IBD GWAS摘要Statistics 3用于使用SUSIER51进行多个因果变异映射
，其中参考次要等位基因和LD信息是从1000个基因组第3阶段的503个欧洲样品中计算出来的（参考文献52）。所有R分析均使用V.4.2.1 。PALINDROMIC SNP（A/T或C/G）和任何不符合位置或等位基因的SNP在使用R中重新成熟的SSIMP方程进行归类之前对其进行修剪
。这不会影响CHR21Q22处的任何候选SNP。Susie细映射结果是从EQTL Catalogue53中的单核细胞/巨噬细胞数据集中获得ETS2（标识符ESSG00000157557或ILMN_1720158）的ETS2（标识符ENSG00000157557或ILMN_1720158） 。进行共定位分析，将CHR21Q22 IBD关联与其他CHR21Q222相关疾病的摘要统计数据进行比较3,4,5,6和单核细胞/巨噬细胞EQTLS54,55,55,56,57,58 ，以确定是否存在这些不同关联的共享遗传基础
。使用COLOC（v.5.2.0）59使用H4（pp.h4.abf）> 0.5进行呼叫共定位的概率进行。 　　从基因表达综合（GEO系列GSE18927和GSE96014）下载了来自原代人免疫细胞的RAW H3K27AC芯片seq数据
，并按照先前所述进行处理60（“代码可用性”部分提供的代码） 。 　　从OSF（https://osf.io/u8tzp）下载了从17种主要免疫细胞类型中进行的加工启动子捕获者HI-C DATA61，并提取了CHR21Q22-Interacting区域的芝加哥分数
。 　　来自健康供体的白细胞锥从NHS血液和移植（剑桥血液供体中心 ，康林代尔血液中心或锻炼血液供体中心）获得。通过密度离心（Histopaque 1077
，Sigma-Aldrich）分离外周血单核细胞（PBMC），并使用CD14 Microbeads（Miltenyi Biotec）积极选择单核细胞 。巨噬细胞分化是使用模拟慢性炎症（TPP）16：3天GM-CSF（50 ng ml-1 ，peprotech）的条件进行的
，然后是3天GM-CSF，TNF ，TNF（50 ng ml-1
，peprotech），pge2Invivogen）;或者 ，要产生静止（M0）巨噬细胞：6天M-CSF（50 ng ml-1，peprotech）
。所有培养物均在无抗生素的RPMI1640培养基中在5％CO2下在37°C下进行
，其中含有10％FBS，谷氨酸和MEM非必需氨基酸（所有Thermo Fisher Scientific）。使用Accutase（Biolegend）分离细胞 。 　　从GEO（GSE47189）下载了与28个不同刺激有关的28种不同刺激（共同构成67种不同激活条件）的人类单核细胞/巨噬细胞基因表达数据文件（n = 314） ，并归一化。将来自生物重复的数据汇总到每个基因的中位数
。基因集变异分析62（使用R中的GSVA包）使用与疾病相关的差异表达基因的列表中的活性IBD最相似的激活条件63。 　　使用Crispick设计GRNA序列
，并由IDT合成（补充表3） 。Alt-R CRISPR-CAS9阴性对照CRRNA 1（IDT）用作非靶向对照
。如先前所述60，将Cas9 – GrNA核糖核蛋白组装在一起 ，并使用核对象2B（LONZA
，lonza，program y-001） ，将100μL核反触角缓冲液（人单核细胞核纤维纤维孔
，LONZA）中核成核。核反理后，单核细胞在六孔板中立即转移到5 mL预热的培养基中 ，并在TPP条件下分化为巨噬细胞 。通过提取的DNA中靶区域的PCR扩增来量化编辑效率
。所有引物序列均在补充表3中提供。如前所述
，通过定量放大片段（2100 Bioanalyzer，Agilent）来测量CHR21Q22基因座的编辑效率 。使用CRISPR编辑工具64（ICE ，Synthego）的推断评估了单个GRNA的编辑效率
。 　　在TPP分化的第0、3 、4
、4、5和6天，通过CHR21Q22编辑和未编辑的（NTC）细胞中的PrimeFlow（Thermo Fisher Scientific）对RNA的丰度进行了定量。根据制造商的说明
，使用了针对ETS2（Alexa Fluor 647），BRWD1（Alexa Fluor 568）和PSMG1（Alexa Fluor 568）的目标探针 。使用FACS Diva软件收集数据 ，并使用FlowJo V10（BD Biosciences）进行分析
。 　　设计了含有114个基因组序列核苷酸的重叠寡核苷酸
，以50 bp的间隔以含有CHR21Q22候选SNP的区域（99％可靠集）。为每个基因组序列设计了六个技术重复，每个序列都用独特的11-核苷酸条形码标记 。包括其他寡核苷酸 ，以测试99％可靠集中每个候选SNP的表达调节作用。等位基因构建体的设计如前所述60
，并由30个独特的11-核苷酸条形码标记
。如先前所述，包括阳性对照和阴性对照。60 。170-nucleotide oligonucleotides were synthesized as part of a larger MPRA pool (Twist Biosciences) containing the 16-nucleotide universal primer site ACTGGCCGCTTCACTG, 114-nucleotide variable genomic sequence, KpnI and XbaI restriction sites (TGGACCTCTAGA), an 11-nucleotide barcode and the 17-nucleotide universal primer siteagatcggaagagcgtcg
。如前所述60进行克隆到MPRA载体中。通过测试TPP巨噬细胞中的启动子活性来确定适合MPRA载体（RSV）的启动子 。MPRA载体文库使用核对象2B（程序Y-011）将100μl核反触角缓冲液（人类巨噬细胞核核试剂盒 ，LONZA）中的100μl核反登核缓冲液（人类巨噬细胞核能试剂盒
，Lonza）中核成核
。为了确保足够的条形码表示，每个供体的核定核构成至少2×107个细胞（n = 8）。24小时后 ，提取RNA
，并如前所述由mRNA或DNA输入矢量制成测序文库 。60
。在Illumina HISEQ2500高输出流量细胞（50 bp，单端读取）上对库进行了测序。数据被解复并使用BCL2FASTQ转换为FASTQ文件 ，并如前所述使用FASTQC60进行了预处理 。为了识别增强剂活性的区域，首先进行了配对的t检验
，以识别增强转录和滑动窗口分析的基因组序列（300 bp窗口） 然后使用R中的LES封装进行
。如先前所述，使用Quasar-MpRA65鉴定了表达调节变体。 　　从GEO下载了来自人类巨噬细胞的芯片– seq数据集 ，并检查了BAM文件（IGV基因组浏览器）以识别杂合样品（即包含A和G等位基因在CHR21：40466570; HG19上读取A和G等位基因读取的文件） 。鉴定了两个合适的样品（GSM1681423和GSM1681429）
，并用于对PU.1结合中等位基因失衡的贝叶斯分析（在r r的Baalchip软件包66中实现，在R中实现 ，校正了过度解异和偏见引入的偏见和偏见。 　　从五个健康的RS2836882杂合子中采集了100 mL血液样本（通过Taqman Genotyping评估； Thermo Fisher Scientific评估）
。所有参与者均提供了书面知情同意。伦敦 - 姆大地区地区伦理委员会（21/LO/0682）提供了道德批准 。使用CD14微粒（Miltenyi Biotec）从PBMC中分离单核细胞
，并使用TPP条件分化为炎症性巨噬细胞16
。分化后，将巨噬细胞分离并在包含1％甲醛的新培养基中交联10分钟。用甘氨酸（最终浓度0.125 m ，5分钟）淬灭交联 。如先前所述的60循环超声处理（30 s ON/30 s左右
，生物爆pico，diaco ，diaco）进行核制剂和剪切
。使用多克隆抗PU.1抗体（1:25;细胞信号传导）使用SimpleChip Plus套件（细胞信号传导）在4°C下在4°C下进行免疫沉淀。taqman Genotyping（测定C 2601507_20）以重复量化了PU.1结合DNA中RS2836882等位基因的比率 。使用包含风险或非风险等位基因（200-核苷酸基因组序列中心的200个核苷酸基因组序列； genewiz）的基因嵌段的固定比率生成标准曲线
。 　　将MPRA矢量文库转染为来自六个健康供体的TPP巨噬细胞。如先前所述的60
，对PU.1与SNP等位基因的结合进行评估，并以最小的超声处理（去除无染色质剪切质的污染物） 。如上所述进行免疫沉淀
。为MPRA准备了测序库 ，并在Miseq系统（50 bp，单端读数）上进行了测序。 　　使用OMNI-ATAC协议67进行了以下修饰：ETS2编辑和未编辑的TPP巨噬细胞中的ATAC – SEQ进行：将细胞数增加到75,000个细胞；细胞裂解时间增加到5分钟；转座混合物中TN5转座酶的体积加倍 。换位步骤的持续时间延长至40分钟。使用Ampure XP珠（Beckman Coulter）清洁放大的库
，并在NovaseQ6000系统（100 bp配对末端读取）上进行测序
。如前所述处理数据68。如前所述，使用EDGER和TMM归一化69进行了差异ATAC -SEQ分析 。在健康对照组和患有强硬性脊柱炎的患者的16个杂合单核细胞数据集中 ，在2个深序的杂合杂合TPP巨噬细胞样品中
，在16个杂合单核细胞数据集中进行了等位基因特异性ATAC-SEQ分析
。对于这些分析，使用splitsnp（https://github.com/astatham/splitsnp）从预处理数据中提取了RS2836882的测序读数（请参阅“代码可用性 ”部分）。 　　使用抗H3K27AC抗体（1：250 ，ABCAM）或同种型对照（1：500
，兔IgG，abcam） ，如先前所述进行H3K27AC芯片seq 。在Hiseq4000系统（50 bp
，单端读数）上测序了来自主要和小等位基因纯合子（通过NIHR Bioresource，n = 4）的TPP巨噬细胞的测序文库
。在NovaseQ6000系统（100 bp ，配对 - 末端读数）上测序了来自ETS2编辑和未编辑的TPP巨噬细胞（n = 3）或过表达ETS2或对照mRNA过表达ETS2或对照mRNA过表达的M0巨噬细胞（n = 3）的测序文库。如前所述
，使用Burrows-wheeler Aligner60对原始数据进行处理，控制质量和分析 。使用MEDIPS71将未配对的微分芯片分析分析 ，以比较RS2836882（CHR21：40150000-40710000，HG19
，HG19），使用MEDIPS71进行比较
。使用具有TMM归一化的EDGER（具有供体作为协变量） ，对扰动ETS2表达对增强子活性的影响进行了配对的差异芯片分析。全基因组分析使用了共有的MACS2峰 。使用超级增强剂（Rose）的等级顺序评估超级角色活动
。基于CHR21Q22的分析使用了表现出等位基因特异性活性的增强子坐标（CHR21：40465000–40470000
，HG19）。为所有数据分析提供了代码（请参阅“代码可用性
”部分） 。 　　Expression of myeloid markers was assessed using flow cytometry (BD LSRFortessa X-20) with the following panel: CD11b PE/Dazzle 594 (BioL​​egend), CD14 evolve605 (Thermo Fisher Scientific), CD16 PerCP (BioL​​egend), CD68 FITC (BioL​​egend), Live/Dead Fixable Aqua Dead Cell Stain (Thermo Fisher Scientific) and Fc受体阻断试剂（Miltenyi）。所有抗体均以1:40的稀释使用；活/死染色在1：400稀释时使用
。使用FACS Diva收集数据，并使用FlowJo V.10（BD Biosciences）进行分析。 　　在TPP巨噬细胞培养和冷冻的第6天收集上清液 。使用测定法（Meso量表诊断 ，Discovery Workbench v.4.0）
，通过电化学发光以一式两份对细胞因子浓度进行了量化
。 　　根据制造商的说明，使用荧光标记的Zymosan颗粒（Green Zymosan ，Abcam）评估吞噬作用。在96孔圆底板中
，将细胞以每孔105个细胞的形式播种 。细胞切拉斯蛋白D（10μgml -1，Thermo Fisher Scientific）用作阴性对照
。通过流式细胞仪定量吞噬作用 ，并计算吞噬作用指数（阳性细胞的比例乘以其平均荧光强度）。 　　根据制造商的方案
，使用第基因元素增强的超氧化物检测试剂盒（国家诊断）对细胞外ROS产生进行了定量 。将细胞以每个孔的105个细胞密度接种，并用PMA进行预刺激（200 ng ml-1 ，sigma-aldrich）
。 　　如先前所述进行蛋白质印迹73使用以下主要抗体进行：小鼠抗GP91Phox（1：2,000），小鼠抗P222phox（1：500; ast santa Cruz）
，兔子抗C17orf62/eros（1：1,000; Atlas），小鼠抗vincinculin（小鼠抗vincinculin（Sigma-Aldrich）。加载控件在同一凝胶上运行 。次级抗体如下：山羊抗兔IgG-horseradish或山羊抗小鼠IgG-Horseradish过氧化物酶（均为1：10,000；杰克逊免疫）
。在将膜与ECL（Thermo Fisher Scientific）或SuperSignal West Pico Plus（Thermo Fisher Scientific）试剂中孵育后 ，在Chemidoc Touch Imager（Bio-Rad）上记录了化学发光。使用ImageJ进行光密度分析 。 　　根据制造商的说明
，使用Smalted strand的总RNA-SEQ KIT V2 PICO IMAMMALIAN（TAKARA），根据制造商的说明 ，从巨噬细胞裂解物（AllPrep DNA/RNA微试剂盒
，Qiagen）中分离出RNA，并从10 ng RNA制备了测序文库。在NextSeq 2000（50 bp配对末端读取：CRISPR ，ROXADUSTAT和PD-0325901实验）或NovaseQ 6000（100 bp配对末端读数：过表达实验）系统和使用MultieQC进行预处理的NovaseQ 6000（100 bp配对实验）上
，对库进行了测序
。使用装饰盛放（PHRED分数24）修剪读数并过滤以删除读数 <20 bp. Ribosomal reads (mapping to human ribosomal DNA complete repeating unit; GenBank: U13369 .1) were removed using BBSplit (https://sourceforge.net/projects/bbmap/). Reads were aligned to the human genome (hg38) using HISAT2 (ref. 74) and converted to BAM files, sorted and indexed using SAMtools75. Gene read counts were obtained using the featureCounts program76 from Rsubread using the GTF annotation file for GRCh38 (v.102). Differential expression analysis was performed in R using limma77 with voom transformation and including donor as a covariate. Differential expression results are shown in Supplementary Tables 1 and 2. 　　GSEA was performed using fGSEA78 in R with differentially expressed gene lists ranked by t-statistic. Gene sets were obtained from GO Biological Pathways (MSigDB), experimentally derived based on differential expression analysis or sourced from published literature31,42,70,79,80,81,82,83,84,85,86. Specific details of disease macrophage signatures (Fig. 3f) are provided as source data. GO pathways shown in Figs. 2–5 are as follows: GO:0002274, GO:0042116, GO:0097529, GO:0006909, GO:0071706, GO:0032732, GO:0032755, GO:0032757, GO:2000379, GO:0009060, GO:0006119 and GO:0045649. Statistical significance was calculated using the adaptive multilevel split Monte Carlo method. 　　IBD patients who were rs2836882 major or minor allele homozygotes (n = 11 of each) were identified through the NIHR IBD BioResource. Patients were matched for age, sex, treatment and disease activity, and all provided written informed consent. Ethical approval was provided by the London–Brent Regional Ethics Committee (21/LO/0682). A 50 ml blood sample was taken from all patients and M0 monocyte-derived macrophages were generated as described. After 6 days, cells were collected, lysed and RNA was extracted. Quantitative PCR analysis of a panel of ETS2-regulated genes was performed in triplicate after reverse transcription (SuperScript IV VILO, Thermo Fisher Scientific) using the Quantifast SYBR Green PCR kit (Qiagen) on the Roche LightCycler 480. Primer sequences are provided in Supplementary Table 3 and PPIA and RPLP0 were used as housekeeping genes. Expression values for each gene () were scaled to a minimum 0 and maximum 1 to enable intergene comparison. 　　The cDNA sequence for ETS2 (NCBI Reference Sequence Database NM005239.5) preceded by a Kozak sequence was synthesized and cloned into a TOPO vector. This was linearized and a PCR amplicon generated, adding a T7 promoter and an AG initiation sequence (Phusion, NEB). A reverse complement (control) amplicon was also generated. These amplicons were used as templates for in vitro transcription using the HiScribe T7 mRNA Kit with CleanCap Reagent AG kit (NEB) according to the manufacturer’s instructions, but with substitution of N1-methyl-pseudouridine for uridine and methylcytidine for cytidine (both Stratech) to minimize non-specific cellular activation by the transfected mRNA. mRNA was purified using the MEGAclear Kit (Thermo Fisher Scientific) and polyadenylated using an Escherichia coli poly(A) polymerase (NEB) before further clean-up (MEGAclear), quantification and analysis of the product size (NorthernMax-Gly gel, Thermo Fisher Scientific). For optimizing overexpression conditions, GFP mRNA was produced using the same method. All primer sequences are provided in Supplementary Table 3. 　　Lipofectamine MessengerMAX (Thermo Fisher Scientific) was diluted in Opti-MEM (1:75 v/v), vortexed and incubated at room temperature for 10 min. IVT mRNA was then diluted in a fixed volume of Opti-MEM (112.5 µl per transfection), mixed with an equal volume of diluted Lipofectamine MessengerMAX and incubated for a further 5 min at room temperature. The transfection mix was then added dropwise to 2.5 × 106 M0 macrophages (precultured for 6 days in a six-well plate in antibiotic-free RPMI1640 macrophage medium containing M-CSF (50 ng ml−1, Peprotech), with medium change on day 3). For GFP overexpression, cells were detached using Accutase 18 h after transfection and GFP expression was measured using flow cytometry. For ETS2/control overexpression, either 250 ng or 500 ng mRNA was transfected and low-dose LPS (0.5 ng ml−1) was added 18 h after transfection, and cells were detached using Accutase 6 h later. Representative ETS2 expression in untransfected macrophages was obtained from previous data (GSE193336). Differential H3K27ac ChIP–seq analysis in ETS2-overexpressing macrophages was performed using 500 ng RNA transfection (see the ‘Code availability’ section). 　　Plink1.9 (https://www.cog-genomics.org/plink/1.9/) was used to calculate a polygenic risk score (PRS) for patients in the IBD BioResource using 22 ETS2-regulated IBD-associated SNPs (β coefficients from a previous study3). Linear regression was used to compare PRSs with age at diagnosis, and logistic regression to estimate the effect of PRSs on IBD subphenotypes, including anti-TNF primary non-response (PNR), CD behaviour (B1 versus B2/B3), perianal disease and surgery. For variables with more than two levels (for example, CD location or UC location), ANOVA was used to investigate the relationship with PRS. For analyses of age at diagnosis, anti-TNF response and surgery, IBD diagnosis was included as a covariate. 　　Pathway analysis of 241 IBD-associated GWAS hits3 was performed using SNPsea v.1.0.4 (ref. 34). In brief, linkage intervals were defined for every lead SNP based on the furthest correlated SNPs (r2 >1000个基因组中的0.5，欧洲人口） ，并扩展到最近的重组热点
，重组速率> 3 cm / mb。如果该区域中不存在基因，则将连锁间隔向下游扩展到500 kb（因为长期调节相互作用通常发生在1 MB之内） 。测试了连锁间隔内的基因在7,660条途径内的富集测试 ，其中包括7,658个GO生物途径和两个由ETS2调节的基因列表（要么基于与差异分析的COSSESS CONSERITION和MRERNA，在ETS2过度表达后在ETS2过度表达后显着上调了ETS2破坏后显着下调的基因
。使用单个分数模式进行分析：假设每个链接间隔只有一个基因与途径相关联。通过对链接基因数量匹配的相同大小的随机SNP集（5,000,000迭代）进行采样大小的随机SNP集（5,000,000迭代）
，进行了每个途径的无效分布 。通过将IBD相关基因列表的得分与无数分数进行比较，计算置换p值
。与平均值和S.E.M.相比 ，使用与IBD相关的分数的标准化效应大小计算了富集统计量。无效分数 。提取了与以下IBD相关途径有关的基因集进行比较：NOD2信号（GO：0032495）
，整合素信号传导（GO：0033627，GO：0033622） ，TNF信号（GO：0033209
，GO：0034612），GO：0034612） ，EPISHIUM（GO：0033209）GO:0030277), Th17 cells (GO:0072539, GO:0072538, GO:2000318), T cell activation (GO:0046631, GO:0002827), IL-10 signalling (GO:0032613, GO:0032733) and autophagy (GO:0061919,GO：0010506
，GO：0010508，GO：1905037 ，GO：0010507）
。与PSC5,87
，强直性脊柱炎4,87，Takayasu动脉炎6,88,89和精神分裂症相关的SNP（作为阴性对照） 从指定的研究中整理出来 ，并在ETS2调节的基因列表中测试了富集。 　　使用RCORR函数在R中的HMISC套件中鉴定出与67种人类单核细胞/巨噬细胞激活条件（GSE47189的归一化数据）共表达的基因 。 　　每个捐赠者一式三份生成ETS2编辑或未编辑的TPP巨噬细胞，在第6天
，除去培养基，用PBS洗涤细胞 ，并加入带有标记的葡萄糖的新培养基
。标记的培养基如下：RPMI1640培养基
，无葡萄糖（Thermo Fisher Scientific），10％FBS（Thermo Fisher Scientific） ，Glutamax（Thermo Fisher Scientific）
，13C标记的葡萄糖（Cambridge Isotype型实验室）。24小时后，从时间顺序选择的时间点来建立稳态条件 ，上清液是快速的
，巨噬细胞通过刮擦分离 。将巨噬细胞用冰冷的PBS洗涤3次，计数 ，重悬于600 µL冰冷的氯仿中：甲醇（2：1
，V/V），并在水浴缸中进行超声（3次8分钟）。如前所述91 ，在4°C下进行所有提取步骤
。在Agilent 7890B-7000C GC-MS系统上分析样品。在电子离子化模式下，使用了静态注射（注射温度为270°C）
，使用氦气作为载气 。初始烤箱温度为70°C（2分钟），然后以每分钟12.5°C的温度梯度为295°C ，在每分钟25°C时为320°C（持续3分钟）
。扫描范围为M/Z 50–550。基于软件包gavin92使用内部软件躁狂（v.3.0）进行数据分析 。通过从观察到的量中减去稳定同位素的自然丰度来计算标签掺入
。总代谢物丰度归一化为内标准（Scyllo-Inositol91）。 　　如前所述
，生成了ETS2编辑或未编辑的TPP巨噬细胞 。在培养的第5天，将细胞分离（ACCUTASE） ，并在含有roxadustat的TPP培养基中的96孔圆底板中以每孔105个细胞的密度进行了经验
，并以Roxadustat（FG-4592，30μm）的形式进行了经过重复
。12小时后 ，按照所述收集细胞进行功能测定和RNA-seq。 　　根据制造商的说明
，使用切割和运行试剂盒（单元格信号）收集预培养的TPP巨噬细胞，并立即处理 ，但省略了使用Cona涂层珠的使用 。简而言之
，将每个反应的5×105细胞固定，洗涤并重悬于抗体结合缓冲液中
。将细胞与抗体孵育：抗ISS2（1：100 ，Thermo Fisher Scientific）或IgG对照（1:20，细胞信号传导）在4°C下持续2小时。在Digitonin缓冲液中洗涤后
，将细胞与PA/G-MNase在4°C下孵育1小时 。将细胞用digitonin缓冲液洗涤两次，重悬于相同的缓冲液中 ，并在冰上冷却5分钟。在停止反应并在37°C下孵育10分钟以释放裂解裂解的染色质片段之前
，加入氯化钙以激活PA/G-MNase消化（30分钟，4°C） ，然后在37°C下孵育细胞
。使用自旋柱（细胞信号传导）从上清液中提取DNA。根据协议可用的协议（https://doi.org/10.17504/protocols.io.bagaibse）
，使用NEBNEXT ULTRA II DNA库准备套件进行库准备 。使用Ampure XP珠（Beckman Coulter）进行尺寸选择，并使用Agilent 2100 Bioanalyzer（高灵敏度DNA试剂盒）评估片段尺寸
。在Novaseq 6000系统（100 bp配对末端读取）上对索引库进行了测序。使用Henikoff实验室的指南对原始数据进行分析 。93
。简而言之 ，使用Trim Galore修剪成对末端读数
，并使用Bowtie2对齐与人基因组（GRCH37/HG19）。对BAM文件进行了分类，合并（技术和指示的生物学重复） ，使用Samtools求解和索引 。PICARD用于标记未封闭式的读取和Samtools
，以删除这些读取，重新分配和重新索引
。使用DeepTools BamCoverage功能创建了Bigwig文件。最初使用NF核切割和运行管道V.3.0 ，处理后的数据进行分析 使用CPM归一化和默认的MACS2参数进行峰值调用 。该分析产生了可接受的质量指标（包括平均FRIP评分为0.23），但是倍数较低的峰数量很高（<4) over the control. More stringent parameters were therefore applied for peak calling (--qvalue 0.05 -f BAMPE --keep-dup all -B --nomodel) and we applied an irreproducible discovery rate (IDR; cut-off 0.001) to identify consistent peaks between replicates, implemented in the idr package in R (see the ‘Code availability’ section). Enrichment of binding motifs for ETS2 and other transcription factors expressed in TPP macrophages (cpm >0.5）使用全局基因组控制使用TFMotifView94计算共识IDR峰内
。共有IDR峰与核心启动子（从转录起始位点进行的-250bp至+35 bp）和/或eTS2调节基因的假定顺式调节元素之间的重叠
，使用ETS2中断后（GRNA1）或ETS2过表达（基于Consensus consensus consensus consensus consensus sose）的基因列表进行了差异表达的基因列表来评估ETS2调节基因的假定基因调节元素。推定的顺式调节元素定义为单核细胞和M0和M1巨噬细胞样品中的共享相互作用（芝加哥评分> 5），来自公开可用的启动子捕获者HI-C Data61 。使用CISBP95（数据库2.0 ，PWMS Log log grds Motif Motif模型
，默认设置），在RS2836882基因座（CHR21：40466150–40467450）上确定了预测的ETS2-和PU.1结合位点。 　　从单细胞门户（https://singlecell.broadinstitute.org/single_cell）下载了来自结肠免疫细胞41（包括健康对照和克罗恩病）的原始计数数据
。使用提供的细胞注释提取髓样细胞数据进行进一步分析。使用Seurat（V.4）96对原始数据进行预处理 ，归一化和方差稳定 。进行PCA和UMAP聚类
，并使用已建立的标记和/或以前的文献进行注释
。使用Findallmarkers函数鉴定标记基因。使用addModulesCore函数测量了ETS2调节基因的模块化表达（在ETS2编辑后下调） 。 　　从两个PSC肝外植体和两个对照（与肿瘤转移相邻的健康肝脏）中切割福尔马林固定的石蜡包裹的切片（厚度为5μm），在60°C下烘烤过夜 ，并根据制造商的指示为COSMX烘烤过夜
，并使用15分钟的目标检索和30分钟的蛋白酶消化
。根据研究伦理批准，通过组织进入患者（TAP-B ，UCL-RFH生物库的一部分）获得组织样本：16/WA/0289（威尔士研究伦理委员会4）。每张幻灯片上包括一个情况和一个控件 。使用了人类通用细胞表征核心面板（960个基因）
，并补充了8个其他基因，以改善感兴趣细胞的鉴定：CD1D ，EREG，ETS2
，FCN1，G0S2 ，LYVE1
，MAP2K1，MT1G
。使用COSMX人通用细胞分割试剂盒（RNA） ，人IO Panck/CD45试剂盒（RNA）和人CD68标记
，CH5（RNA）进行分割。视场（FOV）在所有可用区域（221个对照，378 PSC）中均铺有瓷砖 ，并使用COSMX SMI（纳米弦）系统进行了循环荧光原位杂交 。在ATOMX空间信息平台上进行了预处理
，并分割了图像以获得细胞边界，分配给单个单元格的转录本 ，并获得了细胞计数矩阵的转录本97
。输出表达矩阵
，转录坐标，多边形坐标 ，FOV坐标和细胞元数据，并使用insitype98进行了质量控制
，归一化和细胞型 - 开发了R套件，以提取每个细胞表达式中可用的所有信息。半监督的策略用于表型细胞 ，并结合了肝脏人类细胞地图集参考基质 。巨噬细胞表型的空间分析是根据胆管细胞（锚式细胞类型）的接近性进行的。使用phenoptr（https://akoyabio.github.io/phenoptr/）进行半径和最近的邻域分析 从胆管细胞中分布的巨噬细胞分布
，以100 µm的增量为500 µm
。进行了最接近的邻居分析，以确定从胆管细胞到最近的炎症和非炎性巨噬细胞的距离 ，反之亦然。 　　为了生成覆盖图像
，将原始转录本和图像（形态2D）数据从ATOMX导出 。Overlays of selected ETS2-target genes (CXCL8, S100A9, CCL2, CCL5) and fluorescent morphology markers were generated using napari (v.0.4.17, https://napari.org/stable/index.html) on representative FOVs: FOV287 (PSC with involved duct), FOV294 (PSC background liver)和FOV55（健康肝脏）
。 　　从GEO：IBD巨噬细胞（GSE123141），PSC Liver（GSE159676） ，Ankylosing Spondymy symymysynovium（GSE41038）下载了来自CHR21Q22相关疾病（以及同一实验的对照）的公开可用的RNA-SEQ数据（以及同一实验的对照）。如前所述
，对读取进行修剪，过滤和对齐 。对于每个疾病数据集 ，使用Limma与VOOM转化的案例和对照之间的差异表达分析获得了基因的排名列表
。对于IBD巨噬细胞
，仅包括具有活性疾病的IBD样品。如所述，使用ETS2调节的基因列表进行了FGSEA 。 　　从NIH Lincs Database7（2021年1月下载） ，总共有31,027个下调基因列表
。这些用作FGSEA（如上所述）的基因集，该基因的基因列表
，通过使用limma和voom转化的limma和供体作为协方差，通过ETS2编辑和未编辑的TPP巨噬细胞和未编辑的TPP巨噬细胞（GRNA1）获得的基因列表。根据已知的作用机理 ，手动分配了具有FDR调整后P <0.05的基因组的药物类别 。 　　如前所述生成TPP巨噬细胞
。在培养的第4天
，加入了PD-0325901（0.5μM，Sigma-Aldrich）或媒介物（DMSO）。在第6天收集细胞 ，并如上所述提取RNA并测序 。 　　在结肠镜检查过程中
，从IBD患者（7例溃疡性结肠炎患者，三名克罗恩病患者）收集了肠粘膜活检（每个供体6例）。所有人都有内镜疾病 ，没有接受免疫抑制或生物疗法
。所有活检都是从单个发炎部位收集的。所有患者均提供了书面知情同意 。伦敦 - 姆大地区地区伦理委员会（21/LO/0682）提供了道德批准
。将活检收集到Opti-Mem中
，并在1小时内称重，并将其成对放在transwell插入物（Thermo Fisher Scientific）上 ，旨在在24孔板中创建空气 - 液体界面99。每个井都包含1 ml培养基
，并用DMSO（载体对照），PD-0325901（0.5μM）或英夫利昔单抗（10μgml-1; MSD）补充 。培养基如下：Opti-Mem I（Gibco） ，谷马克斯（Thermo Fisher Scientific），10％FBS（Thermo Fisher Scientific）
，非内部非必需氨基酸（Thermo Fisher Scientific），1％吡喃钠钠（Thermo Fisher Scientific）（Thermo Fisher Scientific） ，1％青霉素 - 链霉素蛋白 - 链霉素霉素（Thermo-Stherocin）（Thermo Scientific）和50岁（50岁）
。18小时后
，上清液和活检被刺耳。使用LegendPlex人体炎症面板（Biolegend）对上清液细胞因子浓度进行定量 。从活检中提取RNA，并如前所述制备文库（n = 9 ，一个捐赠者的RNA过于降解）
。在Novaseq 6000系统（100 bp配对读取）上进行测序。如前所述处理数据
，并对IBD相关炎症的ETS2调节基因和活检衍生的特征进行GSVA 。46
。 　　使用来自七个尼安德特人的公开基因组100,101,102,103，一个Denisovan个人104和一个Neanderthal和Denisovan F1个人105 ，在疾病相关的CHR21Q22候选SNP中
，使用BCFTools Mpiles Mpiles and baseque fors base -ftel -feque -qualt -qualt -qualt -qualt -qualt -qualt -qualt and chr21q22候选snps，在疾病相关的CHR21q22候选SNP中调用基因型 --M -C等位基因 ，指定目标文件中每个站点的两个等位基因（-t选项）。从结果.VCF文件中
，提取并存储在“ DP4”字段中的支持参考和替代等位基因的读数 。 　　先前针对Simons基因组多样性Project106的样品推断出基因组的家谱，使用Relate107,108（https://reichdata.hms.harvard.edu/pub/datasets/sgdp/）。https://www.dropbox.com/sh/2gjyxe3kqzh932o/aaaqccipchnysgeb873t9eqjna?dl = 0
。使用推断的家谱 ，使用Relate的TreeView Module绘制了RS2836882（CHR21：40466570）的家谱。 　　使用以下R包来创建数字：Genomicranges109，增强Volcano110
，GGPLOT2（参考文献111），GPLOTS112 ，Karyoploter113 。 　　上面描述了MPRA分析
，FGSEA和SNPSEA中使用的统计方法
。对于其他分析，使用Wilcoxon匹配的测试（配对）或Mann-Whitney U检验（未配对）进行非参数数据或参数数据的t检验 ，对两组之间的连续变量进行比较。使用Wilcoxon签名级测试对非参数数据或一个样本t检验进行参数数据进行比较 。Shapiro -Wilk测试用于确认正常性
。除非对特定的假设进行测试
，否则将双面测试用作标准测试。样本尺寸在主文本和图形标题中提供 。 　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得
。