml−1 PMSF; 5 ml per confluent 15 cm dish) and incubated for 30 min on ice.将溶液轻轻地裂解在冷藏的液均匀均匀均匀的均匀均匀均匀的均匀均匀均匀均匀的均匀均匀均匀均匀的均匀均匀均匀均匀的均匀均匀均匀均匀液中 。通过离心（1,000g
，2分钟，4°C）将核和完整的细胞与裂解物分离
。离心裂解液（135,000g ，25分钟，4°C）。将旋转的裂解物重悬于测定缓冲液中（20 mM HEPES
，150 mM NaCl，10 mM KCl ，5 mM MGCL2；每15 cm的细胞盘1毫升） 。然后将颗粒匀浆
，首先通过10毫升微管，然后穿过10倍的针头10次
。裂解液在相同的过程后再次以135,000克离心 ，并重悬于补充12％蔗糖的测定缓冲液中（w/v;每15 cm盘0.5 ml）。像以前一样重复颗粒匀浆 。1:20在测定缓冲液中的1:20稀释的1:20微粒用于分析荧光光谱（Fluoromax 4
，Horiba Scientific）。光谱用于确认表达水平（Mcerulean峰值发射（激发430 nm，475 nm）：光密度发射（激发430 nm ，发射450 nm）比为1.0±0.2）和传感器完整性和传感器完整性和麦邻苯二甲酸峰峰（麦邻苯甲；峰峰值发射（激发490 nm
，490 nm，排放525 Nm）：MCERIAN 430 NMSISISITION 430 NM SISSITITION 430 NM SISSITION 430 NM SISSITION 4332.0±0.2）
。重悬的裂解物是等分的 ，在液氮中闪烁
，并储存在-80°C下。 　　按照上述过程制备了细胞膜（扩展数据图3J – M），但在较高的细胞浓度（每15 cm盘中1.5 ml低音缓冲液）下 ，在低音缓冲液中没有EGTA或DTT，以防止点击反应的效率降低 。悬浮均匀化后
，将以下试剂添加到膜混合物中（括号中的最终浓度）：按照上述过程制备细胞膜，但在较高的细胞浓度下（1.5 ml每15厘米盘的1.5 mL低渗性缓冲液） ，并且在低血压缓冲区中没有EGTA或DTT
，以防止无点击反应的效率
。悬浮均匀化后，将以下试剂添加到膜混合物（括号中的最终浓度）中：NaCl（250 mM） ，KCL（10 mM）
，MGCL2（5 mM）（5 mM），牛血清白蛋白（1 mg ML -1）（1毫克ML -1）（2 ml最终）。将染料和标记试剂预先混合并在冰上孵育1分钟 ，然后以以下最终浓度添加到裂解物混合物中：20 µM Azdye488-Alkyne
，250 µm BTTAA，BTTAA ，50 µM铜（50 µm铜（）硫酸盐和2.5 mm硫酸盐和2.5 mm硫化钠 。将反应与轻度摇动（500 rpm）在25°C下孵育30分钟
。 　　通过第一个超速离心步骤（135,000g
，25分钟，4°C） ，按照“粗细细胞膜提取物 ”的过程制备细胞膜。用1 mL测定缓冲液冲洗3次，然后重悬于（括号中的最终浓度）：HEPES（20 mm）
，NaCl（250 mM），KCL（10 mM） ，MGCL2（5毫米）
，牛血清白蛋白（1 mg ML-1），dye（1 mg ML-1） ，dye（1 mg ML-1）Azdye546-Alkyne
，Cy3-Alkyne和/或OG 488-Alkyne）（5 µM），BTTAA（5 mm）和铜（5毫米）硫酸盐（50 mm） 。首先通过10毫升微型夹 ，然后穿过20口针10次
，首先通过1 ml微孔液均匀化溶液
。为了启动反应，将抗坏血酸钠（50 mm）添加到混合物中 ，并通过移液（2 mL最终体积）混合。将反应与轻度摇动（500 rpm）在25°C下孵育30分钟 。 　　按照“荧光寿命测定和标记对照”的程序制备膜（扩展数据图3E
，SNAP-标记标记），并带有修改的标记缓冲液配方（括号中的最终浓度）：BG-488（10 µM） ，DTT（1 mm）
。未将BTTAA或铜（）硫酸盐添加到混合物中。溶液是匀浆，首先通过10毫升微型夹板10次
，然后穿过20口针10次（500 µL最终体积） 。将膜在37°C下孵育30分钟。 　　对于上面的三个标记程序，使用离心（1,000g ，2分钟）去除聚集的裂解物
。如上所述
，对裂解物进行了超速离心。在第一个超速离心步骤之后，用1 mL测定缓冲液冲洗裂解液颗粒10次 。冲洗后 ，如上所述处理颗粒
。 　　To assess expression and labelling efficiency, lysates were diluted 1:10 in optical quartz cuvettes (3-3.30-SOG-3, Starna Cells), and assessed by fluorescence spectroscopy Horiba Fluoromax 4 Fluorometer using the following parameters for the indicated fluorophores: AZDye488/ATTO488/Oregon Green: excitation at 470 nm, emission scan from500 nm – 650 nm;Mneongreen：光学石英比色杯中的样品
，470 nm的激发，从495 nm – 600 nm发射扫描；Azdye546：光学石英比色杯中的样品 ，540 nm的激发
，从555 nm – 620 nm发射扫描；CY3：光学石英比色杯中的样品，在535 nm处的激发 ，从550 nm – 620 nm和TAGRFP的发射扫描：540 nm的激发
，从565–600 nm发射扫描。裂解物的1:10也用作分析寿命测量 。将裂解物等分，闪光冷冻并储存在-80°C下
。 　　在测定缓冲液中将膜稀释1：5。根据制造商的协议（Biorad 5000111） ，使用DC测定法（Biorad 5000111），使用DC测定法（0 、0.4、0.8
、1.2 ml -1）测定15 µL样品的蛋白质含量（0、0.4 、0.8
、1.2 mg ml -1） 。使用吸光度（Tecan Spark Plate读取器
，750 nm，9 nm带宽 ，25个闪光灯）检测到直流测定
。该蛋白含量估计用于计算FMOL MG -1中的膜BMAX值。 　　Membranes containing expressed β2AR constructs were diluted (equivalent of 10,000 mCerulean counts (excitation 430 nm/emission 350 nm) per 200 µl reaction, or ~0.7 µg) in assay buffer supplemented with 30 µM of either Qpep or Spep (depending on condition), 1 mg ml−1 Bovine Serum Albumin, 10 mM GTPγS, and 1 mM抗坏血酸并短暂超声 。将[125i]（±） - 氯吡迪尔醇的浓度增加添加到膜样品中
。通过在存在1 mM alprenolol的情况下重复上述相同的测定条件
，评估了非特异性[125i]（±） - 丙二醇结合。将反应在96孔深井板上在冰上平衡90分钟 。反应转移到多屏板（Millipore Sigma Mafcn0b50）中。使用真空歧管（Millipore Sigma MSVMHTS00）通过GF/C过滤器，并用200 µL冰冷的Tris-buffered Saline（50 mM Tris pH 7.4 ，150 mm NaCl）洗涤5次
。过滤器被空气干燥
，从板上取出，并转移至75毫米玻璃管。通过自动伽马计数（Perkinelmer Wizard2）测量了滤波器结合的125i 。由于在测定中使用的受体浓度高 ，因此[125i]（±） - 丙蜜醇和非特异性[125i]（±） - 每种反应条件的氯泊多洛尔信号均适合饱和结合曲线
，以获得[125II]（KD）的平衡离心常数（KD）值，以获得[125II]（KD）的平衡曲线
。在技​​术重复项中进行了结合测定。收集了三种生物学重复 ，每个重复都有不同的膜制剂 。 　　按照与放射性标记的拮抗剂结合测定法重悬于含有表达β2AR传感器的膜
。亚饱和[125i]（±） - 丙二醇（最终50 pm）和异丙肾上腺素浓度的增加被添加到重悬的膜样品中。在1 mm alpronolol存在下
，通过测量50 pm [125i]（±） - 氯苯二莫尔醇的测量来评估非特异性[125i]（±） - 环旋酚结合 。使用50 pm [125i]（±） - 丙糖旋醇未经竞争的未标记配体，评估了最大[125i]（±） - 环旋旋酚信号
。根据上面列出的放射性拮抗剂结合测定法 ，对反应进行平衡，洗涤和测量。使用在放射性拮抗剂结合测定中获得的[125i]（±） - 丙二泊莫尔的平均解离常数（KD）值
，结合[125i]（±）甲莫托醇和非特异性[125i]（±）cryanopindolol信号的convertion commistion for constripiour constripiriul for i constriif for and constripation for i convistion constripition constripition constripition constripiriul constrip contribiul constripation for（降低） 。异丙肾上腺素： 　　其中y是与受体结合的[125i]（±） - 丙糖醇的百分比，BMAX是与受体结合的最大百分比[125i]（±）甲环旋酚 ，BMIN是最小[125i]（±）氯酚与受体结合
，与受体结合，浓度是Isoprotrationol的浓度
。对于两点结合（WT + QPEP条件） ，使用以下模型： 　　其中F1是亲和力位点1的位点的比例
，IC50,1是亲和力位点1的IC50，而IC50,2是位点2的IC50。这些IC50值的加权平均值用于比较目的和抑制常数（KI）计算 。使用Cheng -Prusoff校正将IC50值转换为Ki值46如下： 　　其中l是[125i]（±） - 氯吡托尔的浓度 ，而KD是[125i]（±） - 氯吡托在拮抗剂结合测定中确定的平衡分离常数。在技​​术重复项中进行了结合测定
。每种重复的膜制剂都收集了三个生物学重复。 　　用100 µg mL-1甲苯林的五百毫升肉汤用e600 = 0.05的NB6B9载体转化为nb6b9载体 。随着摇动（180 rpm）
，在37°C时在37°C下生长至A600 = 0.8
。然后，用0.4 mM IPTG诱导培养物 ，并在16°C下在16°C下孵育16小时（180 rpm）。该培养物在3,000克时颗粒15分钟 。然后将沉淀重悬于30 mL裂解缓冲液中（20 mM HEPES pH 7.4、150 mM NaCl
，10 mM咪唑，10 mM MGCL2 ，5 mM Cacl2，1 mg Ml -1 ll -1溶菌酶
，1 µg ml -1 µg ml -1 dnase I，1 mm dnase I ，1 mm dttt
，1 mm dtt，1 mm dtt ，1 µg ml -leept
，1 µg ml -1 µg ml -1 µg ml -lewt，1 µg mL0.1 µg ml-1 pmsf ，1％V/V Triton X-100）
，在轨道振动板（100 rpm）上在4°C下孵育30分钟
。然后将裂解液超声检查10分钟（10 s开，10秒） ，并通过离心（18,000g
，20分钟，4°C）澄清。 　　用15 mL洗涤缓冲液（20 mM HEPES pH 7.4 ，150 mM NaCl，10 mM咪唑）平衡包含3毫升Ni-NTA琼脂糖的色谱柱 。澄清的裂解液被流过圆柱
。用15毫升洗涤缓冲液
，15毫升高盐洗涤缓冲液（20 mM HEPES pH 7.4 、500 mM NaCl，10 mM咪唑）和15 mL洗涤缓冲液洗涤柱。在含有60毫米咪唑 ，120毫米咪唑
，180 mM咪唑和240 mM咪唑的洗涤缓冲液中收集了4个总3毫升洗脱部分 。除60毫米咪唑部分以外的所有分数均汇总，并使用10,000 kDa分子量截止截止离心过滤器（Amicon Ultra-15） ，并在超级档化200增加10/300 GL凝胶过滤柱（GE Healthcare）上进一步纯化
，以尺寸排除液（GE Healthcare）（20 mm Hepes pH Hepes pH 7.4，4.4 ，4000mm nac）
。大小排除的纯度通过SDS -PAGE确认。将洗脱液集中并重新填充到含10％w/v甘油的测定缓冲液中 。通过280 nm吸光度（Thermo Scientific Nanodrop One）确定浓度。将等分试样冷冻并存储在-80°C下
。 　　十个微图（扩展数据图3E）或20 µg（扩展数据图4n）（使用“放射性结合测定法
”中的程序确定的浓度
，“蛋白质含量估计”，如“粗膜提取物 ”中所述制备的膜的“蛋白质含量估计
”） ，并与PNGase Fngase Fngase Fngase Fngase Fngase Fneater进行了定性。缩放到25 µL
，脱糖基化步骤缩放到35 µL 。在过程结束时，将50 mM DTT和1×LDS样品缓冲液添加到反应混合物中
。然后使用7.5％（扩展数据图3E）或10％（扩展数据图4N）聚丙烯酰胺凝胶分离样品。将凝胶扫描 ，以示荧光（GE Healthcare Typhoon FLA 9500）Azdye488/atto488/snap Surface Block 488（激发473 nm，长通量发射滤波器510 nm
，增益1,000 V）或Azdye546（激发532 nm，长度532 nm ，长pass pass filt filt filt filt filt filt filt filt filt filt filt filt filt filt filt filt filt filt 570 nm
，增益1,000 nm，增益1,000V 1,000V 1,000V 1,000维1,000 v 。 　　将含有ICL3 FRET传感器的染料对照或膜重悬于含有1 mM抗坏血酸的测定缓冲液中 ，相当于激发计数的约1.5％/秒（0.12 MHz的发射脉冲的0.12 MHz
，用于8 MHz激发脉冲的最终浓度约为〜3-4 nm nm green fluorophore）
。加入110 µL的最终反应体积，加入配体（100 µM异丙烯醇） ，G肽（10 µM）和/或NB6B9（0.5 µM）。对于没有药物
，肽或纳米病的条件，添加了同等量的测定缓冲液 。在阅读之前 ，将反应平衡5分钟
。将每个反应的一百五个微透明加载到光学石英比色杯中。使用479 nm脉冲二极管激光器和515 nm的长通量发射过滤器
，通过时间相关的单个光子计数（Deltapro，Horiba Scientific）进行测量 。时间分辨荧光衰减数据适合方程： 　　经验优化了三指数拟合（χ2≈1.25 ，其中两指数拟合χ2≈1.4）（扩展数据图4A – H）
。从三指衰减方程计算出振幅加权的平均寿命（τVG）： 　　根据传感器的产量，以技术重复或一式三份进行每种条件。 　　基于mcerulean荧光（475 nm的1×106 mcerulean计数）
，将含有β2AR痉挛传感器的膜重悬于测定缓冲液中，并简短地进行超声处理 。对于含有QPEP的条件 ，超声处理后
，将最终浓度添加到膜混合物中。将最终浓度为100 µM异丙肾上腺素或等效量的测定缓冲液（每次反应100 µL最终）
。用摇动（500 rpm）在25°C下在25°C下平衡反应5分钟。将110 µL的每个反应加载到光学石英比色杯中 。为每个样品（激发430 nm，发射扫描450 nm – 600 nm ，bandpass 4 nm）
，获取了mcerulean的荧光光谱（Horiba Fluoromax 4）
。从每个获得的光谱中计算出麦克雷尔（发射525 nm）：mcerulean（发射475 nm）比（FRET比）。每种药物 - 肽条件均以quintuperic进行 。对于每个实验，通过减去仅从伊属烯醇治疗条件的平均特征比率的缓冲液条件的平均汇率比率来计算∆FRET度量
。 　　将含有β2AR-MCerulean或β2AR-TAGRFP的膜（1:10稀释的冷冻膜等分试样稀释）重悬于含有10 mg ML-1牛血清白蛋白 ，1 mM抗坏血酸和100 µM异特纳酚和Sononicated的测定缓冲液中。将Bio-SPEP/Bio-QPEP（最终10 µm）添加到反应混合物（最终300 µL）中
，并在冰上平衡30分钟 。去除100 µL的反应混合物；获得了该样品的分析荧光光谱（Mcerulean：Horiba Fluoromax 4，激发430 nm ，发射扫描450 nm – 600 nm
，带通4 nm; tagrfp：Tecan Spark plate读取器，96-well透明底部板 ，底部读取，底部读取
，启发，521 nm的兴奋 ，521 nm的量度
，量度为521 nm，一位560 nm-650 nm-650 nm – 650 nm ，均为560 nm-650 nm
，给定条件的β2AR
。在其余200 µL中，将20 µl的0.4 mg ml-1链霉亲和素涂层的磁珠添加到反应混合物中 ，在环境温度下平衡5分钟
，并使用Neododim Disc Magnet N52（20×40 mm）沉淀。荧光光谱是重复的剩余上清液的荧光光谱 。MCerulean BOND的百分比被计算为从总受体样品的总受体样品的峰值荧光计数中减去的其余上清液样品的平均峰值荧光计数（鼠：发射475 nm，TAGRFP：发射584 nm） ，除以总受体样品的峰值荧光计数
。 　　从每个含有转染的细胞的井中去除一个培养基。剩余的体积用于通过移液轻轻剪切和重悬细胞 。离心细胞混合物（3分钟
，300克），并使用真空歧管除去培养基。The cell pellet was resuspended in 1 ml of either cAMP assay buffer (PBS with 0.5 mM ascorbic acid, 0.2% (w/v) glucose) or InsP1 assay buffer (10 mM HEPES pH 7.4, 1 mM CaCl2, 4.2 mM KCl, 145 mM NaCl, 5.5 mM glu​​cose, 50 mM LiCl).通过重复此过程将细胞洗涤一次
。 　　对于扩展数据图2B ，将细胞稀释至每毫升2×106±5×105细胞。通过TAGRFP荧光（Horiba Fluoromax 4）估计表达水平：激发540 nm，发射扫描565–600 nm
，带通4 nm 。 　　对于所有其他第二个信使分析，通过荧光估算了每种条件的表达水平和细胞密度
。每种条件获取了或麦氯诺克斯430-600 nm ，发射扫描40-600 nm
，4 nm）和麦替兰（Horiba Fluoromax 4，激发490 nm ，发射扫描500-600 nm
，带通道4 nm）的荧光光谱。将细胞以350,000±30,000的荧光计数重悬于波长，代表样品的光密度（激发430 nm/发射450 nm） ，对应于2×106±5×105个细胞 。通过计算血细胞计数仪（伯爵夫人II）上的细胞来证实这一点
。评估了以下指标的最佳表达：mcerulean峰发射（激发430 nm/475 nm）：光密度发射（激发430 nm/发射450 nm）为2.0±0.3和麦替氏菌峰发射（激发490 nm/发射490 nm/发射525 nm）：McErulean 430 NM/extimation 430 NM/exion 430 NM2.0±0.2。 　　将重悬的细胞加入1：1
，并将配体浓度（10 µL最终）浓度为384孔平板板（Greiner Bio-One）中 。对于单聚集体实验，饱和量的激动剂（10 µM PTH1-34（PTH1R） ，10 µm 2-芳烃2-芳基烯丙基甘油（CB1R）
，10 µm Carbachol（M1R），10 µm多巴胺（D1R） ，10 µm多巴胺（D1R），10 µm N6-n6-mAdemine-MAN-MADINGERINGERINGLINGERINGERINGLINGERINGERINGIN-ANINGIPOPHINGIN-ANINGIPOPRINSERINGIN-ANIN-MANIN-MENIN-MENS MANSIMINV使用（V1R））
。对于β-ARS的cAMP积累实验
，使用了10 µM异丙肾上腺素。对于使用β-AR的FSK抑制测定，使用了100 µM美托洛尔 。对于剂量 - 反应曲线 ，包括饱和浓度的福胡素（10 µM）作为对照
，以测量与转染的受体无关的cAMP刺激
。为了比较测量非认知或二级GS信号传导的多个受体（图4E，扩展数据图8i – k） ，使用500 µM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（IBMX）来抑制磷酸二酯酶的活性。对于所有其他实验
，没有使用IBMX最大程度地减少内源性受体的cAMP积累（扩展数据图6a） 。对于图2G和扩展数据中的实验图6b，E ，将板在37°C下孵育10分钟
，以刺激cAMP的产生。对于所有其他实验，将板在室温下孵育10分钟
。我们发现 ，室温孵育将cAMP的积累水平保持在同等水平为37°C的孵育
，并且在实验中降低了井眼的变化。按照制造商的说明，对CAMP-GLO分析（Promega）进行了淬火并处理反应 。在Tecan火花板读取器上测量发光（500毫秒积分 ，每孔测量1个测量）
。将数据归一化为β2AR-WT（图2G和4E以及扩展数据图6和8J），β2AR-WT-NOPEP（扩展数据图7D）
，或最大的Forskolin刺激（图3E，F和5C ，F和5C以及扩展数据图6和9K）。剂量反应曲线适合方程： 　　如果E为响应
，则L是异丙肾上腺素的浓度，EMAX是异丙肾上腺素的饱和浓度时的反应 ，EMIN是在没有异丙肾上腺素的情况下的响应
，EC50是异丙肾上腺素的浓度，它给出了50％的EMAX ，而NH是曲线的山山系数 。 　　如上所述
，建立了实验
。将每种受体的1 µM福克斯蛋白处理与饱和浓度的激动剂进行比较。所有条件均补充了500 µM IBMX，并使用了10分钟的室温刺激条件 。按照制造商的说明 ，对CAMP-GLO分析（Promega）进行了淬火并处理反应
。 　　将重悬的细胞加入1：1
，并将配体浓度（70 µL最终）浓度加入不透明的96孔U底板（Greiner Bio-One）中。对于单一浓度实验，使用了饱和量的配体（10 µM异丙肾上腺素 ，10 µM PTH1-34） 。将板在37°C下孵育2小时，以刺激INSP1的产生
。根据修改协议以实现更高的信号与噪声比
，对INS1 HTRF测定法（CISBIO）进行淬火并处理反应。将15微米的D2偶联IND1重悬于裂解缓冲液（CISBIO）（CISBIO）和15 µL密码隐液偶联的抗INSP1抗体中，将其重悬于裂解缓冲液（CISBIO）中 。在摇动（500 rpm）的环境温度下 ，在环境温度下平衡细胞裂解物。将反应（4×20 µL）转移到384孔板中以进行技术重复
。受体D2（激发340 nm
，发射665 nm，截止630 nm）和供体terbium隐液（激发343 nm ，排放620 nm
，截止570 nm）的荧光读数（flexStation3，分子设备）（激发340 nm ，发射665 nm
，截止630 nm）和供体terbium隐秘。每次读数的FRET比率均计算为受体排放与供体排放的比率 。计算药物和转染组合的Insp1信号是根据给定转染条件的平均fret比，而没有药物治疗从给定转染条件的A平均FRET比例中减去药物治疗
。剂量反应曲线与CAMP剂量 - 反应曲线相同。 　　匹配细胞密度或受体表达水平较差的生物样品（在“一般过程”中指示的所需参数）被标记为潜在的样品重复失败 。与其他生物学重复相比 ，标记为异常值（绝对z得分大于3）
。 　　如先前所述
，对表达的PTH1R-荧光素酶互补构建体进行了囊泡，对较小的样品体积进行了修改。每个井中的培养基都用于通过移液轻轻剪切和重悬细胞 。离心细胞混合物（3分钟 ，300克），并吸出培养基
。将细胞颗粒重悬于1 ml PBS中
，并如上所述再次离心。再次将细胞再次悬浮在0.6 mL囊泡缓冲液中（10 mM HEPES pH 7.4，150 mM NaCl ，20 mM CaCl2
，2 µg ML-1折断蛋白，2 µg ML-1亮肽蛋白 ，2 mm N-乙基甲酰胺）
，并在30°C下在30°C中孵育180°C，可在30°C中孵育 。通过离心去除细胞碎片（1,000克1分钟）
。为了收集其他囊泡 ，将碎屑重悬于0.3 mL PBS中
，短暂涡旋并再次离心（1,000g持续1分钟）。将约0.9 mL的倒倒物上清液离心一段时间（1,000克2分钟），以更好地去除细胞碎片 。通过离心（在4°C下3,200克40分钟）收集囊泡 ，并在0.5 mL测定缓冲液中洗涤。重复离心步骤
，并将囊泡重悬于0.1 mL测定缓冲液中
。 　　将囊泡样品收集在96孔的透明底板上，并分析用于TAGRFP荧光（Tecan Spark ，激发521 nm，发射585 nm
，增益150）。对于给定ICL3插入（SPEP，QPEP和控制）的每组构造 ，样品被稀释至最低的TAGRFP计数 。 　　在给定时间分析了四个ICL3插入构建体（总共12个）
。每个样品中的45 µL被转移到不透明的96孔平底板上。在新板中的每个孔中添加了1:50稀释的45 µL纳米-GLO底物（Promega N1110） 。敲击板以收集孔底部的液体后
，启动了动力发光读数（500毫秒积分，连续40分钟） ，并跟踪发光信号
。当发光信号平衡时（平台在300-350 s之间）时
，暂停了动力学读取，并将10 µm的PTH1-34添加到每个孔中。将板挖掘2-3次以混合 ，并恢复动力学读取 。计算每个动力学迹线的移动平均值（3分平均值
，5分钟平衡，8点移动后的药水治疗平均值）
。将每个动力学迹线归一化为预毒均衡的最后一点。随着时间的流逝 ，看起来稳定的最大发光值用于进一步分析 。通过从spep值中减去控制值以及给定实验的qPEP值来计算特定的pep和qPEP信号
。 　　为了最大程度地采样β2AR的第三个细胞内环表现出的构象异质性
，我们使用激动剂异丙肾上腺素使用多个全原子分子动力学模拟，如下所述。 　　β2AR具有截短的N末端（∆1-34）和截短的C末端（Δ341-413）的β2AR用于所有模拟 。我们构建了ICL3序列（228-RQLQKIDKSEGRFHVQNLSQVEQDGEQDGRTGHGLRSSK-263）作为一个非结构化的回路 ，成为源自β1AR和β2AR的已知结构的不同模型的不同模型，并具有以下构造（补充表2
，补充表2，补充图。4）：4）：4）：4）：：4）：：4）： 　　为了研究多种脂质对GPCR构象集合的影响 ，我们使用了混合脂质双层来模仿细胞膜（补充图3）
。膜双层的外小叶由POPC
，DOPC，POPE ，DOPE
，SPHOMYELIN（SPH）组成，其比例为20：20：20：20：20：20：5：5：5：15：10：25胆固醇的比例为5：5：20：20：8：7：10：222。为了进一步模仿细胞膜条件 ，我们用150 mm的CaCl2中和复合脂质双层 。为了获得粗粒模拟中脂质的随机分布
，在上面给出的相同组合物中建造了三次脂质双层
。在三个模拟框中的每个模拟框中平衡之后，我们用Martini2.2 ForceField49进行了10μ粗粒分子动力学（CGMD）模拟。使用Martini网站50的脚本向后脚本将粗粒脂质双层模型转换为全原子模型 。我们提取了五种不同的细胞膜脂质构型 ，在我们以前的工作中详细描述了22
。然后
，我们将β2AR的四个初始状态模型插入这些脂质构型中。消除受体和脂质之间的空间冲突后，我们发现每种模型A至C的GPCR-脂质双层复合物具有一个GPCR-脂质双层复合物 ，而对于模型D 。 　　每个GPCR-脂质双层复合物用水溶解，并用150 mm的CaCl2中和
。二硫键是根据6E67结构模板PDB文件中列出的二硫键构建的。如前所述51,52,53,54
，进行了最小化 - 加热 - 平衡 - 生产 。使用50 NS NPT平衡模拟协议（恒定数量的颗粒，压力和温度） ，将每个GPCR -LIPIPID双层复合物最小化并平衡
。从位于配体中的重原子（C
，N，O ，S和P）上放置在受体沉重原子（C
，N，O ，S和P）上的位置约束开始
，并在脂质的头部组中进行平衡。每10 ns模拟窗口1 kcal mol -1间隔1 kcal mol -1间隔将位置约束上的力常数从5 kcal mol -1降低 。对平衡模拟的最后10 ns进行了没有约束的情况。从平衡协议的最后一帧开始，我们执行了400 ns全原子分子动力学模拟 ，在310 K处使用NPT集合
，使用带有charmm36mff55的gromacs，使用2 fs时间步长
。在分子动力学模拟过程中 ，我们以20 ps的间隔存储了分子动力学快照。每个模拟中的非键相互作用以12Å的截止计算 。应用粒子网埃瓦尔德方法计算范德华相互作用56
。使用鼻子恒温器恒温器57保持在310 K的温度，并使用Parrinello-Rahman Method58在1个大气处保持压力。 　　在从D模型开始的一个模拟中
，我们观察到阻塞G蛋白位点的螺旋的帽子（补充图4）将G蛋白结合口袋留下了，并转变为ICL3的完全开放状态 。但是 ，当我们生成合并模拟的自由能表面（请参阅“自由能景观 ”）时
，这两个状态之间没有联系
。为了丰富这个罕见事件的采样，我们产生了一群模拟轨迹。我们从原始模拟中提取了三个快照 ，其过渡事件在50 ns
，100 ns和150 ns（补充表2） 。然后，我们从每个快照中进行了2μs的生产运行
。因此 ，我们总共生成了22μs的分子动力学模拟
，以分析ICL3的异源构象合奏。 　　为了在模拟中描述ICL3的全局运动，我们使用Markov State Model在软件MSMBuilder2（版本3.8.0）中使用Markov State模型将模拟轨迹映射到自由能景观上 。选择整个GPCR的骨架二面角（PHI和PSI）作为订单参数 ，以描述ICL3的运动
。使用时间相关的独立组件分析（TICA）
，将PHI和PSI角矩阵投射到二维空间中，滞后时间为2 ns ，而基于人口密度的逆构建的自由能景观。在自由能表面上观察到了四个主要的自由能盆地，这些能量表面主要通过ICL3的构象来区分 。在所有采样点上都应用了Minibatchkmean聚类方法
，以将它们区分为不同的簇60。产生了5个总簇：每个自由能盆地一个，两个中间自由能盆地之一的子簇（图2a ，b）
。 　　为了量化ICL3与受体的其他细胞内区域之间的假定结构约束
，我们计算了ICL3（S236-G257）质量中心与ICL2（T136-T146）或ICL1或ICL1或ICL1或ICL1（F61-T66）的质量中心之间的距离。对从自由能景观提取的五个构象簇中的每个中的每个进行了距离计算 。基于在群集1中观察到的紧密距离分布，我们进行了其他距离计算 ，比较了五个单独的ICL3序列段（241-HVQ/NLS/QVE/QVE/QVE/QDG/RT-254）的质量中心和ICL2或ICL1质量中心的集群1
。 　　由于ICL3的序列长度高度可变
，因此我们选择使用n和c- c-和c-和c-的编号方案来跟踪诱变位点的位置，其中ICL3序列的n末端半末端为N1-NN ，C-C-terminal Halm是CN-C1
，其中n为n是受体的长度的ICL3序列的一half。我们将TM5.56用作N末端序列编号的起点来划定TM5的细胞质暴露 。对于C末端序列编号，适用于TM6.37的相同逻辑（扩展数据图1和补充表1-4）
。 　　我们包括所有可以使用野生型参考点找到的突变数据（PKD ，PEC50和EMAX）。对于PKD图
，我们仅包括激动剂结合数据 。为了绘制突变与功能效应的位置的影响，我们将每个ICL3长度归一化为数据集中最短的ICL3（22个氨基酸）
。每个位置突变分配了突变的效果。 　　G蛋白界面保护（图5A和扩展数据图9A – J）被计算为所有组成GPCR G蛋白结合界面的所有氨基酸的序列相似性 。组成该界面的残基是根据先前的结构比对和接口绘制的33,34
。序列相似性是从四个独立的GPCR界面比对计算的 ，其中根据IUPHAR/BPS药理学数据库指南34,61中的主要G蛋白信号转导途径分离受体34,61。 　　将界面组成与ICL3序列长度进行比较 。根据晶体结构（PDB ID：3SN6）确定，每个GPCR的ICL3的起始位置和终结位置是根据B2AR ICL3区域的第一和最后一个细胞质暴露残基的通用残基数确定的。 　　我们对另外两个数据集进行了分析
，该数据集使用并行的高通量筛选技术评估GPCR G蛋白亚型特异性37,38
。这些数据集允许定量比较不同的G蛋白与给定受体的偶联。为了评估这些数据集的短-ICL3和长ICL3基的G蛋白选择性的高差异差异，我们比较了每个受体的最高日志（EMAX/EC50）值（被认为是同源）的最高log（EMAX/EC50）值（被认为是同源） 。对于此分析 ，我们不包括仅具有对单个受体的对数（EMAX/EC50）的受体（扩展数据图9G
，J）
。 　　在RSTUDIO（版本2022.12.0）中进行了统计分析。对于比较两个条件的实验，使用了未配对的两侧t检验 。对于比较两个以上条件的实验 ，使用了方差分析
。单向方差分析用于单级比较（例如
，突变的效果），并将双向方差分析用于两级比较（例如 ，突变的效果和G肽的作用）。为了比较条件
，使用了Tukey的事后测试 。对于双向方差分析的比较，相互作用效应不显着（p> 0.05） ，我们没有在水平之间进行单个事后比较（例如
，我们仍然将突变A与突变B，肽A与肽B进行比较 ，而不是与肽B相比）
。对于任何实验，统计量均不用于预先确定样本量。将生物样品（膜
，细胞，囊泡）的条件铺板和/或在所有数据集的实验重复之间以随机顺序进行测定 。在数据收集或分析过程中 ，研究人员并未对群体分配视而不见
，因为所提供的所有数据都是定量的，并且没有评估主观指标
。 　　荧光寿命数据拟合在DAS6（HORIBA）中。使用求解器加载程序在Excel中进行曲线拟合 。使用GGPLOT2软件包62在Rstudio（版本2022.12.0）中生成数字。图像处理是在fiji63,64中进行的
。使用VMD（1.9.3）65和Pymol（版本2.0.6）66创建分子结构表示。 　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得 。