IPS细胞是由对控制的人类早期新生儿皮肤成纤维细胞（Gibco C0045C）产生的，其显然是正常的核型（根据Cellg固定样品协议 ，根据CellGS固定样品协议在细胞引导系统中检查）
，通过使用编码Oct3/4，Sox2 ，Klf4和Tp53 Shrna Shrna61,62 。质粒（Addgene＃27077
，＃27078和＃27080; 1 µg每个）使用100 µL NEON TIPS（Invitrogen MMPK10025）在NEON转染系统（脉冲电压：1,650 V，宽度：1,650 V ，宽度：10毫秒：10毫秒：10毫秒，编号：3; Invitr）上
，将100万个成纤维细胞分成100万个成纤维细胞
。电穿孔后，将细胞在成纤维细胞培养基（DMEM（Sigma D5671）; 20％FBS（Gibco 10270-106）; 1×Glutamax（Gibco 35050-Gibco 35050-61）中生长在成纤维细胞培养基（DMEM（Sigma D5671）; 20％FBS（Sigma D5671）; 20％FBS（Sigma d5671）; 20％FBS上（GIBCO 10270-106）；11140-050）;在第3天的电器载物（然后直到第12天） ，将0.5 µg ml-1的丁酸钠（Sigma B5887）添加到培养基中。然后将成纤维细胞亚培养在IPS细胞培养基（敲除DMEM/F12（GIBCO 12660012）的IPS第5天（20％敲除Serum替换量）（GLUT）（GIBCO COCO（GIBCO）
，GIBCO（GIBCO）（GIBCO COCO）（GLUT）（GLUT）（GLUT）（GLUT）（glut）（glut）（glut）（glut）（glut）（glut）（glut），35050-061; 1×NEAA（Gibco 11140-050）;在第11天左右观察到了第一个IPS细胞菌落 。在第14天进行了阳性活碱性磷酸酶染色（Invitrogen A14353）
。在第14-21天手动挑选IPS细胞菌落 ，重新悬浮并重新播放到新鲜的MEF 24孔板上。然后扩展IPS细胞克隆
，并在IPS细胞冷冻培养基中（IPS细胞介质 + 10％DMSO（Sigma D2650-100ML））以10/11的通道10/11进行了表现出最佳增殖和形态（NIPS 8 、9和10）的iPS细胞克隆 。进一步扩展到P12-15后，准备细胞进行细胞指导系统的核型检查 （根据Cellg固定样品方案）并基于其明显正常的核分型结果 ，选择了NIPS 10进行进一步的实验。 　　与我们先前关于人类胚胎干细胞的研究类似
，手动采摘IPS细胞菌落并部分解散成较小的团块，并转移到非粘附性培养皿中 ，并在存在EB培养基（IPS培养基（IPS培养基培养基）的情况下
，都会形成胚胎体
。5–7天后，将胚胎体转移到多雌性（Sigma p4957-50ml；在无菌水中20 µg mL-1（Gibco 10977035） ，在37°C时1 h，用3次洗涤
，然后用PBS洗涤3次（Gibco 1001515）和laminin（Gibco 10015）和Gibco 23017-1 Hlaminin（Gibco 10015）。在37°C）涂料的菜肴中，并在NSC培养基中粘附（DMEM/F12（GIBCO 21331046）； 0.5×B27-补充（Gibco 12587-010） ，0.5×N2补充（Gibco 17502-048）（Gibco 17502-048）; 1×Glutamax; 1×Gibco 350505050505061）;（GIBCO PHG0261）） 。在4-10天内观察到神经玫瑰花结的形成
。在EVOS XL核心成像系统（Lifetech Amex1000）中手动解剖和挑选神经玫瑰花结
，在解离后，将神经玫瑰花结束在NSC培养基中的新鲜聚 - 雌激素和层粘连蛋白涂层的菜肴中。2–5天后 ，出现了新的和较小的玫瑰花结（R1玫瑰花结）
，存在异质污染细胞 。然后将R1玫瑰花结进，将R1玫瑰花结菜 ，挑选并分离成较小的团块
，然后将其重新镀在新鲜的聚 - 雌激素和层粘连蛋白涂层的菜肴中
。在另外2-5天之后，出现了新的玫瑰花结（R2） ，具有最小的污染细胞。然后
，定期监测R2玫瑰花结，以鉴定出在神经玫瑰花结束外存在的一小组径向有组织的细胞 ，并代表独立的“克隆样种群 ”，即Icomonscs 。然后将这些小的ICOMONSC斑块手动采摘
，然后转移到新鲜的聚 - 雌激素和层粘连蛋白涂层的24孔板上
。使用0.05％胰蛋白酶（Gibco 15400-054在PBS中稀释的Gibco 15400-054）将表现出清晰径向和一致形态，良好的依恋 ，生存和增殖的克隆酶脱离
，并被1×定义的胰蛋白酶抑制剂阻塞 （GIBCO R-007-100）并扩展了许多段落，并在NSC冻结培养基（NSC培养基 + 10％DMSO（Sigma-Aldrich D2650））中进行了存储。进一步扩展到P9-13后 ，在细胞引导系统（根据Cellgs固定样品方案）准备了ICOMONSCS线进行核型检查 。在研究中使用了具有正常核型的ICOMONSCS克隆10/80
。可应要求提供ICOMONSC。 　　将ICOMONSC以每CM2的75,000个细胞在NSC培养基中的含量（Corning 354234; 〜0.15 mg Ml-1稀释在冷DMEM/F12 Gibco 11330032中稀释）
，并在37°C时至少1 h孵育​​1 h，在37°C）6孔板和左PLATE和均恢复和延伸 ，以恢复和延伸至95％ 。此时
，将NSC培养基切换为D3分化培养基（DMEM/F12（Gibco 11330032）； 0.5×B27+补充（Gibco 17504-044），1×N2补充剂（Gibco 17502-048）（Gibco 17502-048）; 1×Glutamax; 1×Glutamax（Gibco 35050-6550-661）；p4333-100ml））补充了5 µM forskolin（Cayman AG-CN2-0089-M050） ，1 µM合成性类维生素类EC23（AMSBIO AMS.SRP002-2）
，500 nm平滑性sag（Millipore 56666600），用于第一份为第一次5天。在第6-10天 ，EC23增加到2 µm
。在第11–25天，EC23降低至10 ng ml-1
，下垂至50 nm，BDNF（Peprotech 450-02） ，GDNF（Peprotech 450-10）和CNTF（Alomone Labs C-240）以20 ng ml-1添加。在第26天及以后
，培养基被切换到成熟培养基（1：1 dmem/f12：neurobasal（Gibco 21103049）混合物； 1×B27+补充剂，1×N2补充； 1.5×Glutamax ，5 µm Forskolin
，Bdnf，bdnf ，bdnf
，bdnf，gdnf ，gdnf
，cntf，cnt-nt-3（pecf ，ntrot，pec3（pepf
，pef，pec）（（干细胞78022）全部在20 ng ml-1和10 µm cAMP（Sigma-Aldrich D0260）下） 。每天更改培养基 ，几乎完全在0-10天进行了更改
，而从这一点开始，只有三分之二的培养基每周更改3次
。 　　对于所有实验（除了在原始6孔板中进行实验的SCRNA-SEQ除外） ，使用木瓜蛋白酶解离系统（Worthington LK003150）将年轻至中阶段的INET分离为单细胞悬浮液
，通过70-µm细胞过滤器（Falcon 07-201-431），通过MEDINERS（通过MEDERINATER）（通过MEDINDERIMATINE）（通过MEDINGINER）进行了培养基（Worthington LK003150）（Worthington lk003150） ，以进行培养基（Falcon 07-201-431）
，以进行预测培养基。（Falcon 352340）），并以Casy Cell Counter（Innovatis ag）计数的（Innovatis ag）计算 ，以每CM2约50万个细胞重新盘倒入相应的血管 。使用的96孔成像板：Greiner Bio-One 655090或Ibidi µ-Plate 96井黑色89626
。 　　用PBS洗涤INet
，并用含有0.35 M蔗糖pH 7.4
、10 mm 4-（2羟基乙基）-1-二帕皮齐亚硫代磺酸（HEPES; hepes; hepes; biosolve; biosolve; biosolve; biosolve; biosolve; biosolve; biosolve; biosolve; biosolve demiaminetetraetrraactrraactraecta）的SNS缓冲液刮掉并均质。Dithiothreitol（DTT； Thermofisher Scientific R0861），30 U ML-1 RNase抑制剂（Life Technologies N8080119）和完整的Mini EDTA免费蛋白酶抑制剂鸡尾酒（Roche 11836170001;至少2500 µL buffer ins full 6-fluffer pluffer pluffer pluffer pluffer pluffer pluffer pluffer pluffer pluffer plute ins ins ins ins ins ins ins ins ins ins ins inss;匀浆通过三个100 µm尼龙净过滤器（Millipore NY1H02500） ，然后是一个5 µm滤波器（Millipore SMWP013000） 。将最终的滤液重悬于3卷的无蔗糖的SNS缓冲液中，并以2,000克离心
，在4°C下持续15分钟，以产生含有SNSS的沉淀
。将沉淀重悬于100 µL的SNS缓冲液中 ，该缓冲液用于电子显微镜（60 µL）和Western blot分析（40 µL）。 　　使用雾化器HIFI DNA组装克隆试剂盒（NEB E5520; HIFI KIT）
，人类野生型，全长TDP-43 ，带有来自已发行的PCDNA5质粒的C端HA标签
，其中包含人类TDP-43 CDNA序列43 CDNA Sequence41,63的构建中的构建（基于我们的单位） 。Al
。37），以前已插入PLVX慢病毒转移载体（Clontech 632164） ，同时删除CMV-PGK-PURO
，产生MTRE-TDP-43 – HA慢病毒转移载体。mTRE cassette was build using both NEBuilder and Q5 site directed mutagenesis (NEB E0554S; Q5 kit) kits and consists of the Tet-responsive promoter Ptight, consisting of seven tet operator sequences followed by the minimal CMV promoter (sequence source pCW57.1; Addgene #41393), driving the inducible expression of the downstreamTDP-43–HA, followed by downstream IRES2 sequence (sequence source Addgene #60857), which is immediately followed by T7 tag fused to SV40 NLS, which was fused to rtTA-Advanced (sequence source Addgene #41393), which made the rtTA predominantly nuclear, making it readily available for the system, while the T7 tag made rtTA a useful, independent marker转基因细胞 。有关更多详细信息，请参见扩展数据图5A ，B。为了产生MTRE-GFP-FUS
，Hock等人的GFP-FUS序列
。通过HIFI试剂盒将27替换为MTRE-TDP-43 – HA。 　　然后，MTRE-TDP-43 – HA和所有其他慢病毒通过Lipofectamine 2000（Invitrogen 11668019; 8.3 µl最终体积）与CMV-GAG-POL（Harvard DR8.91）和PVSV-G-G-G-G-G-G-G-G-G-G-G-G-G-G-G-G-G-G-G-G-G-G-G-G-G-G-G-G-G-G-G-G-G-G-G-G-G-G-G-G-G-G-G-G-G-G-G-G-G-G-G-G-G-G-G-G-G-G-G-G-G-G-G-G-G-G-G-G-G-G-G-G-G-G-G-G-G-G-G-G-G-G-G-G-G-G-G-G-G-G-G-G-G-G-G-G（6331530（ATCC CRL-3216；来自Greber实验室的礼物）适应于无血清条件（OHN培养基；基于Opti-Mem（Thermofisher 11058-021）） ，补充了0.5％B27-（Thermofisher 12587-010），12587-010）
，0.5％N2（Thermofisher 17502020202020202020202020202020202020202020202020202020202020202020-100202020202020202020-100020202020202020-10002020-1050105020-1％ 。和BFGF（25 ng ml-1; Thermofisher phg0261）），这减少了转移载体中感兴趣基因的表达（即 ，它消除了FBS中四环素的痕迹）
，并消除了血清携带的含量，使血清携带到肺炎和慢病毒上
。第二天早晨更改培养基 ，然后在转染后48小时收集上清液（中等后变化后36小时）
，离心（500G，10分钟 ，4°C）
，通过Whatman 0.45 µm Ca Filter（GE 10462100）（GE 10462100）进行过滤，并使用Lenti-X浓度（takara 631232）（takara 631232）浓缩（根据生产生产量）。然后将所得的慢病毒颗粒重悬于完整的神经元成熟培养基中 ，以实现10倍浓缩的慢病毒制剂
，并使用Lenti-X Gostix Plus（Takara 631280）滴定 。对于图3b和扩展数据中的SCRNA-SEQ和免疫荧光图5f – i，随后在1,600 ng处使用10倍浓度的MTRE-TDP-43 – HA慢病毒（杀虫剂p24蛋白（GOSTIX值（GV）） ，每2个月均在2个月份的p24蛋白（GOSTIX值（GV））中，每3个月份的p24蛋白（GOSTIX值（GV））（均为2个月份）（均为2个月份）（（Sigma-Aldrich TR-1003-G）
，将慢病毒的移液器直接集中在培养物上（掉落）
。然后添加完整的神经元成熟培养基达到750 µL。对于所有其他实验，所有慢病毒均在500 ng（GV）ml-1的培养基中使用 ，在亚培养的6孔板中
，总计1,000 µl，在1,000 µl中使用 ， 350 µL在12个井板中
，80（Greiner）或110 µL（IBIDI），用于成像96孔板 。第二天完全交换了培养基
。对于MTRE矢量 ，在需要时通过1 µg ML-1的强力霉素（DOX； Clontech 631311）诱导TDP-43 – Ha或GFP-FUS表达。 　　为了产生表达shRNA的载体
，我们先前构建的pshe慢病毒转移矢量64是使用定向诱变试剂盒（Neb e0554s; q5 kit）修改的，将shRNA序列替换为nptx2或tardbp tardbp tardbp的shrnas（请参见补充sneblys sepry sepry kit serblys））（NEB E5520; HIFI KIT）用TDP-43 – HA代替EGFP序列（导致PSHTDP载体（用于NPTX2救援实验中） ，携带Hu6驱动的NPTX2（或NT）shRNA和可诱导的Mtre Mtre-tdp-43 – HaAg（或Halotors（in）（构成phss in in in in in in in in in n nptx2 recue实验）（用于TDP-43敲低实验）带有HU6驱动的TARDBP shRNA和诱导的mtre-Halotag） 。Similarly, pshTDP vectors for dual luminescence experiments were generated so that they carry hU6-driven endo-TARDBP shRNA (or NT control) and inducible mTRE-TDP-43–HA (with or without mutations in the RNA-recognition motif; shRNA-resistant (exploiting silent mutations present in our TDP-43–HA construct)). 　　为了产生慢病毒转移载体
，以用于TDP-43 – Ha（有或没有3'UTR），NPTX2 – HA和HA – FUS的本构EF-1α驱动的表达；首先 ，使用HIFI试剂盒，将来自Genscript的自定义合成序列的EF-1α启动子克隆到MtReauto-TDP-43 – HA载体取代TRE启动子中
，从而产生PLVX-1α-1α-TDP-43 – Ha vector
。然后将NPTX2 ORF（Origene SC122629）或野生型FUS27克隆到PLVX-EF-1α-TDP-43 – HA矢量中，代替TDP-43 – HA ，生成PLVX-1α-EF-1α-NPTX2 – HA和PLVX-HA和PLVX-EF-1α-1α-HA-HA-HA-HA-FUS VECTORS。 　　然后
，使用HIFI KIT直接下游至TDP-43 – HA，将全长的人tardbp 3'Utr（从HEK293T细胞中产生的cDNA）克隆 ，从而产生PLVX-1α-1α-1α-TDP-43 – Ha-3h-3h-3'Utr vector 。 　　在DMEM/F12（GIBCO 11330032）中培养SH-SY5Y人神经母细胞瘤细胞系（Sigma 94030304）
，并补充了1×谷胱甘肽（Gibco 35050-061），1×青霉素/链霉菌素（Sigma P43333333333-100ml）（Gibco 35050-061） ，1×Penicillycillin10270-106）。 　　将细胞（每孔200,000孔的6孔板）铺板
。第二天转导细胞
，每个慢病毒与花费培养基（500 ng（GV）ML -1，1 ml）混合。每个SHRNA编码慢病毒分别转导三口孔（每个目标2-4个shRNA序列或每个非目标shRNA的1-2个shRNA序列被测试；有关详细信息 ，请参见克隆） 。转导后的第二天
，将培养基在翻译后4天收集RIPA缓冲液（每孔500 µL），其中含有2片完整的EDTA免费蛋白酶抑制剂鸡尾酒（Roche 11873580001）和1片Phosstop（Roche 0490684500）Phosstop（ROCHE 0490684500）Per 20 ml lufferer
。 　　The in-house generated full-length human TARDBP 3′ UTR or human NPTX2 3′ UTR (Origene SC213552) were cloned into psiCHECK2-let-7 wild type (Addgene 78260), substituting the let-7 wild-type site (using HiFi Kit) to generate psiCHECK2 3′ UTR reporters used in the dual luminescence assay. 　　将HEK293T细胞以OHN培养基（上面的详细信息）的7,500个细胞将其镀入白色井/底部NUNC 96孔板（Thermo Scientific 136102）。第二天 ，将细胞用pshalo-shtdp-43（或nt shRNA）转导，用于TDP-43敲低
，或用MTRE-TDP-43 – HA（打开或关闭）的TDP-43过度表达或PSHTDP-SH-SH-SH-ENDO-TARDBP（或NT shrna），以使Enderenos wild-43和Permuent Enterenos Tdp-43和Pshtdp-sh-sh-endos tdp-43和pshtdp-shtdp-sh-sh-endy tdp-43 tddp-43 and-tdp-sh-sh-eNdos tdp-43TDP-43 – HA或RRMM TDP-43 – HA（请参见上面的向量详细信息） 。二十四个小时后 ，使用Lipofectamine 2000（Invitrogen 11668019; 0.5 µL每台孔）同时诱导MTRE驱动的TDP-43 – HA变种
，将其转染为20'psicheck 3'Utr pDNA报道器，使用Lipofectamine 2000（Invitrogen 11668019; 0.5 µL）转染
。第二天将培养基完全交换 ，并添加78 µL新鲜的OHN培养基（有或没有DOX）。最后
，第二天，根据制造商的说明 ，对所有条件均接受了裂解的双GLO荧光素酶测定系统（Promega E2920）
，使用Tecan Infinite M Plex读取器和Renilla：Firefly Pliffly Luminelcence读取发光 。 　　在PRISM（CA GraphPad San Diego，CA ，USA）中进行了统计分析
，每个慢病毒病毒不配对的t检验，并在数据集中应用3'UTR报告对
。 　　如上所述准备了SNS颗粒 ，并提交给UZH的成像设施（ZMB）。简而言之，将SNS颗粒重悬于2x固定剂中（5％戊二醛在0.2 m cacodylate缓冲液中）
，并在室温下固定30分钟 。然后将样品用0.1 M cacodylate缓冲液洗涤两次，然后嵌入2％琼脂Nobile
。在冰上用1％的osmium在冰上进行固定后 ，用DDH2O洗涤3次
，用70％乙醇脱水20分钟，然后在80％乙醇中脱水20分钟 ，100％
，持续30分钟，最后丙烯30分钟。丙烯：在室温下加入1：1时的Epon araldite在1：1中加入1小时 。然后在60°C下通过28 h孵育样品嵌入样品。然后 ，使用超大核组将所得的块切成60 nm的超薄截面
。然后将部分的丝带放在TEM网格上
，并在TEM-FEI CM100电子显微镜上成像。 　　用预热的16％无甲醇甲醛（Pierce 28908）直接进入培养基，将其固定在培养基中 ，稀释至最终的甲醛浓度4％
，并在室温下孵育15分钟 。然后将细胞用PBS（Gibco 10010015）洗涤一次10分钟，一次将PBS带有0.2％Triton X-100（Sigma T9284）洗涤缓冲液10分钟 ，然后用10％正常的驴血清（Sigma-Aldrich S30-M）和0.2％Triton X-100在PBS Bloffer Forter forserd sterip（Millip）中用10％正常的驴血清（Sigma-Aldrich S30-M）封闭
。温度。然后将原代抗体（补充表10）稀释在阻塞缓冲液中，并在轨道振荡器上在4°C下孵育过夜 。然后在室温下洗涤3×15分钟的3×15分钟
，然后将二级抗体（补充表10）稀释在阻塞缓冲液中，并在室温下孵育1.5小时
。然后在室温下用DAPI（Thermo Scientific 62248）在室温下在洗涤缓冲液中再次洗涤细胞3×15分钟 ，并在最终的洗涤缓冲液洗涤中稀释至1μgml -1。最终将细胞在室温下在PBS中洗涤1×15分钟
，然后将PBS添加到井中，以将染色的细胞存储在4°C 。 　　使用GE Incell Analyzer 2500 HS宽场显微镜（40倍空气目标； 2D获取；每个孔的182个视野； 50 µm分离以避免计数两次）或高含量扫描仪MD ImageXpress ht.ai（40×40×Water apo lwd lwd apo lwd apo lwd; 50482 2,02,044882,0448.2用于定量的像素；用于高功率 ，高分辨率显微镜的leica sp8 falcon倒置的Z步长（63×油目标； 2,096×2,096个像素
，以每只PIXEL 0.059 µm，大约20-30 Z-Steps sips side）和0.3 µm ，对于每个染色组合和所有成像条件
，激光和检测器设置保持相同
。然后，使用Huygens Professional（科学量成像）将堆栈（来自SP5和SP8共同焦点）进行反应 ，并在Fiji65中进一步加工了vol的图像
，以产生扁平化的2D图像（Z-PROVECTION）以进行数据可视化。将免疫荧光实验重复两倍，作为与生物独立样品的独立实验 。 　　为了定量Neun-和Ki67阳性细胞 ，使用Leica SP5与63倍油物镜（1,024×1,024像素的1.7×Zoom）倒置共共焦点，并对其进行计数并归一化至细胞总数（DAPI-PROSIDIST核的总数）
。 　　使用训练有素的Ilastik66算法进行宽场图像定量
，以分割TDP-43 – HA，TDP-43P403/404和DAPI染色的TDP-43 – HA的像素（正面与背景）。同样 ，对TDP-43 – HA
，NPTX2，MAP2和DAPI染色的ImageXpress获取的图像（Z-stacks的最大投影）进行了细分 。然后导出分段的图像（每通道 ，每条孔的182张图像或36张图像）
，并通过使用自定义宏通过批处理处理在fiji65中量化DAPI阳性核的总数（以及用于ImageXpress的MAP2+细胞），可应要求提供。手动计数TDP-43 – HA或TDP-43P403/404阳性神经元
。使用自定义细胞探测器（4.2.5）分割管道对在ImageXpress上获得的扁平Z-stacks上进行的定制细胞剖面（4.2.5）分割管道进行了用TRE或EF-1α启动子（有或没有3'UTR）表达的TDP-43 – HA的核强度测量。在数据集中应用了PRISM（GraphPad）和未配对的T检验 ，单向或双向ANOVA
，然后在Tukey的多方差分析中进行统计分析（有关详细信息，请参见图传说） 。 　　使用了修改后的sarkospin协议14,67
。在200 µL的细胞裂解缓冲液（0.5％sarkosyl（Sigma L5125-100G）+0.5 µl苯并酶（Millipore E1014-5KU）中收集INET和1×HSI缓冲液中的2 mM MGCl2DTT+2片完整的EDTA无蛋白酶抑制剂鸡尾酒（Roche 11873580001）和1片Phosstop（Roche 0490684500））。重悬的样品被转移到低蛋白结合的Eppendorf管中 。从获得的总细胞裂解物中 ，将30 µL用于总印迹
，将5 µL用于蛋白质定量，并通过Sarkospin进一步处理并通过Sarkospin进行了分析
。至170 µl剩余的细胞匀浆 ，178 µL 2×HSI，含4％sarkosyl和52 µL 1×HSI（以总计400 µL体积中获得2％的最终sarkosyl浓度）。将样品在37°C
，600 rpm孵育45分钟（Thermomixer，Eppendorf） ，在通过添加200 µL 1×HSI增加体积后
，将样品混合并在台式离心机（Eppendorf）上以21,200g的速度进行涡流，并以21,200G的速度（Eppendorf）进行30分钟的室温 。将上清液（〜450 µL）转移到新的管中 ，并小心地移除其余的上清液
，以使颗粒完全干燥
。然后将后者重悬于80 µL的0.5％sarkosyl 1×HSI中，并通过免疫印迹分析如下所述。Sarkospin使用生物学独立的样品独立进行了两次 。 　　对于总细胞裂解物（SH-SY5Y和INET）和SNS颗粒（INETS）的裂解物 ，使用Pierce 660 nm蛋白质测定试剂（22660
，所有来自热泡的试剂，除非另有说明）和5-10和20 µg（全部裂解物和SNS pelyote con perein perein perein protine protine） ，对蛋白质浓度进行调整
。Samples were resuspended in final 1× LDS loading buffer (NP0007) with 1× final Bolt sample reducing agent (B0009), denatured at 70 °C for 10 min, and loaded on Bolt 12% (SNS) or 4–12% (total and SarkoSpin iNets fractions) Bis-Tris gels (NW04122BOX, NW04127BOX,NW00122Box
，NW00125Box）使用螺栓MES运行缓冲液（B0002）和螺栓抗氧化剂（BT0005），并在115 V处运行。凝胶使用IBLOT 2转移NC堆栈（IB23001）和IBLOT 2 Dry -Prottting System（使用IB23001）转移到硝基纤维素膜上 ，使用IBLOT 2转移（IB23001）（使用IB23001） 。然后将膜用5％w/v非脂肪脱脂粉中的0.05％v/v tween-20（Sigma p1379）在PBS（牛奶PBST）中被阻塞，并用一夜抗体（补充表10）在PBST中用1％W/V牛奶清洗的PBST
，将其用pbST换成pbST，并在pbST中均使用pbST ，并用pbST进行了二次
，又有二次Incug incug incug incug incug incibies（补充表10），并用pbSt sycepry incunies（均为scond）（1％牛奶PBST。在PBST进行了三次洗涤后 ，使用Supersignal West Pico或Femto化学发光底物（Piercenet 34077
，34096）在Amersham Imager 600RGB（GE Healthcare Life Sciences 29083467）或FXENCES上，通过化学发光（Piercenet 34077 ，34096）通过化学发光可视化免疫反应性
。使用生物学独立的样品对Sarkospin Western印迹进行了两次独立进行。在补充图2中
，可以在主要数据和扩展数据数字中显示的所有未编写的蛋白质印迹图像 。4和5
。 　　根据制造商的说明，在500 µm库存溶液中制备的Ca2+/mg2+在HBS中施加了5 µM溶液 ，将INET施加在俄勒冈绿色BAPTA-168的AM酯形式的推注。不久
，将已经分化12周的INET用预热的HBSS短暂洗涤两次，然后加入5 µm的俄勒冈州绿色BAPTA-1溶液 ，并在37°C下孵育1小时 。然后将细胞用预热的HBS短暂洗涤两次，然后在成像之前在室温下稳定30分钟
。两光子钙成像是在带有Ti的科学高度镜上进行的：蓝宝石激光器（相干； 〜120 FS激光脉冲）调谐到840 nm。用16倍水浸泡物镜（Nikon
，NA 0.8）收集256×256像素的荧光图像 。数据采集​​是通过扫描图进行的
。 　　使用ImageJ和MATLAB中的自定义编写例程导入和分析钙成像数据，可应要求提供。首先 ，将给定区域的荧光图像时间序列串联 。然后使用涡轮增压对串联成像数据对齐以校正小X – y漂移（OGB-1图像序列的对齐
，NIH ImageJ；基于Thévenaz等人70）
。下一步，将背景作为整个图像的底部第一百分位荧光信号减去。成像数据的平均强度投影用作与单个神经元相对应的感兴趣区域（ROI）的参考图像 。钙信号表示为给定ROI中相对荧光变化的平均像素值ΔF/f =（f - f0）/f0。F0计算为荧光迹线的最低百分点
。 　　使用HEKA EPC10/2 USB放大器（HEKA ELEKTRONIK）在Slicescope 2000显微镜（Scientifica）上进行贴片钳录制。数据以10 kHz的速度进行低通滤波 ，并在200 kHz下进行采样 。使用P-97 Puller（Sutter Instruments）从硼硅酸盐玻璃（科学产品）中拉出斑块移液器
。当充满含有（以mm）的细胞内溶液（葡萄糖酸钾150
，NaCl 10，HEPES 10 ，HEPES 10
，ATP 3，ATP 3 ，ATP 3
，钠GTP 0.3，钠GTP 0.3 ，BAPTA 0.2）时，移液尖端电阻为4-8MΩ。校正了+13 mV的液体连接电位 。细胞外溶液包含（以毫米为单位）：NaCl 135
，HEPES 10，葡萄糖10 ，Kcl 5
，CaCl2 2，MGCL2 1
。串联电阻在7-22MΩ之间 ，并以10 µs滞后在线补偿50-80％。所有记录均在室温（23–25°C）下进行 。建立整个细胞构型后
，在电流夹中测量静息膜电位
。为了检查动作电势射击和膜特性，从大约-80 mV的保持电压（通过滋补电流注射实现）中应用了具有增加幅度的电流注射方案（持续时间为500 ms；步骤 ，±10 pa）。从稳态电压挠度通过超极化电流注射引起的稳态电压挠度计算了输入电阻 。膜时间常数是从指数拟合到电压衰减的
。 　　为了记录电压依赖性离子电流
，将电压夹紧以–80 mV为单位。从–80 mV到+40 mV的100 ms电压步骤以10 mV为单位引起电流，并使用P/5方法校正了泄漏和电容电流 。为了分析电流 ，如果剩余的串联电阻为<10MΩ
，则包括细胞。使用Igor Pro（WAVEMERTIC）中的自定义编写例程分析数据，可应要求提供
。 　　基于CMOS的HD-MEAS30用于记录ICOMONSC衍生的人类神经网络的细胞外动作电位。HD-MEA具有26,400个电极 ，在3.85×2.10 mm2的总感应区域内以120×220网格组织 。电极面积为9.3×5.45 µm2，中心到中心的电极距离（螺距）为17.5 µm
，可以在亚细胞分辨率下记录细胞电活动
。可以同时从用户选择的配置中同时记录1,024个电极。HD-MEA在0.3-10 kHz的动作电势频带中具有2.4 µVRM的噪声值，可编程增益高达78 dB 。采样频率为20 kHz
。 　　记录设置放置在37°C下的5％CO2细胞培养培养箱中。如前所述32 ，使用MaxLab Live软件（Maxwell Biosystems）中的“活动扫描测定
”和“网络测定”模块进行了录音 。使用6,600个电极在7个电极构型中使用6,600个电极记录整个HD-MEA的自发神经元活性
，持续120秒
。然后使用最“活跃 ”的1,024个电极记录网络电活动300秒。根据其发射速率确定活性电极，其中选择了具有最高点火率的1,024个电极 。 　　我们使用的指标与Ronchi等人中描述的指标相似
。32表征和比较神经元文化；我们使用了网络 ，单细胞和亚细胞分辨率指标。作为网络指标（扩展数据图3C）
，我们使用了爆发持续时间（BD），爆发间隔（IBI） ，爆发间隔间隔系数（IBI CV）32 。作为单细胞指标（扩展数据图3D）
，我们使用了平均点火率（MFR），平均尖峰振幅（MSA）和尖峰间间隔变化系数（ISI CV）32。此外 ，我们包括以下细胞外波形指标（扩展数据图3E）
，该指标从SpikeInterface33中提取，这是一个基于开源Python的框架 ，以包含所有Spike分类步骤： 　　作为亚细胞分辨率指标，我们提取了动作电位传播速度32（VEL）和轴突分支长度（BL）
。 　　还计算了活性电极（AE）的百分比
，以测量可以检测动作电位的电极的总数32。 　　使用MATLAB R2021A和Python 3.6.10中的自定义代码进行数据分析，可应要求提供 。 　　进行尖峰排序以识别细胞外记录中的单个单元
。我们在SpikeInterface33框架和相应的默认参数中使用了Kilosort271软件。我们使用以下参数自动策划了尖峰排序输出： 　　使用Kruskal -Wallis H检验进行了比较两个以上人群的样本的统计比较 。如果否定假设被拒绝 ，我们进行了sidák校正后的事后邓恩测试以进行多次比较（dunn –sidák多重比较测试）
。 　　统计分析在MATLAB R2021A中进行。 　　在70％乙醇中对HD-裂解进行40分钟的灭菌 。用无菌去离子水（DH2O）洗涤HD-meas三次
，然后干燥
。灭菌后，将HD--液浸入20 µL聚赖氨酸溶液（P6407 ，Sigma-Aldrich）中（在DH2O中稀释至50 mg ml-1）
，在室温下1小时，以使地表变得更加水性；然后用无菌DH2O洗涤每个HD-MEA三次并干燥。此后 ，将HD-meAs与10 µL Matrigel（354234
，Corning）涂覆，先前以1:10的比例稀释在镀层培养基（见下文）中 ，并在37°C下孵育2小时 。在1.5、3和7.5个月大时分离的INET在188G下离心5分钟
，吸气上清液，并将镀层培养基添加到细胞颗粒中以达到所需的细胞密度（每HD-MEA 200,000个细胞）
。将基质凝胶从HD-MEAS上吸出 ，并将细胞在HD-MEAS上的10 µL下降中铺板。在37°C下孵育2小时后，加入培养基（0.9 mL） 。一天电镀后
，将50％的电镀培养基交换，随后每周两次。镀层和培养基几乎与成熟培养基相同 ，除了它使用脑细胞（05790
，干细胞技术）作为基础培养基，并进一步补充了1％青霉素/链霉素/链霉素（p4333-100ml ，Sigma-Aldrich）
，以对培养文化培养物的培养物进行定期移动的细胞，从而为细胞提供保护
。 　　由小鼠胚胎（E16/17）制备原发性神经元细胞培养物。所有动物实验 ，包括小鼠外壳和育种
，都是根据瑞士动物福利法进行的，并符合苏黎世州兽医办公室的规定（当前已批准的许可证ZH169/2022 ，有效期为16.02.2026） 。怀孕的C57BL/6女性在怀孕的第12天从Janvier Labs（法国）分娩
，并按照瑞士动物福利法所容纳，并符合苏黎世Lasc Irchel的苏黎世副兽医办公室的规定
。详细说明 ，将小鼠放在IVC 2型长（T2L）笼子中，其富含环境由床上用品
，红色小鼠房屋，纸巾和皱纹组成（盘状纸）。室温在21°C和24°C之间 ，湿度水平在35％至70％之间 。使用了12小时的光/12小时的黑暗周期
。在提取胚胎之前
，用二氧化碳在家里笼子里对怀孕的女性进行了安乐死。二氧化碳安乐死之所以选择其他方法，是因为它被认为是快速 ，非常成功
，安全且易于操作员，在我们的情况下 ，它与下游实验程序兼容（没有对任何感兴趣的机器人构成物理损害） 。然后
，使用剪刀通过斩首提取和安乐死，这被认为是胎儿最快 ，最有效的方法
。每个垃圾使用了五个胚胎。将海马从每个胚胎的大脑的冰上分离出来
，将其聚集在一起，并用胰蛋白酶消化（（（（Gibco 15400-054）0.5％W/V ，补充了4％W/V -glucose（Sigma g8769））在37°摄氏度下15分钟 。消化后，用马血清（Sigma H1138）将胰蛋白酶淬灭
，并手动解散组织，直到不再可见团块为止
。细胞在120克旋转5分钟 ，并在神经培养基中（Gibco 21103049）中的聚赖氨酸（Sigma p6407）涂层玻璃底部8孔 - IBIDI腔室载玻片（80807;每个实验条件4井）中镀上 补充了谷氨酸（Thermofisher 35050061）
，2％B27+补充剂（Gibco 17504-044），100 U Penicillin-streptomycin（Sigma p4333-100ml）和4％W/V-Glucose（Sigma G8769）。为了传递原发性神经元培养物 ，使用TDP-43 – HA或GFP – FUS慢病毒载体载体
，在每毫升的每毫升支出培养基中以500 ng（GV）为500 ng（GV），在DIV 11的总共100 µL ，培养基在第二天（Div 12）完全交换（Div 12）
，并补充了1 µg ml-clont-ml-13131313131131313131131311313131311313113313113131311313131131313113131311313131131113111131311113311的clontech（clontech）clontech（clontech） 。转基因。细胞固定在DIV 17
。 　　通常，使用EZ PCR支原体检测试剂盒（Sartorius 20-700-20） ，常规检查了研究中使用的所有循环细胞是否可能进行支原体污染。偶尔检查年轻的INET（带有一些残留的Ki67+细胞） 。未检测到支原体污染
。 　　使用福尔马林固定
，石蜡包裹的海马，正面或原发性运动皮层患者（ALS ，FTLD-TDP-A，FTLD-TDP-C
，FTLD-TDP-C，FTLD-FUS ，FTLD-TAU
，FTLD-TAU，ALZHEEIMER病）（请参见补充表9）。通过全面的知情同意 ，将所有FTLD和阿尔茨海默氏病组织样本捐赠给UCL皇后广场神经病学研究所的女王方形脑库
，用于神经系统疾病 。UZH神经病理研究所收集了匿名尸检样品
。根据瑞士法律，匿名尸检组织不属于人类研究法的范围 ，并且可以用于研究中。将切片在三个二甲苯圆圈中脱蜡（每个5分钟）
，并在减少乙醇洗涤液中（2×100％持续10分钟； 95％的2×100％；在95％中2×，持续5分钟； 80 、70％和50％ ，每个5分钟）
，最后在Milliq水中浸入10分钟 。然后通过微波热处理在柠檬酸钠缓冲液（0.01 m，pH 6.0）中进行抗原检索
。Sections were then cooled down on ice for 10 min and once quickly washed in PBS, followed by 3x PBS washes for 5 min at room temperature before blocking with blocking buffer (5% normal donkey serum (Sigma-Aldrich S30-M), 3% BSA (Sigma A4503) and 0.25% Triton X-100 (Sigma T9284) in PBS) for 30 min at room temperature.然后将原代抗体（补充表10）稀释在阻塞缓冲液中 ，并且每个载玻片/截面均匀地放入300 µL抗体混合物。将载玻片放入潮湿和深色的孵化室中，并在室温下孵育过夜 。将载玻片在PBS中冲洗一次
，然后在PBS上的PBS上洗涤3×5分钟
。二级抗体（补充表10）在阻塞缓冲液中稀释，在室温下以15,000克离心30分钟 ，每片/截面均匀地放入500 µL抗体混合物
，并将其放入孵化室中以在室温下孵育2.5 h。然后将载玻片在PBS中冲洗一次，在PBS上在PBS上洗涤1×5分钟 ，以染色核（DNA）
，500 µL DAPI溶液 （Thermo Scientific 62248；在PBS中稀释至1μgml -1）均匀地添加到载玻片/截面上，并在孵化室的室温下孵育10分钟 。将载玻片冲洗一次 ，在PBS中冲洗一次
，在PBS上在PBS上洗涤2×5分钟，其次是Sudan Black（70％乙醇中的0.2％； Sigma 199664）自动荧光淬火10分钟 ，在室温下在振荡器上。将载玻片在PBS中冲洗6次
，然后在PBS中洗涤，直到安装直至盖上覆盖在延长的钻石抗Fifade Mountant（Thermofisher P36961）中 ，然后在黑暗中的室温下在化学柜中干燥
。在黑暗中将安装的部分存储在4°C。 　　使用Leica SP8 Falcon倒置的共同体对染色的患者脑切片进行成像，以进行高功率
，高分辨率显微镜（63×油的目标； 1.7或3×Zoom； 2,096×2,096像素，以0.059 µm或0.059 µm或1,848×1,848×1,848 Pixel At 0.059 µm ，均为0.059 µm每个堆栈在0.3 µm处） 。对于每个染色组合和所有成像条件
，白色激光和HYD探测器设置保持相同
。Huygens Professional（科学体积成像）用于叠加堆栈，并在FIJI65中进一步进行了反复处理 ，以产生用于数据可视化的3D投影（3D投影的第一个图像显示在图中）。所有捐赠者的所有图像的后处理设置都保持相同（除了使用较高的亮度设置以达到允许正确可视化的强度时
，除了DAPI和MAP2通道以外，除了DAPI和MAP2通道外） 。 　　重复的（TDP-43 – HA OFF和TDP-43 – HA 2周）的INET（年轻（1.5个月） ，中期（3个月）
，（3个月）和旧（7.5个月）和TDP-43 – HA3 – TDP-43 – HAH实验样本中间阶段，使用Papain Opciatiation Quriners（Worthers Optiriation-70-70-wertim-weartim and Weartim and primenter）将其分解为Worther Sypersion（Worthington lkiriation-70-70） ，并将其分解为Worthington Lk003150
，（Falcon 07-201-431和07-201-430），并在Hib ++培养基（Hibernate-e Mediup（Gibco a1247601）中恢复为EDTA（1 mm Final; Invitrogen; Invitrogen; Invitrogen AM9260G） ，Hepes（10 mm Final; Gibco 15633333330080），+ 1 mm9260g）17504-044）
，1×N2补充（Gibco 17502-048）;（干细胞78022）全部使用Casy Cell Counter（Innovatis），在20 ng ml -1）每µL 1,000个细胞
。 　　使用LEICA DM IL LED显微镜中的血细胞计评估单细胞制剂的质量和浓度 ，并调整为每µL 1,000个细胞。每个样品中的每样品中有一万个细胞被加载到10倍铬控制器中
，并根据制造商的指示（铬下一个GEM单细胞3'试剂盒v3.1协议）进行库制备 。根据10倍基因组学建议（配对 - 末端读数，r1 = 26 ，i7 = 10
，r2 = 90）在Illumina Novaseq Sequencer中测序所得的库，以每个单元格的深度约为50,000个读取
。测序是在功能基因组中心苏黎世（FGCZ）进行的。 　　用Cellranger处理数据以进行反复插曲 ，读取与人参考基因组（GRCH38）的比对
，并过滤以每样本样品生成特征 - 键盘矩阵 。用SCDBLFINDER72除去细胞双线，并检测到异常值并用Scater R Package73过滤
。简而言之 ，远离UMI的中位数
，特征的数量和线粒体基因的百分比被删除了超过3个中位数脱水的细胞。对于7.5个月大的样品，我们还提供了少于2,000 UMI的过滤细胞 ，少于1,500个检测到的特征 。对于TDP-43的过表达实验，我们还额外过滤的细胞少于5,000 UMIS
，少于2500个检测到的特征。 　　Seurat V374用于对数差异化，并确定每个样品的前2,000个高度可变的基因
。louvain聚类始终基于从前20个主要组件构建的共享最接近的邻居图 ，以0.4的分辨率进行。UMAP75细胞嵌入是根据前20个主要成分计算的 。使用SEURAT估算细胞周期评分
，使用Kowalczyk等人的G2/M和S相标记列表
。76。 　　与其他任何集群相比，在一个集群中上调的标记基因与SCRAN R PAKCE77的Findmarkers函数相比 ，该函数运行成对t检验
，并将结果结合到每个群集的标记列表中 。用标记基因表达的热图显示每个群集中所有细胞的平均对数计数
。群集12（TDP-43-HA过表达实验）用相同的方法与其他神经元簇（0
、2至5、7至11）进行了介绍。我们注意到，将SCRNA-seq数据聚类后 ，然后寻找群集之间的差异两次使用相同的数据（即
，“双浸
”）78 。我们提供了差分表达统计信息的排名列表，以帮助聚类解释 ，但我们知道在这种情况下很难解释P值
。 　　使用规范相关分析将两个ICOMONSC样品与Seurat集成
，将数据缩放，UMIS的数量和线粒体UMIS的百分比在聚类之前退化。 　　从ArrayExpress（登录号E-MTAB-8379）下载了来自三个不同NSC线条的SCRNA-SEQ数据 ，并使用Seurat与我们的ICOMONSC数据集成；将数据缩放，并在聚类之前集成了UMIS的数量 。 　　从ArrayExpress（登录号E-MTAB-7552）下载了人体器官（409B2和H9）SCRNA-SEQ DATA8
。使用seurat的细胞和来自人类脑器官的细胞的数据和INET的数据（1.5 、3和7.5个月大）的数据与缩小和UMIS的数量以及线粒体UMIS的百分比集成在一起。使用k = 500个邻居和10个维度在主成分分析空间中
，用平滑的CMS混合度量评估了批处理效应 。 　　在TDP-43过表达实验的四个样本中，我们量化了TDP-43-HA构建成分的表达 ，包括TDP-43 – HA
，长时间重复序列和RTTA，以及使用Cellranger的内源性TARDBP。计数被添加到整个转录组CellRanger输出中的过滤数据中
。群集12和所有其他神经元簇之间的TDP-43 log2折叠变化是使用SCRAN Findmarkers的summary.logfc度量计算的。 　　使用MonoCle3 V1.0.081 ，commit 004C09682进行伪段分析
，将带有注释的NSC群集中的轨迹扎根 。 　　为了评估独立INET的可复制性，我们重复了TDP-43过表达实验细胞及其聚类和聚类注释（仅TDP-43 – HA OFF） ，并使用其规范基因（即TDP-43 – HA）中的时间序列（中阶段）中的细胞（中间阶段）
。我们在不集成两个数据集的情况下运行与上述相同的下游分析（前2,000个高度可变基因
，20个主要成分，UMAP细胞嵌入）。我们独立运行Metaneighbor V1.8.083 ，使用上述关节TDP-43 – HAW OFF和TIME TIME MISTER序列中阶段细胞中使用带注释的簇（至少有10个细胞）在实验之间测量细胞类型的复制 。我们报告了接收器操作特性（AUROC）值配对簇下的Metaneighbor区域
。这些AUROC分数可以读取为概率。1的AUROC描绘了一个完美的群集：群集匹配（因此两个簇由同一单元格类型的单元组成）
，0.5的AUROC与随机（两个群集不太可能属于同一单元格类型）一样好，并且AUROC为0的AUROC可以读取为强的非鼠标（因此两个插图都不是相同的单元格类型） 。 　　用SHRNA转导12孔板中的中阶段INET ，以将TDP-43（或对照shRNA）或过表达TDP-43 – HA（或非诱导的对照；请参见“慢病毒制剂”），每个条件4重复（单独转导的井）
。两周后
，根据制造商的说明，使用RNeasy Plus迷你试剂盒（Qiagen 74134）提取RNA并分离RNA ，并通过无RNase无RNase DNase Set（QIAGEN 79254）进行了额外的DNA消化步骤。RNA QC由RNA屏幕板进行
，表明样品的RINE值在9.1-9.8的范围内 。Novaseq 6000（Illumina）用于根据标准协议进行群集生成和测序
。测序配置配对150 bp，1.5亿读深度。 　　原始读取使用Armor84处理 。简而言之 ，与鲑鱼V1.4.0和Star 2.7.7a的读数对齐并计入人类基因组（GRCH38组装和Gencode 43）。我们用准可能性（QL）负二项式对数线性模型对鲑鱼生成的计数数据进行了建模
，并使用EDGER v3.36.0进行了差异表达分析
。 　　我们从GSE27201 Polymenidou 20111年（包括SRR107031和SRR107032）重新收集了来自GSE27201 Polymenidou 201111（鼠标）的剪辑数据；从E-MTAB-530 TOLLERVEY 201113（人）加入ERR039847，ERR039848 ，ERR039843
，ERR039843，ERR039842 ，ERR039844
，ERR039844，ERR039845 ，ERR039845，ERR039846
，带有NF核/Clipseq Workflow v1.085和Grrc paramny 38和Grrc paramn85和Grrc paramners and Grryahn and Grerner Grryaht and Grerge 38基因组，适当。Polymenidou 20111111111111111111111111111111111111111111111使用Kent Utils V39086的升降机从GRCM38转换为GRCH38坐标 。 　　从ArrayExpress（E-MTAB-530）87下载了TDP-43人脑ICLIP13（三个对照和三名FTLD患者）的FASTQ文件
。使用GRCH38参考基因组和NF核/clipseq85对数据进行了重新分析 ，以预处理
，映射和交联位点识别。同样，从GSE27201中检索了TDP-43夹的FASTQ文件 ，并使用NF核/clipseq和GRCM38基因组处理 。源代码可从https://doi.org/10.5281/zenodo.8142336获得
。 　　我们从GEO登录GSE126542下载了RNA-Seq基因计数表作为补充数据文件（GSE126542_NEURONALNUCLEI_RNASEQ_COUNTS.TXT.GZ）。使用Quasi-likelihood框架89（经验贝叶斯Quasi-likelihood ftest）
，在R版本4.0.5中进行了TDP-43阴性和正核之间的差异基因表达分析 。报告的错误发现率（FDR）值使用Benjamini – Hochberg方法调整了多次比较
。源代码可从https://doi.org/10.5281/zenodo.8142336获得。 　　人类参考基因组（GRCH38）和注释（版本108）是从Ensembl90获得的 。使用CASADAPT（版本4.1）从RNA -seq读取中删除Illumina Trueseq适配器，其中包括参数-Q 25 -m 2591
。使用Star Aligner（2.7.10b版本）（默认参数）将处理后的读取映射到参考基因组（版本2.7.10b）92。随后 ，使用rmats（版本4.1.2）在事件级别进行差异剪接分析
，并使用参数-t配对-ReadLength 100 -variable-variable-read-read-lengthn93 。通过FDR <0.05和15％的InclevelDifference的绝对值变化，并与人类跳过的外显子DataSet43相交 ，以检查我们数据集中的潜在跳过外显子
，从而定义了显着的差异事件。使用r94中的图片软件包（v2.0.0）处理结果
。 　　该研究中使用的细胞系（SH-SY5Y SIGMA 94030304和HEK293T ATCC CRL-3216）在研究中使用了针对交叉污染或错误识别的细胞系（https://iclac.org/databases/cross-contaminations/）。未识别跨污染或错误识别的细胞系 。本研究中使用的其他细胞是对照人类早期新生儿皮肤成纤维细胞（Gibco C0045C） - 本文中用于生成IPS细胞，ICOMONSC和INET的源细胞；和原发性小鼠海马神经元
。 　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得。