OCA2CREER敲入线是按照建立良好的协议生成的，并进行了轻微的修改52,53。OCA2Creer靶向DNA是由VectorBuilder在扩展数据中构建的 。靶向载体的纯化质粒DNA使用限制酶Noti和sali进行胚胎茎（ES）细胞靶向
。小鼠MK6（C57BL/6J）ES细胞（在纽约大学（NYU）Langone的啮齿动物基因工程实验室建立） ，在通过有丝分裂的小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）细胞（Sigma Millipore）上种植
，并在第6通道上种植，并在电气播放之前传递。将含有新霉素耐药基因的靶向载体DNA（25μgmL– 1）添加到细胞悬浮液中 ，并使用基因脉冲杆II或基因脉冲体系统（Bio-Rad）进行电穿孔 。电穿孔后，将细胞铺在耐新霉素的MEF上
，并在37°C，95％的湿度和5％CO2下孵育。24小时后 ，将遗传素（160μgml-1活性浓度
，Invitrogen）添加到生长培养基中，以阳性选择抗生素耐药的ES细胞菌落
。每天更改培养基 ，并将遗传素（G418）选择保持6天。对抗生素耐药的ES细胞菌落进行计数
，采摘和分裂以在复制的96孔板中生长进行冷冻保存，并通过Southern印迹分析通过基因分型来确定同源重组事件 。使用前 ，对小鼠MK6 ES细胞和MEF进行了支原体污染测试
，未经认证
。 　　将成功同源重组的ES细胞注入小鼠胚泡胚胎中。将ES细胞胰蛋白酶细胞获得单细胞悬浮液，并将细胞悬浮液保存在15 mL管中的1 mL ES细胞培养基中 ，直到使用 。在涂层后3.5天
，从C57BL/6-Albino雌性（4周大，NIH 562 ，CRL）收集胚泡胚胎
。将十到15个ES细胞注入每个胚泡胚胎中，并在5％CO2的大气中在37°C的KSOM培养基中培养注射后的胚泡2小时
，直到恢复胚泡腔。使用标准程序以产生嵌合小鼠，将显微注射的胚泡转移到胶孕后雌性2.5天的子宫角（CD-1 ，CRL） 。用C57BL/6饲养嵌合小鼠以获得OCA2CREERT2小鼠
。 　　所有动物实验均符合所有有关动物测试和研究的相关道德法规
，并根据纽约大学医学院机构动物护理和使用委员会批准的动物方案进行。小鼠被安置在温度范围为20–22°C的动物室中，湿度范围为30-70％ ，深度为12-12 h的深光周期 。 　　Tyrcreer（012328）
，rosalsl-tdtomato（007905），Wnt1CRE ，K15CREPR1（005249）
，WLSFL/FL/FL（012888）和K14RTTA（008099）小鼠从Jackson实验室购买
。DCTRTTA; TETOH2B-GFP（IDCT-GFP）小鼠是从NCI小鼠存储库中获得的。Dctlacz小鼠来自P. Overbeek 。CTNNB1FL（EX3）/+（CTNNB1STA）小鼠来自M. M. taketo43。将小鼠育成并内部越过，以在混合背景下获得实验和对照动物
。从两性随机选择实验组和对照组的小鼠进行实验。数据收集和分析没有对实验条件视而不见 。 　　为了诱导CRE重组 ，腹膜内注射（0.1 mg g – 1体重）每天在玉米油中使用20 mg ML – 1溶液进行了他莫昔芬（Sigma-Aldrich）处理7
。对于UVB实验
，将3周大的OCA2CREER; rosalsl-tdtomato小鼠的背部毛皮剪切，并麻醉小鼠。每隔一天用每天600 MJ CM – 2 UVB治疗每天3次 。皮肤活检是从安乐死的小鼠或异氟烷麻醉下取走的
。为了隔离MCSC和分化的灯泡MC ，dctrtta; tetOH2b-GFP小鼠被施用，在对小鼠进行细胞分离之前
，将含多西环素的Chow（1 g kg-1，生物液）持续4天。在C-KIT抗体注射实验中 ，将小鼠皮下注入150 µL 0.5 mg ML – 1 C-KIT抗体（ACK45
，BD Pharmingen）中的小鼠中2×2cm的背部皮肤 。对照小鼠皮下注入150 µL PBS
。 　　黑素细胞干细胞的体内成像基于先前描述的HF干细胞实时成像方法54,55。在P21上给出了Pyncreer; rosalsl-tdtomato; k14rtta; tetOH2B-GFP小鼠单张tamoxifen，并在P21的1 g kg – kg – 1强度二循环饮食上保持 。他莫昔芬诱导至少3天进行所有体内成像
。由于单个小鼠和单个HF之间的头发周期的时机略有变化 ，因此我们一直对鼠标进行成像以监视头发周期阶段。通过观察GFP标记的HF上皮细胞的模式
，根据先前的出版物56确定HF阶段 。我们在Telogen/Anagen I上进行了初始成像，以捕获仅包含单个TDTOMATO标记的细胞的HFS。为了追踪HG黑色素细胞的命运 ，我们专注于HFS在HG中包含单个TDTOMATO+黑色素细胞
，并每1-4天重新审视相同的HFS，以捕获头发周期阶段 ，包括早期的Anagen
，中/晚期Anagen，中期Anagen ，早期至中期（早期/中期）Catagen，catagen
，catagen，catagen和Sectent（第二）
。一些小鼠的重新审查较少 ，以专注于捕获中晚/晚期Anagen和随后的端机。为了追踪Bulge MCSC的命运
，我们最初访问了在Telogen的凸起中包含单个TDTOMATO+ MCSC的HFS，并重新访问了相同的HFS直到Anagen中期 。 　　为了追踪早期 - 阿纳根HF室中的黑素细胞的命运 ，我们将Oca2Creer; rosalsl-tdtomato; k14ktta; tetoh2b-gfp小鼠;当HF阶段发展为Anagen I/早期Anagen II时
，给小鼠单张注射1.2 mg他莫昔芬
。然后，我们在Anagen II/Anagen IIIA（他莫昔芬注射后至少3天）进行了初始成像 ，以捕获仅包含单个TDTOMATO标记的细胞的HF
，该细胞位于Hg的最低部分。在Anagen和Telogen晚期和晚期重新审视了同样的HFS 。 　　在整个成像过程中，小鼠在变暖垫上 ，并用通过鼻锥传递的蒸发异氟烷（1.5％的氧气和空气）进行麻醉
。耳朵在定制的舞台上被固定
，并直接将玻璃盖玻片放在其上。配备Maitai HP DS-OL激光调谐到940 nm的Olympus Fluoview Multiphoton显微镜（FVMPE-RS），并在1,120 nm（Newport Spectraphysics）中调谐到940 nm ，并在线条顺序模式下使用X3-OL调整为1,120 nm（Newport Spectraphysics） 。 　　为了确保成功重新审视相同的HF，将HF簇和血管位置的模式用作地标
。首先使用耳朵的血管位置大致返回同一区域。然后
，在初次访问和重新访问期间，使用多个瓷砖图像（最高30）记录了大面积的HF簇图案 ，Z-stack步骤为20–30 µm 。成像区域中的HFS并没有均匀分布
，而是显示出不同的聚类模式
。群集通常包含三到十个HF，在不同的簇之间有间隙。通过编号簇并使用瓷砖地图找到相同的簇 ，我们经常重新审视相同的群集 。由于用于实现MCSC的克隆标记的他莫昔芬的浓度低
，因此只有一个群集中的HFS子集包含任何TDTomato标记的细胞。我们验证了在一个集群中，包含TDTomato标记的单元格的HF的数量和模式与先前访问到特定的HF匹配
。 　　X-Gal染色如前所述38。收集来自DCTLACZ小鼠的背皮 ，并使用手术刀叶片（MILTEX）去除皮下脂肪 。在4°C下将组织固定在4％多聚甲醛（PFA）中30分钟
，并进行整个安装X-GAL染色
。X-Gal染色后，在4°C的4％PFA中再次将皮肤样品固定过夜。然后对组织进行3D整体分析 。 　　3D全安装生态位分析是按照先前发布的38进行的
。将DCTLACZ小鼠的全皮肤样品用X-GAL染色 ，并在室温下或在4°C下依次用25％甘油– PBS
，50％甘油– PBS和100％甘油染色3小时。然后使用手术刀刀片将皮肤切成细条 。然后使用解剖显微镜解剖并分离单个HF（Axiovision Discovery V12）
。 　　OCA2CREER;玫瑰色-Tomato小鼠，暴君； rosalsl-Tomato小鼠和DCTRTTA； TETOH2B-GFP小鼠的皮肤样品在室温下在4％PFA中固定30分钟 ，以保留TDTOMATOMATOSINALS。然后将组织在4°C的30％蔗糖中孵育过夜，并嵌入OCT化合物（Sakura） 。然后用4'
，6-二胺2'-苯基吲哚二氯化物（DAPI）制成并对70-100 µm厚的皮肤切片（包括全置型HFS）进行了反染色
。 　　然后如“显微镜”部分中所述成像整个HF。 　　免疫荧光如前所述，但进行了轻微的修改7,24 。在4°C下 ，将皮肤组织固定在4％PFA中。顺序脱水的乙醇和二甲苯浓度增加后
，将组织嵌入石蜡中
。切片以6μm切割，将脱蜡带和微波炉在10 mM Tris和1 mM EDTA（pH 8.0）中进行抗原检索。然后将组织切片与以下一抗在室温下在PBT（PBS加0.1％Triton-X100）的4°C下孵育2小时 ，并用10％FBS孵育
，然后是Alexa-488偶联或Alexa-594偶联的二级抗体（1：200; thermo fisher fisheri）：Atanca-594偶联的二级抗体（1.200; thermo fisti;SC-10451），兔子反托马托（1：1,000; Rockland ，600–401–379）;小鼠抗tomato（RF5R）（1：500; Thermo Fisher
，MA5–15257）;兔抗tyrp1（1：100; Sigma-Aldrich，SAB2102617）;小鼠抗E-钙粘着蛋白（1：100; BD转导 ，610181）;兔子抗KI67（1：100; ABCAM
，AB15580）;小鼠抗β-catenin（1：400; Sigma-Aldrich，C7207）;和小鼠抗MITF（1：100; ABCAM ，AB12039） 。使用了Thermo Fisher的以下二级抗体：Alexa Fluor 594驴抗小鼠IgG（1：200; A21203）;Alexa Fluor 488驴抗小鼠IgG（1：200; A21202）;Alexa Fluor 594驴抗兔IgG（1：200; A21207）;Alexa Fluor 488驴抗兔IgG（1：200; A21206）;Alexa Fluor 594驴抗山羊IgG（1：200; 11058）;和Alexa Fluor 488驴抗山羊IgG（1：200; A11055）
。皮肤切片用DAPI对抗。 　　为了检测CD34，P-钙粘蛋白和DCT
，如上所述收集，处理和嵌入在OCT中的皮肤组织（“ 3D整个山基ne族分析 ”） ，以保留TDTOMATO或GFP信号 。接下来
，制作了50–70 µm厚的皮肤切片
。将皮肤切片在室温下在PBS加0.5％Triton-X100中孵育1小时，并与针对DCT的一抗（1：100; Santa Cruz ，SC-10451）
，CD34（1:50; BD Pharmingen，553731）和P-Cadherin（1：1：1：1：1：Invitrogen at 13-2000Z）孵育。然后在室温下用PBS用PBS洗涤皮肤切片3次 。对于DCT ，将切片与Alexa-488偶联的二抗（1：200）孵育1小时
。对于CD34和P-钙粘着蛋白
，将切片与生物素化的抗古RAT IgG（1：100; Vector Laboratories，BA-9400）孵育1小时 ，然后与链霉亲素Alexa 647 conjugate（1：200
，Invitrogen，Invitrogen ，S32357）孵育30分钟，以供室温下30分钟。皮肤切片用DAPI对抗 。 　　根据制造商的协议
，使用Leica Bond III自动染色平台（Leica Biosystems）进行原位杂交
。OCA2（ACDBIO，1072511） ，GPR143（ACDBIO
，535108），COL12A1（ACDBIO ，312638）和TXNIP（ACDBIO
，4572228）的小鼠探针用于LEICA系统，并使用了rnascope LS多重荧光量（ACDBIO）。如“免疫荧光
”部分所述 ，通过施加原位和二级抗体来完成原位杂交后进行免疫荧光的双重检测 。然后
，使用Vectra Polaris（Akoya Biosciences）在×20的蛋白石荧光570（Akoya Biosciences，FP1488001KT） ，690（Akoya Biosciences
，FP1497001KT）和DAPI（Akoya Biosciences）和DAPI（Akoya Biosciences，FPP1490）中 ，使用Vectra Polaris（Akoya Biosciences）进行扫描皮肤切片。使用Inform（V.2.6.0）软件（Aloya Biosciences）处理扫描的图像
。为了进行定量分析，使用Halo（V.3.5）软件（模块Indica Labs-Fish V.3.2.3）。在中部 - 阿南根隆起/ORSUP和灯泡的TDTOMATO+细胞中测量了鱼类探针细胞强度（每个细胞的平均强度（×）斑点和簇） 。在多个样品中比较了同一样品中凸起/ORSUP TDTOMATO+细胞与Bulb TDTOMATO+细胞的相对强度
。 　　对于薄部分
，在单个焦平面上拍摄图像。对于整个载体组织和较厚的部分，在整个HF的整个深度中收集了串行Z图像 。使用Eclipse Ti倒置显微镜（Nikon）或直立的Axioplan（Zeiss）拍摄宽场荧光图像
。处理图像以使用ImageJ/Fiji ，Adobe Photoshop和NIS元素软件（Nikon
，v.5.20.02）中的焦点函数扩展深度重建焦点图像。 　　图1和图2中的Z-stack荧光图像 。使用×63 Na/1.4 Plan Apochromat透镜（Zeiss）的LSM 880共聚焦显微镜（Zeiss）采用2A和3B
。Z堆栈以0.3 µm的步长取。使用Imaris 9.5软件（牛津仪器）重建量 。 　　单个黑素细胞隔离如先前发表的24，但进行了轻微的修饰
。为了分离Anagen II HFS的单个黑素细胞 ，DCTRTTA; TETOH2B-GFP小鼠在8周大时被抑制
，并喂食含多西环素的饮食（1 g kg – 1）持续4天。在拆卸后4天，当HFS在Anagen II时 ，小鼠被杀死 。然后将小鼠冲洗在贝达丁
，然后在70％乙醇中冲洗。收集了小鼠的背皮
。手术刀叶片用于去除皮下脂肪，将皮肤冲洗在PBS中 ，切成1×1 cm片
，然后在0.25％胰蛋白酶在37°C下孵育1小时30分钟。用镊子和手术刀将表皮与真皮分离，并在100 r.p.m.摇动时将表皮切碎并在0.25％胰蛋白酶中孵育30分钟 ，然后轻轻移动以获得单细胞悬浮液 。通过70 µM尼龙过滤器过滤所获得的MCSC悬液，并在200 R.C.F.离心
。持续5分钟
，然后重悬于培养基A（DMEM，10％FBS和1×青霉素 - 链霉素）中。 　　为了隔离单个鳞茎黑色素细胞 ，DCTRTTA; TETOH2B-GFP在5周大的时候
，在5周大的情况下喂食强力霉素的饮食4天，在Anagen VI阶段 。根据先前描述的方法57进行鳞茎黑素细胞的分离 ，但进行了轻微的修饰
。将小鼠安乐死并在贝达丁（Betadine）冲洗
，然后是70％乙醇。将皮肤切成0.5 cm2切片，并在5 mM EDTA（pH 8）中孵育2小时 ，在37°C下孵育2小时 。孵育后
，结缔组织，结缔组织 ，脂肪细胞层和真皮被用镊子去除
，并将0.5 cm2的皮肤样品切成单行HFS，并保存在中等A中
。用手术刀片将HF鳞茎微调 ，并收集到培养基中，并在200 r.c.f中进行5分钟。除去培养基A
，并将头灯泡在1 ml的0.2％胶原酶II和50 U ML – 1配置酶（9：1溶液）中孵育，并在100 r.p.m.中摇动 。在37°C下持续25分钟
。在室温下添加了下一个400 U ML – 1 DNase I并在室温下孵育5分钟。添加五体培养基A ，然后通过100 µM细胞过滤器过滤 。细胞悬浮液通过在200 R.C.F.离心的情况下进行沉淀。在4°C下持续5分钟
，并重悬于中等
。 　　然后，通过在配备有100 µm喷嘴的温列表3D分析仪（V.8.0）的Sony SY3200细胞分析器上对单元进行分类 ，将单个GFP+和DAPI隔离的活黑素细胞分离出来。将来自各种条件的四只小鼠的单细胞悬浮液合并
，以进行随后的SCRNA-SEQ分析 。FlowJo 10.8.2（仅MAC）用于绘制FACS门控策略
。 　　将单个黑素细胞悬浮液加载在10倍基因组铬仪上，以在乳液中产生单细胞凝胶珠（GEMS）。每个通道加载约5,000–10,000个细胞 。使用以下铬单细胞3'V2试剂试剂盒制备用于分化的鳞茎黑色素细胞的SCRNA-SEQ库：铬单细胞3''库和凝胶珠Kit Kit v2 pn-12237;单细胞3'芯片试剂盒V2 PN-12236;和i7多路复用试剂盒PN-1220262（10x基因组学）
。遵循单元3'试剂盒V2用户指南（手动零件CG00052 REVA）进行58。使用以下铬单细胞3'V3试剂试剂盒制备了用于Anagen II黑素细胞的SCRNA-SEQ库：铬单细胞3''库和凝胶珠Kit Kit v3 pn-1000075；单小区3ʹ功能条形码库套件PN-1000079;单细胞B芯片套件PN-1000073;和i7多路复用试剂盒PN-1220262（10x基因组学） 。遵循单个单元3'试剂盒V3用户指南（手动零件CG000201 REVA）
。图书馆在Illumina Novaseq 6000上运行。细胞护林员单细胞软件套件（v.6.0.1）用于执行样品demultiplexing ，条形码处理和单细胞3'基因计数 。将cDNA插入物与MM10/GRCM38参考基因组（MM10-2020-A）排列
。从NCBI基因表达式Omnibus（标识符GSE113502）下载了未分化的Telogen黑素细胞数据集
，并使用相同版本的Cell Ranger单细胞软件Suite（V.6.0.1）重新处理，并映射到相同的参考基因组（MM10-202020202020-A）。使用Seurat软件包（V.4.1.0）59进行了进一步的分析和可视化 ，使用R Studio Desktop（V.1.4.1717）和R（v.4.1.2）进行了进一步的分析和可视化 。 　　每种条件的Seurat对象都是由数字基因表达矩阵产生的。在质量控制步骤中
，子集细胞的参数为telogen黑色素细胞的Nfeature_RNA（200-2000），ncount_RNA> 10000用于Anagen II黑色素细胞和NCOUNT_RNA> 5000 ，用于鳞茎黑色素细胞和MITOCHOCHIRIAN基因的百分比< 0.05 for all conditions. Different thresholds in filtering out low-quality cells were set for each condition owing to the differences of sequencing depth among the conditions. Data were then log scaled, centred and normalized to the number of Unique Molecular Identifier (nUMI). Principal components (PCs) were calculated using Seurat’s RunPCA function. The top 3,000 variable genes were used for calculating PCs. 　　For each condition, UMAP dimension reduction was performed on the normalized, centred, scaled nUMI count matrices using the first ten PCs. We then performed unsupervised clustering using the Seurat SNN clustering package, using a resolution of 0.6. Most clusters were identified as melanocytes based on expression for Dct, whereas each condition contained a minor cluster of epidermal cells positive for Krt10 or Krt14. The epidermal cells were excluded from subsequent analysis. 　　For comparative analysis, we merged melanocyte matrices from three conditions (telogen melanocyte, anagen II melanocyte and differentiated melanocyte) followed by a standard workflow of Seurat. Data were log normalized, scaled and centred after regressing out the effect of nCount_RNA (the total number of molecules detected within a cell from sequencing) and percent.mt (mitochondria ratio, defined by the PercentageFeatureSet function in Seurat). As the three conditions showed differences in sequencing depth (nCount_RNA varies greatly) and sequencing depth is a major cause of batch effects in scRNA-seq, the effect of nCount_RNA was regressed out before identifying PCs to account for such batch effects. The top 3,000 variable genes were used for calculating PCs. UMAP dimension reduction was performed on the normalized, centred, scaled nUMI count matrices using the first three PCs. 　　To estimate the cell cycle stage of a cell, we used Seurat’s cell cycle scoring. In brief, averaged relative expression of cell cycle related genes were used to calculate G2/M and S scores, which were used for binning cells into G2/M, S and G1/G0 bins. The cell cycle scores were regressed out in ScaleData step in the analysis of the anagen II melanocyte dataset alone, followed by PC calculation, UMAP dimension reduction and unbiased clustering as described above. 　　Pseudotime analysis was performed using the slingshot package (v.2.2.0)60. The Seurat object was imported into slingshot using the as.SingleCellExperiment function. Then a pseudotime trajectory was constructed using the slingshot function with UMAP dimensional reduction. 　　Genes differentially expressed between anagen II melanocytes compared with telogen melanocytes (P < 0.05, log2(fold change) > 0.25）根据其折叠变化从高到低排名
。预先排名的基因列表因其在从分子签名数据库（MSIGDB）中获取的两个注释的基因集中而受到询问，即GOBP_DENDRITE_DEVEVEMS和GOBP_DENDRITE_MORPHENESIS-使用Preeranced Gene ine ine ine Gene Setion inter ine ine ine inter Gene set ine ine ine inter inter nate ine inter Gene set ine ine ine inter nate ine inter nate ine inter Gene set ine ine ine ine inter nater ine ine inter set ine inter。错误的发现率Q值<0.25被认为是显着的 。 　　定量的测量可以在图和图传说中的条形图的y轴中找到
。每个图的统计详细信息可以在图（n数字）中找到。n的确切含义在相应的图中描述 。没有使用统计方法来预先确定样本量
，但我们的样本量与以前出版物中报道的样本量相似7,24,38,39,40,55
。使用两尾未配对的t检验进行两组之间的成对比较。使用单向方差分析（ANOVA）或双向ANOVA进行了多组的比较，然后进行多重比较测试 。统计测试的详细信息在图传说中指定
。如果P <0.05 ，认为统计显着性是显着的。精确的p值在数字和传说中指示 。实验数据显示为平均值±标准偏差或平均值的标准误差
。使用GraphPad Prism（V.9.2.0）和Microsoft Excel（V.2016）进行统计分析和绘图。 　　通过与相应的作者联系
，可以根据合理的要求提供本研究产生的材料 。 　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得。