小鼠实验是根据美国实验室动物福利法规办公室进行的 ，并得到了纪念斯隆·克特林癌症中心机构动物护理和使用委员会的批准（IACUC协议编号01-03-007） 。小鼠在高压灭菌的白杨树芯片床上用品（PWI Industries）上的固体底
，多硫酮，单个通风笼（IVCS）（IVCS）（Thoren Caging Systems）；γ辐照的饲料（Labdiet 50531 ，PMI）和酸化的反渗透水（pH 2.5至2.8）提供了多余的自由
。笼子中还包含Nestlets
，Envirodri和/或Enviropaks作为环境丰富。IVC系统每小时以大约30个空气变化为通风 。向每个笼子提供HEPA过滤的房间空气，然后将架子废水直接用尽到建筑物的排气系统中
。每周在HEPA过滤的垂直流动站或2类A类生物安全柜中更换笼子。动物握持室保持在21.5±1°C ，相对湿度在30％至70％之间
，光线为12:12 h：深色光周期 。小鼠通过二氧化碳窒息对组织收集进行了安乐死
。通过其他Where35所述的MRE11-FLOX（参考文献44）和NGN3-CRE（参考文献45）等位基因（参考文献44）和NGN3-CRE（参考文献45）来产生雄性种系特异性的MRE11-CKO小鼠。没有进行随机分组或盲目 。 　　用于鼠标SPO11（Uniprot：Q9WTK8-1）的全长优化编码DNA，上面有标志标签 ，然后在氨基末端进行TEV裂解位点，以及未标记的TOP6BL（Uniprot：J3QMY9-1）
，将其克隆到PCDNA3.1（+）载体（+）矢量（InvitRogen）中。SPO11构建体编码为β剪接同工型，其中包括在α同工型中跳过的外显子2
。SPO11β对于大多数DSB在体内形成都是必要的 ，并且足够足够
，并且与TOP6BL9,19,19,46,47,48的稳健相互作用所必需的外显子编码序列。尽管我们不能排除国旗标签会影响函数，但我们注意到 ，甚至更大的标签（FKBP或FRB）似乎也不会干扰活动
，并且预计SPO11的N端在AlphaFold 3模型中被非结构化 。使用Quikchange诱变产生点突变体（Y138F和E224A）
。编码人FKBP1A的密码子优化序列（Uniprot：p62942），人MTOR的FRB结构域（Uniprot：p42345）和甘氨酸（GS）连接器被合成为gblocks。然后将这些序列克隆到与小鼠SPO11相同的矢量中 ，该序列位于标记和TEV裂解位点之间 。在补充文件2中提供了标记为FLAG标记的野生型SPO11和FKBP和FRB融合的氨基酸序列
。 　　自由泳293-F细胞（Invitrogen）在37°C下的多核振荡器（Infors
，120 rpm）的自由泳293表达培养基（GIBCO）中培养。细胞系未对支原体进行身份验证或测试 。当细胞密度达到每毫升1.2×106细胞时，质粒被共转染如下
。对于1 L细胞培养 ，将1 mg的质粒与25 mL Opti-MEM（Gibco）的25 ml的40 kDa线性聚乙基胺（PEI）（PEI）（POLYSCIENCES）预孵育25-30分钟。通过将混合物添加到细胞培养物中来启动转染 。转染后约16小时
，将丁酸钠添加到10 mm的终浓度中
。收集前，将转染的细胞培养32小时（总共48小时）。 　　对于每批蛋白质纯化 ，通过在3,100G下离心收集1 L转染的细胞，并重悬于含有25 mM HEPES-NAOH
，pH 7.5和500 mM NaCl的裂解缓冲液中 。悬浮液补充了蛋白酶抑制剂鸡尾酒，包括1 mM苯基甲基磺酰氟化物（PMSF）和1×Halt蛋白酶抑制剂鸡尾酒（Thermo Scientific）。通过超声处理裂解细胞 ，并以46,000克离心60分钟
。将上清液应用于抗FLAG M2亲和凝胶（Sigma
，A2220），并在4°C下通过重力流过。该树脂用裂解缓冲液冲洗三次 。用含有200μgml -1标志肽（Sigma）的裂解缓冲液洗脱蛋白质
。然后使用10 kDA截止中心（Millipore）将洗脱液浓缩 ，并使用Unicorn 7.6（构建7.6.0.1306）进一步纯化SEC（SuperDex 200增加10/300 GL
，GE Healthcare）。将峰值分数合并，并在约1.5 mg ml -1的浓度下浓缩至40μl 。将等分试样冷冻在液氮中 ，并储存在–80°C
。使用Nanodrop 8000（版本2.3.3）
，通过280 nm的吸光度确定蛋白质浓度。 　　补充表1中提供了寡核苷酸序列 。由EMSA的两个核苷酸5'-跨端端的发夹底物通过[γ-32p] ATP（Perkin Elmer）和T4 Polynuceletiide Kinase（NEB）（NEB）（NEB）（NEB）（NEB）（NEB）（NEB）（NEB）（NEB）（NEB）（NEB）组装，以5'-END标记为5'-End ，以5'-END标记为EMSA的两个核苷酸5'-跨端端
。通过退火互补的寡寡寡寡做产生双端结合实验的底物
，在两端创建2-nt 5'TA悬垂物。在Ste缓冲液（100 mM NaCl，10 mM Tris-HCl pH 8 ，1 mm EDTA）中以等摩尔浓度（10毫米）的等摩尔浓度（10 mm）混合寡核体，加热并缓慢冷却 。然后将底物用[γ-32P] ATP（Perkin Elmer）和T4多核苷酸激酶标记为5'-End
，并通过天然页面进行纯化
。 　　DNA裂解的寡核苷酸底物的序列是用PUC19的首选切割位点之一（图4A，B）设计的 ，位于44 bp的双链双链侧面
，侧翼是A4 ssDNA循环（图4F）。首先使用15％聚丙烯酰胺 - 尿素凝胶（Invitrogen）纯化96-NT自相互核苷酸，然后用[γ-32p] ATP（Perkin Elmer）和T4多核苷酸激酶标记 。然后通过加热和缓慢冷却来退火纯化的寡核苷酸。然后 ，使用T4 DNA连接酶密封DNA柱
，并使用另一种15％的聚丙烯酰胺 - 尿素凝胶从线性无原分的分子中纯化圆形连接的寡核苷酸
。然后通过加热和缓慢的冷却来重新核能核苷酸。 　　对于发夹底物，在25 mM Tris-HCl pH 7.5 、7.5％甘油 ，100 mM NaCl
，2 mM Dithiothreitol（DTT），5 mM MMGCL2和1 ml-1 bovine bovine complim in 0.1 nmMDNA中进行结合反应（10μl） ，100 mM NaCl
，100 mM NaCl，2 mM dithiothreitol（dtt） ，5 mM MMMGCL2和1 ml-1 bovine complim in 0.1 nm dna和1 ml-1 sp sp 。将反应在冰上组装，然后在30°C下孵育30分钟
，并在6％DNA粘贴凝胶（Invitrogen）下在100 V上分离30分钟
。For binding to the oligonucleotide cleavage substrate, SPO11 complex was incubated with 0.1 nM DNA at 4 °C for 30 min in a buffer containing 25 mM HEPES-NaOH pH 7.5, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 7.5% glycerol, 1 mg ml−1 BSA, and 2 mM DTT.6％的DNA阻滞性凝胶在100 V前预先进行20分钟，并在0.5×Tris-Borate中补充了5 mM MGCL2作为运行缓冲液 ，然后将结合反应加载并在100 V下分离40分钟。对于这两种底物
，将凝胶干燥，暴露于放射自显影板 ，并使用Amersham Typhoon Control软件（版本4.0.0.4）通过磷光成像进行可视化 。使用GelbandFitter（版本1.7）49进行量化
，并通过GraphPad Prism 10（Mac OS X版本10.3.0（461））中的非线性回归计算出明显的KD值
。 　　通过用NDEI处理PUC19来制备用于AFM的线性质粒。在25 mM Hepes-NaOH pH 6.8，5 mM MGCL2 ，50 mM NaCl
，10％甘油中，在1 nm（分子）DNA存在下 ，将SPO11 – TOP6BL复合物稀释至4 nm的最终浓度4 nm 。将混合物在30°C下孵育30分钟
。将40μL的DNA-蛋白质混合物与3-氨基丙二醇三氧基硅烷（APTES）（Pelco云母盘
，V1，TED Pella）沉积到预处理的云母上5分钟。将样品沉积的云母用1 mL分子生物学级去离子水冲洗 ，并用氮气温度干燥 。使用NanoWizard V（JPK扫描探针显微镜控制程序8.0.59.1）在AC模式成像下在室温下捕获AFM图像
。AFM探针（RFESPA-75，BRUKER）的名义频率约为75 kHz
，标称弹簧常数为3 N M-1。以2 Hz线速率收集图像，图像大小为2×2μm ，以512×512像素分辨率收集 。对于数据处理
，将图像用3080像素分辨率导出。使用JPK数据处理软件（版本8.0.59.1）处理图像
。ImageJ（1.54G版本）用于量化DNA弯曲角。 　　使用Refeyn Twomp仪器进行质量光度法实验 。将现成的6孔样品盒（Refeyn）放置在干净的，即用的样品载体载玻片（Refeyn）的中心 ，每个载体载体（Refeyn）
，每个井指定井进行一次测量
。为了找到焦点，将15μl的新鲜MP缓冲液加载到井中。对于SPO11复合物 ，缓冲液含有25 mM HEPES-NAOH（pH 7.5）
，150 mM NaCl和2 mM DTT 。对于含有fkbp和frb的SPO11的复合物，用或没有5μM雷帕霉素制备缓冲液
。在整个测量过程中 ，使用基于整个内部反射的自动对焦系统确定并维护焦点位置。将纯化的SPO11或FKBP -SPO11和FRB -SPO11配合物的Equolar混合物（1：1）稀释至MP缓冲液的浓度为240 nm 。随后
，将1μl的稀释后SPO11或FKBP -SPO11加上FRB -SPO11复合物添加到缓冲液滴中，导致最终蛋白质浓度为15 nm
。自动对焦稳定后 ，将电影录制为60 s。使用Refeyn AcceareRemp（版本2024.1.1.0）进行数据采集，并使用Refeyn DiscoverMP（版本2024.1.0.0）进行数据分析 。使用BSA蛋白标准（Sigma）进行对比度对质量校准
，其中包含BSA单体和分子质量为66.5和132 kDa的二聚体
。使用DiscoveMP进行统计分析，其中分布峰拟合了高斯函数 ，以获得每个分布成分的平均分子质量。使用GraphPad Prism 10进行绘图 。 　　通过将带有反向旋转酶（来自K. Marians Laboratory的S. Bahng的礼物）孵育否定性超涂的PUC19（Thermo Scientific）
，制备积极的超涂PUC19，然后使用Qiaquick PCR纯化试剂盒（Qiagen）（Qiagen）纯化 ，并通过氯钾抗凝聚氨基氨基脂肪凝胶胶质胶质固定和验证。松弛的共价闭合PUC19是通过与大肠杆菌拓扑异构酶I（NEB）孵育的否定型PUC19来产生的
，并使用Qiaquick PCR纯化试剂盒（QIAGEN）纯化
。通过用ECORI和SSPI对PUC19的双重消化制备线性化底物，然后使用Qiaquick凝胶提取试剂盒（Qiagen）进行琼脂糖凝胶提取。为了进行定量 ，使用[γ-32p] ATP（Perkin Elmer）和T4多核苷酸激酶（NEB）在5'端都标记了线性化的底物 。 　　在包含25 mM Hepes-NaOH pH 7.5
、1 mM DTT
，0.1 mg ML-1 BSA（Sigma），1 mM MM MNCL2和4 ng µl-1 PUC19 DNA的缓冲液中进行典型的质粒反应（70μl）
。然后在冰上制备反应缓冲液 ，然后将重组蛋白（通常为75-100 nm）添加在冰上。除非另有说明
，否则将反应在37°C下在指定的时间孵育 。在每个指示的时间点，除去11 µL的反应混合物 ，并用3μl的停止溶液（375 mM EDTA，5％SDS）和1μl蛋白酶K（Thermo Scientific
，20 mg ML -1）终止，然后在50°C下孵育30分钟
。 　　然后将反应产物与6×DNA载荷染料（NEB）混合 ，并在TAE缓冲液中的1.2％琼脂糖凝胶（Lonza）上通过电泳分离。使用定制的垂直琼脂糖凝胶系统（凝胶长度14.5 cm
，CBS Scientific），在80 V进行了90分钟的分离 。随后用SYBR Gold（Invitrogen）对凝胶进行染色 ，并使用Chemidoc MP MP Imaging Imaging System（Bio-Rad Image Lab toun touch软件（3.0.0.1.1.14.14）进行成像
。 　　使用Image Lab（6.1.0版本7）和GelbandFitter量化凝胶图像。切割活性表示为使用的底物的百分比
，即至少持续一个可检测到的尼克或DSB的DNA分子的比例 。重要的是要注意，当DNA分子持续多次断裂时 ，这一部分低估了总链裂解
。这是因为我们无法区分一个划痕的分子是否已被划痕一次或多次划痕
，我们无法区分DSB的分子是否也被划分了，并且我们无法可靠地量化多个DSB所产生的涂片中的断裂次数（如今 ，加上共价闭合的topoisomers）。为简单起见
，计算底物利用率是相对于每个车道中的总DNA的成绩圆和全长线性分子（DSB）的百分比，从而减去对照（NO蛋白质）反应中存在的任何刻度DNA作为背景（方法1） 。当明显存在多个DSB（即 ，在以后的时间点上出现明显的涂抹在凝胶上，我们对这些车道的底物利用进行了量化
，而是随着超螺旋带的消失与Time Zero相比的消失（方法2）。有关每个图的源数据文件中使用哪种量化方法的详细信息
。为了绘制目的，底物利用时间课程通过棱镜10中的非线性回归拟合到两阶段关联曲线。这些曲线仅旨在帮助可视化趋势 ，不应被视为一种理论上有效的估计速率速率参数的有效方法 。 　　对于寡核苷酸的裂解测定
，图4F中显示的底物是通过自动宣布和连接5'-32p标记的ssDNA寡核苷酸的自省和结扎，该寡核苷酸含有首选的裂解序列（蓝色箭头） ，该核苷酸（蓝色箭头）从图4B中所示的PUC19产生
。裂解反应在包含25 mM HEPES-NAOH pH 7.5、5 mM MNCL2（或5 mM MGCL2）
，0.1 mg ML-1 BSA，1 mM DTT和0.02％NP-40的缓冲液中进行。将含有10 nm SPO11复合物和0.5 nm放射性标记寡核苷酸的混合物在4°C下组装 ，然后立即转移至37°C以启动反应 。在每个指定的时间点
，取出5 µL的反应混合物，并用1.2 µL的375 mM EDTA快速淬火
。然后将混合物用蛋白酶K在50°C下消化30分钟。将样品在1×TBE的缓冲液中加载到15％聚丙烯酰胺 - 尿素凝胶上 ，并在180 V下电泳50分钟 。然后将凝胶干燥
，暴露于放射自显影板，通过磷光成像可视化 ，并使用GelbandFitter进行分析
。对于混合SPO11（Y138F）和SPO11（E224A）的实验，使用了5 nm的每个突变体复合物。对于仅SPO11（Y138F）
，使用了10 nm的突变体复合物 。 　　请注意，由于蛋白水解后剩下的残留氨基酸（S） ，图4G中的刻度产物的运行速度比标记（M-Nick）慢
。因此
，我们希望出于相同的原因，DSB产品的迁移也比标记（M-DSB）更慢 ，但它与标记密切相关。蛋白酶K可能比从nick端从DSB端清除SPO11残基更有效
，但是我们不能排除裂解发生在完整PUC19时切割的首选序列以外的其他可能性 。 　　对于CSCL超离心和免疫沉淀测定，在含有25 mM HEPES-NAOH pH 7.5 、1 mM DTT的缓冲液中进行裂解反应（60 µL） ，0.1 mg ML-1 ML-1 BSA
，5 mm MM MNCL2，5 mM MNCL2和4 ng µL-µl-1 µl-1 Puc19 dna。然后在冰上制备反应缓冲液 ，然后将重组蛋白（325 nm终浓度）添加在冰上
。立即终止反应
，或在37°C下孵育11分钟。为了终止超速离心测定法的反应，将50 µL的反应混合物与83.3 µL的停止溶液结合使用 ，以产生30 mM EDTA，0.5％sarkosyl
，5 m鸟苷HCl的最终浓度 。为了终止免疫沉淀测定的反应，将50 µL的反应混合物与12.5 µL的停止溶液合并 ，以产生37.5 mM EDTA
，0.5％SDS的最终浓度
。 　　将冰（酶的体内复合物）的适应性用于与DNA51共同结合的蛋白质的免疫检测。在新的5 mL离心管中，添加了2 ml 150％（w/v）CSCL溶液 ，然后将2 mL的缓冲液含有10 mM Tris-HCl pH 8.0
、0.1 mM EDTA和0.5％sarkosyl层层 。然后将停止的反应混合物（133.3 µL）层铺在顶部
，并添加缓冲液，直到管饱满
。将管子密封 ，放置在TN-1865 Ultratrifuge转子（Thermo Scientific）中
，并以42,000 rpm（〜157,000g）的速度离心17.5 h，在Sorvall WX+ WX+ Ultra Ultra系列Ultra Series ultratricentrifuge（Thereo Scientific）中24°C下离心。将所得的具有共价结合蛋白的DNA颗粒用70％乙醇洗涤 ，并溶于1×TE缓冲液（10 mm Tris-HCl pH 8.0
，0.1 mm EDTA），在室温下2小时 。将每个样品与三分之一体积的25 mM磷酸钠pH 6.5缓冲液混合 ，然后使用插槽吸尘器（Bio-Rad）应用于0.45 µm硝酸膜膜（Bio-Rad）
。包括不包括蛋白质阴性对照（仅DNA和仅缓冲液），重组SPO11复合物（〜10 ng总蛋白）被应用于相邻的插槽作为检测。使用抗FLAG-HRP单克隆抗体（Mouse
，1：1,000，Sigma A8592）对SPO11蛋白进行免疫检测 ，然后与ECL Prime Western Blotting检测试剂（Amersham）一起孵育
，并使用Chemidoc MP成像系统（Bio-Rad）进行检测 。 　　为了进行免疫沉淀，将停止的反应混合物（如在冰测定的前段中制成的制备）与237.5 µl的结合缓冲液（25 mm Hepes-NaOH pH 7.5 ，500 mm NaCl
，NaCl，500 mm NaCl ，5 mm EDTA
，5 mm EDTA，1％Triton X-100） ，1％triton X-100和50 µL抗抗磁剂（Piere-flag age）（Piere-flag ager-piere a36）ass as as piere a36 ins-piere a 33 ins as piere a 33用绑定缓冲液两次
。将混合物在室温下以1,000 rpm的轻微摇动孵育60分钟。孵育后
，用洗涤缓冲液（25毫米Hepes-NaOH pH 7.5，150 mm NaCl ，5 mm EDTA，1％Triton X-100）洗涤磁琼脂糖两次
，然后在30 µL的2×LaEMMLI样品缓冲液（Bio-Rad）和1 µL的蛋白酶K（Inceinaze K Scientific K）（INC Thermo Scientific kl-Ml-1毫升）中，将30 µL（laemmlI50°C 。使用Qiaquick PCR纯化试剂盒（Qiagen）纯化产物 ，与6×DNA载荷染料（NEB）混合
，并通过琼脂糖凝胶电泳分离，如DNA裂解测定中所示。随后将凝胶用SYBR金（Invitrogen）染色 ，并使用Chemidoc MP成像系统（Bio-Rad）成像
。 　　为了研究5'或3'SPO11附着
，使用T4多核苷酸激酶（NEB）用[γ-32P] ATP或[γ-32P] ATP或3'末端使用[α-32P] Datp和[α-32P] Datp和[neb）在3''末端使用T4多核苷酸激酶（NEB）在5'末端进行标记的10 µg PUC19并在5'末端进行标记，并在5'末端标记10 µg PUC19 ，使用[γ-32P]数据P）在5'末端标记10 µg
，将10 µg标记为5'或3'。标记后，用SSPI进一步消化底物以产生单端标记的片段 ，随后通过琼脂糖凝胶电泳纯化
，并使用Qiaquick凝胶提取试剂盒（QIAGEN）提取 。在25 mM HEPES-NAOH pH 7.5、1 mM DTT，0.1 mg ML-1 BSA和5 mM MMMMMM MNCL2的情况下 ，在2.3 nm（0.87 ng µl-1）的底物浓度下进行裂解反应
。在冰上制备反应缓冲液，并将重组蛋白（325 nm）添加在冰上。将反应在37°C下孵育2小时 。为了终止反应
，将70 µL的反应混合物与17.5 µL的停止溶液组合，以达到37.5 mM EDTA和0.5％SDS的最终浓度
。用1 µL蛋白酶K处理43.75 µL等分试样（一半） ，并在50°C下孵育1小时。然后将样品与蛋白酶K处理有或不进行蛋白酶K处理
，然后将相等体积的2×尿素加载缓冲液（Invitrogen）混合，并在85°C加热5分钟 。随后 ，将每个样品的10 µL加载到60°C的预热6％TBE-TE-TE-TE-TE-TE-TEREA凝胶（Invitrogen）上
，并在180 V时电泳30分钟
。将凝胶干燥，暴露于放射自显影板 ，并使用磷光成像可视化。 　　在含有25 mM Hepes-NaOH pH 7.5 、1 mM DTT
，0.1 mg ML-1 BSA和1 mM MNCL2的70 µL反应缓冲液中进行了测序的体外切割测定 。对于PUC19的切割，将反应缓冲液与4 ng µl -1 DNA（终浓度）混合 ，然后加入重组SPO11 – TOP6BL复合物（100 nm）
，然后在37°C下在37°C中孵育30分钟，持续30分钟 ，然后将1 µL蛋白酶K溶液（30 mL -GML -G ML -G ML -1分钟）倒入1 µL蛋白酶K溶液
。通过用苯酚提取：氯仿：25：24：1； Thermo Fisher）和来自大肠杆菌DH5α细胞（Takara）或指数生长的S288C应变背景的S. cerevisiae细胞纯化细菌和酵母基因组DNA。对于基因组DNA裂解，在冰​​上将反应缓冲液与2.5 µg DNA混合 。然后加入重组SPO11（300 nm）
，并将混合物在37°C下孵育60分钟，并如上所述灭活。 　　使用S1-sequest协议的修改版本进行测序库52,53,54,55
。简而言之 ，分解了16周龄（重复1）或5周旧（重复2）小鼠的睾丸
，并将细胞嵌入如所述55所述的琼脂糖塞中。为了在体外SPO11裂解位点映射，将SPO11在体外消化的DNA与野生型C57BL/6 J小鼠睾丸细胞（每个插头0.5-10万细胞）一起嵌入插头 ，其DNA在图书馆制备过程中充当载体 。为每个实验准备了两个插头
。在蛋白酶K和RNase A治疗后
，根据Topogen方案（50 mM Tris-HCl pH 8，0.15 m NaCl ，10 mM MGCl2
，0.5 mm DTT，30μgml-1 BSA ，2 mm ATP
，2 mm ATP），用纯化的人tdp2 PMS ppmol（490 pms）孵化 ，在TDP2缓冲液中平衡插头。30分钟以从DNA末端取出共价连接的SPO11 。随后的步骤（用T4 DNA聚合酶（NEB）填充，与生物素基因适配器的连接
，DNA纯化，DNA剪切 ，与剪切端的第二个适配器连接到第二个适配器的连接以及PCR扩增）
，如下所述进行了以下次要修饰：（1），以减少小型DNA的损失 ，以减少非常小的DNA的损失
。用于使用PUC19实验的4°C下的过夜到1小时。（2）NEBNEXT端端修复模块（NEB
，E6050S）用于修复剪切后的DNA末端 。DNA库在Illumina NextSeq 1000平台（配对端，50 bp）上使用实时分析（版本3.1或版本4.1）在纪念Sloan Kettering Cancer Center的Integrated Genomics操作中进行了测序
。使用Dragen Suite（版本4.2.7）将BCL文件转换为FASTQ文件。根据对测序MAPS55的可重复性的事先评估 ，选择样本量（n = 2） 。没有使用统计方法来预先确定样本量
。 　　使用先前发布的自定义管道的修改版本54
，对PUC19，大肠杆菌（ASM584V2） ，酿酒酵母（Saccer3）或小鼠（MM10）参考序列进行了测序读数。简而言之
，使用Bowtie2（2.5.3）56映射读数-n 1 -x 1000 。将唯一映射的读数提取并分配给核苷酸，并分配给生物素化适配器旁边的核苷酸。使用R版本4.2.3和4.3.2进行统计分析
。在下游分析之前 ，对酿酒酵母基因组中的端粒（500 bp处于每个染色体的末端）和核糖体DNA（Chr。XII：459,400–460,900） 。线粒体DNA和2µ质粒也被排除
。原始和加工的TDP2-seq数据存放在基因表达综合（GEO）（登录号GSE275291）上。在补充表2中发现了映射统计数据 。 　　图4A中的PUC19地图用21 bp Hann过滤器平滑，以简化显示屏
。对于图4D
，在MRE11-CKO小鼠的地图中，在先前定义的Hotspots43中鉴定了首选的切割位点 ，其中DSB仍未分解35。与图4C中的体外数据相比
，请注意图4D中基本组成和序列徽标的不同垂直尺度，表明体内数据的偏差较弱 。在图4E中 ，在减数分裂的DSB热点和MRE11-CKO小鼠中
，在Meiotic DSB热点和Mre11-CKO小鼠中，在减数分裂的DSB热点中鉴定了与体外偏差（GNATNC ，n = 11,423）或非优先级反向序列（Cntang
，n = 9,018）相匹配的位点
。 　　在PUC19，E. Coli和S. cerevisiae TDP2-Seq数据中 ，上链和底部峰分别称为> 3,000
，> 10和> 15 rpm的核苷酸位置。读数计数的位置比位于–1和+1位于顶部和底部链的位置的位置较少，因为这些读数可能会由于在适配器结扎之前的DNA末端的5'悬垂性而被误导地富集 ，因此未定义为峰值 。计算了测序TDP2-Seq读取的链的碱基组合物，即用重新定位分析底链峰
，以便将生物素基化适配器旁边的核苷酸应位于–1位于–1位置，相对于顶部链的Dyad Axis
。使用GGSEQLOGO（版本0.2）57生成序列徽标 ，其基本组成偏差校正了基因组平均G+C含量。对于酿酒酵母在体内数据中
，使用了映射的DSB位点周围的局部G+C含量（47.8％），因​​为它与基因组平均水平有很大差异（38.5％） 。图4E中的图案匹配是使用欧洲分子生物学开放软件套件（6.6.0）58的DREG鉴定的 ，具有默认参数。 　　使用Alphafold 3在线服务（https://golgi.sandbox.google.com）5
。输入包括两个全长小鼠SPO11（Uniprot：Q9WTK8-1）和TOP6BL（UNIPROT：J3QMY9-1）蛋白
，两个互补的DNA序列（补充表1）和四个镁离子。多个DNA序列用于评估模型对DNA组成的依赖性 。选择序列以表示酵母基因组DNA中不同的SPO11裂解位点，并且它们的长度从36至44 bp变化
。每个会话都产生了五个排名最高的型号。我们选择了一个代表性模型进行数字准备 。该模型的坐标在补充文件1中提供
。在嵌合体（版本1.18）59和Chimerax（版本1.8）60中进行结构对齐 ，分析和图形生成。 　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得 。