C57BL/6J小鼠用于所有涉及野生型小鼠和药理治疗的实验。分别为年轻 ，中年
，老年和老年群体选择了10-14周，31-37周 ，52-75周和> 95周的小鼠 。所有年龄段的雌性和雄性小鼠均用于初始BM扩张分析
，而仅使用雌性小鼠进行剩余的实验
。FLK1-GFP报告基因小鼠17用于初始血管表征。对于造血细胞的遗传标记，将VAV1-CRE小鼠21与ROSA26-MTMG报告基因小鼠杂交 ，以生成VAV-MTMG小鼠 。为了使造血细胞的光转换，将VAV1-CRE小鼠与Rosa26-Cag-loxp-Stop-Stop-loxp-Kikgr敲入小鼠杂交
，以生成Vav-Kikgr小鼠
。对于怀孕实验，将10周龄的C57BL/6J雌性小鼠与10至12周龄的C57BL/6J雄性小鼠配对 ，并通过早晨存在阴道塞来确定怀孕的发作。十周龄的小鼠每天接受PTH（1-34）（BACHEM
，0.1 mg kg-1持续28天），PGE2（Cayman Chemical ，2 mg kg-1持续7天）
，AMD3100（abcam，5 mg kg-1持续14天） ，接受PTH（1-34）（BACHEM
，0.1 mg kg-1）接受 。对于DC101治疗，10周龄的小鼠接受腹膜内注射DC101（Bioxcell ，40 mg kg-1）每2天
，持续12周。 　　将小鼠保存在单独通风的笼子中，在光线12小时和12小时的黑暗周期状态下不断进入食物和水
。空气流 ，温度（21–22°C）和湿度（55-60％）由空气管理系统控制。每天检查小鼠，并保持在没有特定病原体的条件下 。提供了足够的筑巢材料和环境富集
。所有动物实验均根据当地动物伦理委员会批准的机构准则和法律进行
，并在Max Planck分子生物医学研究所（84-02.04.2016.A160，81-02.04.204.2018.A171 ，81-02.A171
，81-02.04.2.04.2020.A2121212，812.04.2012 ，812.04.2016.A160
，812.04.2016.A160）81-02.04.2022.A198），柏林大学（G0220/17） ，Georg-Speyer-Haus（F123/2017）和University Medical Center Mainz Mainz Toflufion Medicine（G23-1-1-067 A1TE）在诺斯蒂斯（Landesmt）授予的指定权限下
，landesmt ferutrauv fivul forut forut foruters，莱茵 - 韦斯特法里亚 ，柏林卫生与社会事务办公室
，雷金斯普（Regierungspräsidiumdarmstadt）和德国的Landesuntersuntersungungsungsungsungsungsungsungsungsungsungsamt。 　　该研究得到了当地伦理委员会和ASAN医疗中心的机构审查委员会（IRB）的批准，由于研究的回顾性质 ，已放弃知情同意的要求（IRB编号：2023-0658） 。该研究人群由36例患者组成，分为4组
，根据年龄（20至40岁，超过60岁）和性别（男性 ，女性）
，每组中有9个人
。从4月至2023年5月，接受CT评估小脑动脉瘤的患者符合条件。如果参与者先前对头部和颈部 ，血管或骨相关的医疗植入物或小脑动脉瘤以外的可疑疾病有手术或放射疗法的史
，则将其排除在外 。 　　所有人类患者均在相同的128通道多探测器CT系统（Somatom定义边缘；西门子）上进行了CT检查
。成像变量如下：100 kV；100有效的MAS；轴向扫描模式；截面厚度为0.5毫米；显示FOV，20.5厘米；音高1;龙门旋转时间为0.5 s;像素矩阵 ，512×512。从顶点到第一颈椎获得图像
，而没有静脉注射对比培养基 。 　　将CT数据以数字方式传输到个人计算机，并使用ImageJ软件（http://rsb.info.nih.gov/ij/）处理
。在轴向CT图像上垂直于最外面凸区域的冠状CT图像上选择了代表性图像。在对顶骨的全骨分割后 ，通过CT扫描的衰减密度来定义皮质骨和BM：皮质骨（皮质骨）为850个Hounsfield单元和BM
，为小于850 Hounsfield单元及其面积及其面积 。 　　通过PBS和4％多聚甲醛（PFA），头骨和股骨收集并立即在冰冷的4％PFA中固定6-8小时 ，通过PBS和4％多聚甲醛（PFA）的心脏灌注和4％多聚甲醛（PFA）进行安乐死。将骨头在0.5 m EDTA中脱钙3天（对于头骨）或7天（对于股骨）在4°C下在轻柔的摇动搅拌下，间隔5分钟
，在PBS中洗涤5次，然后在冷冻保护剂溶液中过夜孵育（20％蔗糖 ，2％的聚乙烯基甲基丙烯酮中的2％嵌入中等含量（8％）
，并固定在骨骼中，为8％（8％） ，并固定在骨骼中
，为8％，固定在2％中 ，并固定在8％的嵌入中（8％）聚乙烯基吡咯烷酮）
。将样品存储在-80°C下过夜。制备80μm厚的冷冻切片以进行免疫荧光染色 。 　　将骨切片在PBS中洗涤
，并在室温下用0.3％Triton X-100透化10分钟
。在室温下，将样品在阻断溶液中（5％热灭活的驴血清中的5％热活化的驴血清）孵育1小时。Primary antibodies (rat monoclonal anti-endomucin (V.7C7) (Santa Cruz, sc-65495, 1:200 dilution), rabbit monoclonal anti-vATPaseB1/B2 (Abcam, 200839, 1:200 dilution), goat polyclonal anti-osteopontin (R&D Systems, AF808, 1:200 dilution), goat polyclonalanti-CD31 (R&D, AF3628, 1:200 dilution), rabbit polyclonal anti-caveolin-1 (Cell Signaling, 3238, 1:100), goat polyclonal anti-VEGF164 (R&D Systems, AF-493-NA, 1:200 dilution), and rat monoclonal APC-conjugated anti-CD117 (KIT) (BD在5％的驴血清中稀释了553356 ，1：100稀释
，并在4°C下孵育过夜 。Fisher Scientific，A21209） ，Alexa Fluor 647（Thermo Fisher Scientific，A31573或A21447）在PBS中稀释了5％驴血清的PBS
，并在4°C中孵育3-5次
。1：1,000稀释板。 　　大鼠单克隆抗CD31（BD Biosciences，553708）使用Alexa Fluor 647抗体标签试剂盒（Thermo Fisher Scientific ，A20186）与Alexa Fluor 647相连
，根据制造商的指示 。对于血管免疫染色，将共轭抗CD31抗体和大鼠单克隆PE偶联抗domucin（V.7C7）（Santa Cruz ，65495 PE）在200μlPBS中稀释1:10
，并将其注射到尾部静脉中
。对于造血细胞免疫染色，大鼠单克隆FITC偶联的抗CD45（EBISoscience ，11-0451-82）
，仓鼠单克隆FITC缀合的抗CD3E（EBIISOSCIESS）（EBIISOSCIESS，16-0031-82） ，16-0031-82
，HIMOCLOSCLOSCLOSCLOSCLONENICES，Rat-Conosclonal Pe-Conjigiiention ant/bd-conjcd151（Bd-bdi-bdi-bd anti ant-bd anti ant/bdi ant-bd ant-bdr ant-bdr ant-bdr ant-bdr ant-bdr ant-bdr。553090） ，将大鼠单克隆FITC偶联的抗CD11b（BD Biosciences，553310）在PBS中稀释1:10
，并静脉注射到尾静脉中 。用PBS心心灌注注射后1小时，将小鼠安乐死 ，并在温和的搅拌下收集4％PFA
，并在冰冷的4％PFA中立即固定6-8小时
。用镊子小心地从头骨上移走硬脑膜。将骨骼在0.5 m的EDTA中脱钙1天（对于头骨）或7天（对于股骨）在4°C的轻轻振动下在4°C下（股骨），并以5分钟的间隔在PBS中以5次洗涤5次 。用DAPI（1：500稀释）对头骨进行对抗1小时 ，并将其修剪至钙瓦尔河瓦尔河瓦尔邦
，然后用PBS与ISPOCERS（Sunjin Lab，IS011）安装。如上所述 ，将股骨冷冻
，反染色和安装
。 　　对于Evans蓝色泄漏测定法，在尾静脉注射200μlEvans蓝溶液之前立即将小鼠麻醉（Sigma-Aldrich ，E2129
，1％V/W）。如上所述，注射5分钟后 ，通过心心灌注对小鼠安乐死 。为了区分硬脑膜的血管泄漏和颅骨BM，在过夜脱钙化之前
，将硬脑膜组织与钙骨骨分离
。 　　用Zeiss LSM980（Carl Zeiss）成像免疫染色的样品。使用Zen Black（Carl Zeiss，V2.3） ，ImageJ（NIH
，V2.0.0）和Imaris（Bitplane，v10.0.1）分析 ，量化和处理图像 。蒂尔斯卡（Tilescan）概述了头骨BM的图像在黑色背景的顶部叠加
，在没有图像数据的情况下填充空角
。通过从单个容器的Z-stack中选择最宽的容器直径的Z平面图像来测量血管直径。 　　分离出12周大的小鼠和73周龄小鼠的头骨和股骨，并浸入4％PFA ，0.5％戊二醛
，2 mM MGCl2，2 mm Cacl2 ，在0.1 M cacodylate缓冲液中
，pH 7.4，在室温下搅拌2小时 。在2％戊二醛 ，2 mM MGCL2，2 mM CaCl2中
，在0.1 m cacodylate缓冲液中，将样品固定在一夜之间 ，在4°C下pH 7.4
。然后将骨骼在12天内脱钙
，每隔一天将溶液在5％的EDTA中改变为0.1 m cacodylate缓冲液，在4°C下旋转下pH 7.4。随后 ，用振动型（VT 1200
，Leica）生成150μm的切片 。将切片固定在1％OSMO4中，其中含有2.5％PFA - 葡萄醛醛混合物 ，用0.1 M磷酸盐（pH 7.2）缓冲5 h
，然后将使用E3000（Polaron）关键点干式干燥机放置在分级乙醇中以进行临界点干燥
。将临界点干燥的骨头放在一块碳胶带上，并在SC502溅射座椅（Polaron）中涂有金子。在韩国生物科学与生物技术研究所安装的量子250田间排放扫描电子显微镜（FEI Quanta 250 FEG ，FEI
，FEI，FEI ，FEI，FEI）上成像 。 　　通过PBS和4％PFA的心脏心脏灌注对小鼠进行安乐死
，收集头骨，并在温和的搅动下立即将其固定在冰冷的4％PFA中6-8 h。在温和的振动下 ，在4°C的0.5 m EDTA中将头骨在0.5 m的EDTA中脱钙24小时
，在PBS中以5分钟的间隔在PBS中洗涤5次，将其修剪至Calvarium ，并在阻断溶液中孵育（5％热灭活的驴子在0.3％Triton X-100中）
，在室温下为1小时
。将山羊多克隆抗CD31（R＆D，AF3628 ，1：100稀释）在PBS中以5％的驴血清稀释
，并在4°C下温和搅拌在4°C孵育过夜。在10分钟间隔间隔10分钟，将样品在PBS中洗涤3-5次 。添加了Alexa Fluor 647（Thermo Fisher Scientific ，A21447）在PBS中以5％驴血清稀释
，并在4°C下温和搅拌在4°C下孵育过夜
。将样品在PBS中以10分钟的间隔在PBS中洗涤3-5次，并在PBS中用ISPOCER（Sunjin Lab ，IS011）洗涤样品。 　　在整个实验中，都使用了16周龄的雌性C57BL6/J小鼠 。通过腹膜内注射10 mg kg-1甲基嗪（CP-PHARMA）和90 mg kg-1盐酸盐（CP-PHARMA）的混合物来麻醉小鼠
。在整个过程和恢复过程中
，通过加热垫保持体温在37°C。在左近端颈动脉和颈外动脉连接后，通过在连接的颈动脉的连接切口中将带有0.23毫米的涂层尖端的7.0尼龙单丝（Doccol）引入颈内动脉远端 。单丝远端是颈动脉分叉的远端 ，以阻塞中大脑中动脉
。Arter局部使用盐酸麻醉剂（Xylocain Spray 2％
，Aspen）颈部伤口暂时关闭45分钟缺血时期。再灌注时，单丝从颈动脉动脉中撤出 ，并用4-0不可吸收的缝合线（Ethibond Excel
，Ethicon）和单一的S.C缝制了伤口 。注射青霉素G 20 000 U（苯甲酰苯基核苷，感染力）
。将小鼠返回其笼子以在观察中恢复。 　　六周大的雌性C57BL/6小鼠购自查尔斯河实验室 ，并用作所有移植物的捐助者和接受者 。如前所述进行移植实验。In brief, to induce CML-like myeloproliferative neoplasia, donor BM cells from donor mice pre-treated with 5-fluorouracil (200 mg kg−1 intravenously; 4 days prior to collection) were pre-stimulated overnight in medium containing SCF (50 ng ml−1), IL-6 (10 ng ml−1) and IL-3 (6 ng ml−1) and连续两天用鼠干细胞病毒（MSCV）-IRES-GFP-BCR-ABL1转导
，以诱导CML或MSCV-IRES-GFP对照病毒
。随后，将转导的细胞静脉内移植（每只小鼠2.5×105个细胞）被室内受辐照的（900 CGY）受体小鼠。移植后14天对小鼠安乐死 。 　　为了移植谱系阴性BM细胞 ，对年轻（10至14周龄）或旧（52至75周龄）的供体小鼠进行了安乐死
，并收集了头骨
。首先在FACS缓冲液中用剪刀切碎（胎儿2％的PBS），然后用砂浆和杵粉碎。通过40μm网状过滤器（Falcon ，352340）过滤细胞悬浮液，重悬于RBC裂解缓冲液（Sigma-Aldrich
，R7757）中，以进行红细胞裂解 ，并用FACS缓冲液洗涤 。Cells were resuspended in FACS buffer and incubated with a biotinylated anti-haematopoietic lineage antibody cocktail (Miltenyi-Biotec, 130-092-613, 1:10 dilution), followed by washing with FACS buffer and incubation with R-PE-conjugated streptavidin secondary antibody (Invitrogen, S866, 1:50 dilution).将DAPI（1：1,000稀释）添加到重悬的细胞中
，以区分活细胞和死细胞，并在FACSARIA融合（BD Biosciences）上对实时谱系阴性细胞进行FACS分类
。将分选的细胞静脉内移植（5×105个细胞/小鼠）中的受辐照度（12 Gy ，最佳疗法
，γ40gyptor）40级的受体小鼠（12周大）。移植后14天对小鼠安乐死 。 　　每个年龄段的小鼠安乐死，并收集头骨和股骨
。在用砂浆和杵压碎之前 ，将头骨在FACS缓冲液中切碎。股骨被压碎而不切碎 。BM基质样品与胶原酶I（Gibco
，17100-017，2 mg ML-1）和胶原酶IV（Gibco ，17104-019
，2 mg ml-1）在37°C中在PBS中20分钟，并在PBS中分离20分钟
。细胞悬浮液通过40μm的网状滤光片应压 ，并重悬于RBC裂解缓冲液（适用时），并用FACS缓冲液洗涤。Cells were resuspended and incubated with the following primary antibodies in FACS buffer: biotinylated rat monoclonal anti-haematopoietic lineage antibody cocktail (Miltenyi-Biotec, 130-092-613, 1:50 dilution), APC-conjugated rat monoclonal anti-CD117 (BD Biosciences, 553356, 1:100稀释）
，FITC偶联的大鼠单克隆抗CD117（Biolegend，105806 ，1：100稀释）
，FITC偶联的大鼠单克隆抗Ly6a/e（SCA1）（Ebioscienciencienciencience（Ebioscience(Invitrogen, 45-5981, 1:100), APC-Cy7-conjugated hamster monoclonal anti-CD48 (BD Biosciences, 561242, 1:100 dilution), PE-conjugated rat monoclonal anti-CD150 (SLAM) (Biolegend, 115904, 1:100 dilution), Alexa Fluor 647-conjugatedrat monoclonal anti-CD150 (Biolegend, 115918, 1:100 dilution), PE-Cy7-conjugated rat monoclonal anti-CD45 (eBioscience, 25-0451-82, 1:100 dilution), BV421-conjugated rat monoclonal anti-TER-119 (Biolegend, 116234, 1:100 dilution),FITC-conjugated rat monoclonal anti-CD71 (Biolegend, 113806, 1:100 dilution), Alexa Fluor 647-conjugated rat monoclonal anti-CD31 (BD Biosciences, 553708, conjugation described above, 1:200 dilution), PE-conjugated rat monoclonal anti-endomucin (Santa Cruz,65495 PE，1：100稀释） ，PE-CY7偶联的大鼠单克隆抗CD16/32（Ebioscience
，25-0161，1：100稀释） ，Efluor 450偶联的大鼠单克隆单克隆单克隆单克单克隆抗体抗CD34（EBISCIENT PE-conjugated rat monoclonal anti-CD127 (eBioscience, 12-1271, 1:100 dilution), BV711-conjugated rat monoclonal anti-CD41 (BD Biosciences, 740712, 1:100 dilution), PE-conjugated rat monoclonal anti-CD105 (eBioscience, 12-1051-82, 1:100dilution), APC-conjugated hamster monoclonal anti-CD3e (eBioscience, 17-0031, 1:100 dilution), PE-conjugated rat monoclonal anti-CD45R/B220 (BD Biosciences, 553090, 1:100 dilution), FITC-conjugated rat monoclonal anti-CD11b (BD Biosciences,553310
，1：100稀释） 。用Alexa Fluor 405偶联（Invitrogen，s32351 ，1：100稀释）或APC-CY7偶联（BD Biosciences
，554063，554063 ，1：100稀释）在FACS缓冲液中洗涤，将细胞重悬于FACS缓冲液中。 　　将外周血从下颌下静脉中收集到带有柳叶囊的静脉（Medipoint）中
，以EDTA涂层管
。将血液重悬于RBC裂解缓冲液中，并用FACS缓冲液洗涤。Cells were resuspended and incubated with the following primary antibodies in FACS buffer: biotinylated rat monoclonal anti-haematopoietic lineage antibody cocktail (Miltenyi-Biotgec, 130-092-613, 1:50 dilution), APC-conjugated rat monoclonal anti-CD117 (BD Biosciences, 553356,1：100稀释） ，FITC偶联的大鼠单克隆抗LY6A/E（SCA1）（Ebiososcience
，11-5981-85，1：100稀释） ，太平洋蓝色偶联的小鼠单克隆单克隆抗CD45.2（Ebioscience
，17-0031，1：100稀释） ，PE偶联的大鼠单克隆抗CD45R/B220（BD Biosciences
，553090，1：100稀释） ，FITC偶联的大鼠单克隆单克单克单克单克抗CD11b（BD Biosciences（Bd Biosciences）（BD Biosciences
，553333310，1：100 dialution） 。在用FACSymphony A5细胞分析仪（BD Biosciences）分析之前 ，将细胞洗涤并重悬于FACS缓冲液中
。 　　将来自10周大的小鼠头骨的FACS分级细胞裂解，并使用Monarch总RNA MiniPREP试剂盒（新英格兰Biolabs
，T2010S）提取RNA。用Nanodrop 8000分光光度计（Thermo Fisher Scientific）测量提取的RNA浓度，并用luncascript RT Supermix套件（新英格兰Biolabs ，E3010L）生成cDNA 。使用Fam-Roged的Taqman探针（MM00437306_M1）使用Biorad CFX96实时PCR系统进行定量PCR（MM00437306_M1）或使用Powerup Sybr Green Master Mix（Applied Biosyystems
，A25742，A25742） ，使用Primers使用Pimerblast或Compand ven的Primers设计
。（5'-AACGATGAAGCCCTGGAGTG-3'; 5'-TGAGGGTCTGGTCCCCAGA-3'）;VEGFA164（5'-AACGATGAAGCCCTGGAGTG; 5'-GACAAACAAACAAATGCTTTCTCCG-3'）;VEGFA188（5'-AACGATGAAGCCCTGGAGTG-3'; 5'-AACAAGGCTCACAGTGAACG-3'）。将基因表达水平标准化为内源性VIC偶联的GAPDH探针（44326317E）作为对照 。 　　每个年龄段的小鼠安乐死
，收集骨骼
。将头骨切碎，然后被冰冷的Ripa裂解缓冲液粉碎和杵粉碎。股骨被压碎而不切碎 。Supernatants of centrifuged lysates were further concentrated using an Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit with a 3 kDa cutoff (Millipore, UFC500396), resulting concentrations were measured using a Pierce BCA Protein Assay Kit (Thermo Fisher Scientific, 23225), and the concentrations of VEGFA in tissue extracts were measured using a Mouse VEGFA Quantikine ELISA套件（R＆D Systems ，MMV00-1）
。 　　根据制造商的说明
，用低氧探针pimonidazole（PIMO，低氧Probe）检测到低氧细胞。分析前将小鼠腹膜内注射60 mg kg -1 1 。 　　为了生成含有HA标签 ，金属蛋白酶和8x ASP肽序列的含有VEGF165的含有VEGF165的plive-vegfa165-ha-mp-asp8x骨骼蛋白
，用pCR通过PCR放大了oligonucle的vEVA，cDNA碎片编码氨基酸1-191通过PCR扩增5'-ATGAACTTTCTGCTGTCT-3'和VEGFA-XHOI-REV：5'-CCGCCTCGGCTCGGCTTGTCACATCTGCA-3' ，并用Nebuilder组件克隆套件退火。 　　十周大的小鼠用于流体动力尾静脉注射
。将小鼠注射0.5μgG-1（质粒/体重）Plive-VEGFA质粒悬浮在Transit-EE流体动力传递溶液中（Mirus，mir5340）。如先前报道的62
，将适当量的质粒悬浮在体重的10％的10％的注射体积中，并通过5-7 s注射到每只小鼠中 。 　　为了使中性脂质染色 ，将整个钙或股骨冷冻切片在室温下在室温下温和搅拌下（仅钙）在室温下孵育1小时
。在安装前
，用5分钟的间隔将样品用PBS洗涤3-5次。 　　每个年龄段的小鼠安乐死并收集骨骼 。将头骨切碎，然后被冰冷的Ripa裂解缓冲液粉碎和杵粉碎
。股骨被压碎而不切碎。使用超0.5个离心滤波器单元进一步浓缩离心裂解物的上清液 ，该单元具有3 kDa临界值（Millipore
，UFC500396），使用Pierce BCA蛋白测定试剂盒（Thermo Fisher Scientific ，23225）和nosem cyormation cyootokines noreotokosations使用Pierce BCA蛋白质测定试剂盒测量产生的浓度（13-plex）带有V底板（Biolegend
，740446） 。对FACSymphony（BD生物科学）和定量的分析是根据制造商的协议进行的
。使用BioleGend提供的软件进行数据分析。手动门控用于定义珠子A和B，并使用自动门控策略来栅格在APC – PE图中的单个细胞因子 。 　　在辐照之前 ，用氯胺酮（100 mg kg -1）和甲基嗪（10 mg kg -1）麻醉小鼠
。对于部分屏蔽
，将小鼠的整个头部或两条腿插入圆柱1英寸厚的铅盾（JRT Associates，pti-50-p）的开口中 ，并暴露于致命的辐照（12 Gy）。将小鼠返回其笼子以在观察中恢复 。 　　每个年龄段的小鼠安乐死，并收集头骨和股骨。在用砂浆和杵压碎之前
，将头骨在FACS缓冲液中切碎
。股骨被压碎而不切碎。BM基质样品与胶原酶I（Gibco，17100-017 ，2 mg ML-1）和胶原酶IV（Gibco
，17104-019，2 mg ml-1）在37°C中在PBS中20分钟 ，并在PBS中分离20分钟 。细胞悬浮液通过40μm的网状滤光片过滤
，并用FACS缓冲液洗涤
。将细胞重悬于生物素化的大鼠单克隆抗Haematopoietic谱系抗体鸡尾酒（Miltenyi-Biotec，130-092-613 ，1：50稀释）中。洗涤细胞
，用小鼠单克隆抗生物素微粒（Miltenyi-Biotec，130-105-637 ，1：50稀释）重悬于FACS缓冲液中
，并在加载到磁相关的细胞排序（MACS）柱（MILTENYI-BIOTICE）（MILTENYI-BIOTICEC，130-042-2E）中孵化 。将LIN-细胞与大鼠单克隆抗CD45微粒（Miltenyi-Biotec ，130-052-301，1：50稀释）一起孵育113803
，1：100）
。将细胞洗涤，将小鼠单克隆抗抗激素微粒（Miltenyi-Biotec ，130-105-637
，1：50稀释）重悬于FACS缓冲液中，并在加载到磁相关的细胞排序（MACS）柱（MILTENYI-BIOTICEC ，130-0-042-20）之前孵育
，以便于用BD狂想曲处理单细胞悬浮液，并使用高灵敏度DNA试剂盒（Agilent Technologies ，5067-4626）和Qubit（Thermo Fisher Scientific
，Q32851）对Agilent Bioanalymer进行评估和量化SCRNA-SEQ库。将单个文库稀释至4 nm并汇总以进行测序 。通过使用高输出套件（Illumina，TG-160-2002）和NextSeq500 Sequencer（Illumina）对汇总的库进行测序
。 　　预处理：2.7.10a版本（PMID：23104886）用于生成用于GRCM39的参考基因组指数 ，带有Gencode注释VM29
，子集，lncRNA和蛋白质编码基因。 　　FASTQ reads were mapped against the reference genome index using STAR with the settings “--soloType CB_UMI_Complex --soloCellFilter None --outSAMtype BAM SortedByCoordinate --soloFeatures GeneFull_Ex50pAS --soloCBmatchWLtype 1MM --soloUMIlen 8 --soloCBwhitelist BD_CLS1.txtbd_cls2.txt bd_cls3.txt - runrngseed 1 - solomultimappers em -readfilescommand zcat -outsamattributes nh hi as nm nm nm nm nm nm nm jm ji mc ch c ch c ch c c c c c ub gx gx gx gn ss cr cr cr cr cr cr cy ul uy'' 。Libraries using standard BD Rhapsody beads were mapped using the adapter parameters “--soloAdapterSequence NNNNNNNNNACTGGCCTGCGANNNNNNNNNGGTAGCGGTGACA --soloCBposition 2_0_2_8 2_21_2_29 3_1_3_9 --soloUMIposition 3_10_3_17”, libraries withBD Rhapsody用-soloadapterSequence增强了珠子Nnnnnnnnnnnngtgannnnnnnnnnnngaca---索洛克布PPosition 2_0_0_2_8 2_13_2_2_2_2_2_21 3_1_1_1_3_9 -solouMiposition 3_10_3_17
。 　　原始计数被导入为anndata63对象。我们使用膝盖图方法除去了低复杂性条形码 ，并用线粒体mRNA含量进一步过滤了细胞，并使用每个样品的手动确定的截止值进行了异常高的总和基因计数 。用scrublet64评分双线。最后
，使用SCRAN65（1.22.1）用Leiden clustering66输入以分辨率为0.5，将每个样品的基因表达矩阵进行标准化
。 　　G2M和S相得分使用参考文献中的基因列表分配给每个细胞。67和scanpy68（1.9.6）sc.tl.score_genes_cell_cycle函数 。 　　嵌入 ，聚类和注释：将样品和细胞群体的不同组合（所有
，ECS，HSC）用作2D嵌入和聚类的输入：相应的表达矩阵分别为2,000个高度可变的基因（sc.pp.pp.highly_variable_varible_variable_genes ，seurat seurat seurat''）
。计算了前50个主要组件
，并使用Harmonony69（0.0.9）进行了批处理校正。主要组件是K-Nearest邻居计算的基础（sc.pp.neighbors，n_neighbors = 30） ，用作UMAP70布局的输入（sc.tl.umap
，min_dist = 0.3） 。使用scanpy.tl.leiden聚类细胞群体，并选择合适的分辨率进行第一通道注释
。在这里 ，除去了污染细胞群
，包括多重簇，并重复聚类。使用伪库方法计算簇标记基因 ，将每个群集的汇总计数与2个伪塑料与所有其余细胞进行比较（Pydeseq2 0.4.8） 。最后，使用matplotlib71（3.8.4）Imshow绘制了某些标记基因的表达
，并相应地注释了簇
。 　　差异表达分析：使用伪库尔克方法计算差异表达的基因，将骨料计数与每个条件的两个伪层次进行比较（Pydeseq2 0.4.8）。 　　用氯胺酮（100 mg kg-1）和甲基嗪（10 mg kg-1）对VAV1-KIKGR小鼠进行麻醉 。如前所述72 ，生成了皮瓣以暴露钙钙
。然后
，将钙的每个暴露区域暴露于蔡司轴成像仪（Zeiss显微镜）60 s的紫外线，在暴露另一个区域之前 ，证实了从绿色到红色荧光的光转化。如上所述
，将皮肤皮瓣缝合在一起，并通过流式细胞仪分析外周血 ，以检查光转向的细胞是否存在光转向的细胞
，而光转染后的外周血不存在 。光转化后一周，抽取外周血 ，对Alexa荧光偶联的大鼠单克隆抗CD45进行染色
，并通过流式细胞仪分析CD45+光转介透出的造成颅骨BM。 　　没有使用统计方法来预先确定样本量
。实验是随机的，研究人员在实验和结果分析过程中对分配视而不见。所有值均表示为平均值±S.D.统计显着性由两组之间的两尾未配对的学生的t检验确定 ，或Tukey多重比较测试（单向ANOVA）进行多组比较 。使用GraphPad Prism 9.0（GraphPad软件）进行统计分析
。统计显着性设置为p <0.05。 　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得 。