将所有细胞在37°C的加湿腔室中孵育 ，含5％CO2 。MIA PACA-2（MIA） ，UN-KPC-960（KPC）和UN-KC-6141（KC）细胞，野生型和R/R成纤维细胞在Dulbecco改良的Eagle的培养基（DMEM）（dmem）（Invitrogen）中均维持了10％Fetal Bovine Serum serum serum serum（fbs）（Gib）（GIB）（GIB） 。MIA细胞购自ATCC。KPC和KC细胞是在S. K. Batra28实验室生成的。D.B.10实验室产生了野生型和R/R成纤维细胞 。A.M.L.产生1305个原代人PDAC细胞 。来自人类PDAC患者衍生的异种移植的实验室，并在补充有20％FBS和1 mM丙酮酸钠（Corning）的RPMI（Gibco）中维持。所有培养基均补充青霉素（100 mg mL -1）和链霉素（100 mg mL -1） 。所有细胞通过视觉形态进行了部分认证 。野生型和R/R成纤维细胞通过ECM生产和I型Alpha 1裂解对部分身份验证。KPC和KC细胞通过小鼠胰腺中的原位肿瘤形成部分身份验证 。MIA和1305个细胞通过裸鼠的皮下肿瘤形成部分身份验证 。细胞没有进一步认证。测试细胞系的支原体污染 。LG培养基：在有10％透析的FBS和25 mM HEPE的情况下 ，补充无葡萄糖DMEM培养基 。LQ培养基：在有10％透析的FBS和25 mM HEPE的情况下 ，将无谷氨酰胺的DMEM培养基补充了0.2 mM谷氨酰胺。
对于基因消融，将靶cDNA序列（补充表1）分别用于使用BSMBI ，将小鼠DDR1 ，MRC2，ITGB1 ，LAIR1 ，NRF2，COL1A1和HURNED1和人DDR1的靶cDNA序列（补充表1）克隆到LentiCrispR V2-Blast Vector或Lenticrispr V2-Purolo vector中 。对于基因敲除 ，Plko.1-Puro-DDR1（TRCN0000023369） ，PLKO.1-PURO-DDR1（TRCN000000121163），PLKO.1-PURO-SDC1（TRCN00000000302270）（TRCN0000086064）从Sigma订购 。PCDH-CMV-MCS-EF1-PURO-COL1α1-6XHIS和PLVX-IRES-PURO-NRF2E79Q-FLAG由Sangon Biotech（中国上海）制造。Plko.1-Blast-ikkα ，plko.1-puro-nhe1 ，plko.1-puro-nhe1，plko.1-puro.-nrf2和lenticrispr v2-puro-p62/sqstm1先前已描述为先前11。Lenticrispr V2-Blast-ATG7（参考文献29）是S. Ghaemmaghami的礼物 。
慢病毒颗粒是像30之前产生的 。通过将含1 ml病毒颗粒的培养基与8μgml-1多甲烯组合在一起，通过将1 ml含有病毒颗粒的培养基与8μgml-1的聚乙烯相结合来转导MIA ，1305 ，KPC或KC细胞和成纤维细胞。8小时后用新鲜培养基喂养细胞，并在转导后48小时使用1.25μgml -1嘌呤霉素或10μgml -1 blasticidin开始选择 。先前已经描述了IKKαKDKC ，NRF2KD MIA和ATG7δMIA细胞11 。
雌性纯合NU/NU裸鼠和C57BL/6小鼠在六周大的Charles River Laboratories和Jackson实验室中获得。Col1a1+/+（Col IWT）或C57BL/6背景上的Col1a1r/R（Col IR/R）小鼠从D.B.获得 。在UCSD ，以前被描述为8,31 。根据年龄，性别和平均肿瘤相等的小鼠 ，根据其基因型将随机分配给不同的实验组。没有进行样本量预测 ，但每组尽可能多的小鼠被用来最大程度地减少i/ii型错误 。除非另有说明，否则使用雄性和雌性小鼠 。除了IHC分析外 ，没有进行小鼠的盲。所有小鼠均在恒温和湿度和无病原体受控环境（23°C±2°C ，50–60％）中保持在高压粉的食物和水上的过滤式笼子中，并具有标准的12小时光– 12-H的深色循环 。根据UCSD机构动物护理和使用委员会以及NIH指南和法规进行实验 。动物协议S00218（M.K.）已获得UCSD机构动物护理和使用委员会的批准。图中指示了每个实验的小鼠数量 ，方法在方法中指示。
每小时 ，第四和第七天，每小时六次，每小时六次 ，每小时注射col iwt或col IR/r小鼠在有或没有50μgkg -1的CAE中预处理有或没有50μgkg -1的CAE 。如图11所述 ，在第11天，父母 ，NRF2E79Q ，DDR1KD，DDR1KD + NRF2E79Q ，NRF2KD或TFAMKD KPC或KC细胞被原动体注射到三个月的Col IWT或Col IWT或Col IR/R小鼠中 。手术后 ，以0.05-0.1 mg kg -1的剂量为0.05-0.1 mg -kg -1，每4-6小时 ，持续12小时 ，然后每6-8小时以0.05-0.1 mg kg -1的剂量给予小鼠皮下注射小鼠。四个星期后分析小鼠 。
三个月大的Col IWT或Col IR/R小鼠接受或没有口服烤玉米油的25％CCL4的玉米油两次 。恢复了两周后，将父母 ，NHE1KD或IKKαKDKPC或KC细胞（50μl磷酸盐缓冲盐水中的106个细胞； PBS中的106个细胞）通过内倍型注入分析转移到IWT肝脏IWT或Col IR/R小鼠的肝脏中 ，然后立即进行脾切除术10。每隔一天，用腹膜内注射或没有10 mg kg -1 EIPA（SIGMA）治疗后14天分析小鼠 。
纯合BALB/c nu/nu雌性小鼠在7周龄时在单个侧面或两个侧面处注射，并在5×105父母 ，NHE1KD ，DDR1KD或DDR1KD或DDR1KD或DDR1KD + NRF2E79Q MIA或1305细胞或1305细胞中混合或没有5×105 Wild-will-ixepe，R/R成纤维细胞用BD Matrigel（BD Biosciences）稀释1：1 ，总体积为100μl 。四个星期后收集肿瘤。为了评估IKKβ或线粒体蛋白合成抑制对肿瘤生长的影响 ，用媒介物（PBS中的二甲基亚氧化二甲基磺代）处理小鼠，ML120B（60 mg kg -1）每天通过口服gavage或Tigecycline（每天50 mg kg kg -kg -kg -kg -kg -kg -kg -kg -kg -1）每天两周进行三周介入 ，每天通过口服gavage或tigecycycycycycycycycy或intaperaperapection进行三周 。肿瘤植入一周后开始治疗 。根据数字卡尺测量值计算皮下肿瘤的体积（1/2×（宽2×长度））。如果肿瘤直径达到2 cm ，则将小鼠安乐死以避免不适 。
使用癌症基因组图集（TCGA）数据和GEPIA2平台对表达高水平和低水平的Col I – MMP的患者进行生存分析 。胶原蛋白切割的特征由MMP1，MMP2 ，MMP8 ，MMP9，MMP13和MMP14组成。使用中位截止值确定了178例PDAC患者的TCGA队列中的总生存期。
从2017年1月至2021年5月 ，在南京大学医学院的分支机构鼓塔医院 ，总共从被诊断为PDAC的患者那里获得了106个人类PDAC标本 。所有患者接受了标准的手术切除，并且在手术前未接受化学疗法 。手术切除后病理学家处理石蜡包裹的组织，并在进一步研究之前确认为PDAC。总体生存期限定义为从诊断之日到死亡或最后已知的随访检查的时间 。106例患者中有81例可获得生存信息 。该研究得到了IRB 2021-608-01的隶属型鼓塔医院的机构伦理委员会的批准。在手术前获得了组织分析的知情同意 。所有研究均根据政府政策和赫尔辛基宣言进行 。
解剖胰腺或肝脏并将其固定在PBS中的4％多聚甲醛中 ，并嵌入石蜡中。制备五微米的部分 ，并用H＆E或Sirius Red染色 。IHC如前11之前进行 。在带有Axiovision Rel的直立光/荧光成像仪A2显微镜上拍摄载玻片。4.5软件（Zeiss） 。抗体信息在补充表2中显示 。
IHC评分是在11之前进行的。负染色和弱染色被视为低表达水平，中间和强染作被视为高表达水平。对于具有两个令人满意的核心的肿瘤的病例 ，将结果平均 。对于具有质量较差的肿瘤病例 ，结果是基于可解释的核心 。在此评估系统的基础上，使用卡方检验来估计Col I – DDR1-NRF2信号蛋白的染色强度之间的关联。在扩展数据中指出了PDAC组织中每个不同染色的评估病例数和评分摘要的数量图7a 。
将野生型或R/R成纤维细胞播种在6 、12或96孔板上 。电镀后的一天 ，将细胞转换为DMEM（带有丙酮酸） ，透露透析的FBS 10％透析的FB，添加或不含500μM[3H] - 磷酸或[U-13C] - 谷氨酰胺和100μM-glutamine和100μM维生素C.细胞C培养五天 ，每24小时重新培养培养基五天。然后 ，用0.5％（v/v）Triton X-100和20 mM NH4OH洗涤1 ml或500μL或100μL，以1 mL或500μL或100μL洗涤去除成纤维细胞 。在癌细胞板条之前 ，用PBS洗涤ECM五次 。第二天 ，将癌细胞切换到指示的培养基24或72小时。
将细胞在涂有或没有ECM的盖玻片上培养，并在室温下在4％多聚甲醛中固定10分钟或在-20°C下甲醇10分钟 。如前所述，进行了细胞和组织中的大蛋白体可视化以及免疫染色 。使用Leica Application Suite AF 2.6.0.7266软件（Leica）使用TCS SPE Leica共聚焦显微镜捕获和分析图像。抗体信息在补充表2中显示 。
小鼠胰腺肿瘤组织固定在PBS中的4％多聚甲醛中 ，并嵌入石蜡中 。制备了五微米的切片 ，并在二甲苯中脱蜡，如所描述的32分级乙醇系列补充水 ，并使用水性安装介质安装 ，并用盖玻片密封。使用Leica TCS SP5多光子共聚焦显微镜对所有样品进行成像，并在整个实验过程中使用HC Apo LC 20×1.00W。将激发波长调谐到840 nm ，并使用棱镜控制的420±5 nm窄带发射来检测胶原蛋白的SHG信号 。当两个入射光的光子与胶原蛋白纤维的非中心对称结构相互作用时 ，就会产生SHG信号，这导致所得的光子是入射光子波长的一半 。使用CT-Fire软件（V.2.0 Beta）（https://loci.wisc.edu/software/ctfire）进行SHG测量。H＆E染色证实了肿瘤区域 。
从细胞和组织中制备蛋白质样品 ，免疫印迹和免疫沉淀以10,30之前进行 。通过自动X射线处理器或Kwikquant成像仪检测到免疫反应性带。抗体信息在补充表2中显示 。
将细胞与1％甲醛交联10分钟 ，并用0.125 m甘氨酸停止反应5分钟 。如上所述进行了染色质免疫沉淀测定法。将细胞裂解并在冰上超声以产生平均长度为200-800 bp的DNA片段 。预先清理后，将每个样品的1％保存为输入分数 。使用专门识别NRF2的抗体（CST ，12721）进行免疫沉淀。将DNA从复合物中洗脱并纯化 ，然后使用小鼠TFAM的引物进行PCR扩增或基因组基因群：5'-GAGGCAGGGGGGGGGGGGGGGGGGGTCTCATG-3'和5'-CAAGCTGAGTTCTATC-3'；5'- TCTGGGCCATCTTGGG-3'和5'- CCATGGGCCTGGGCTG-3' 。
使用所有Prep DNA/RNA迷你试剂盒（Qiagen）提取总RNA和DNA 。使用上标Vilo cDNA合成试剂盒（Invitrogen）对RNA进行反向转录。如上所述进行定量（Q）PCR。从NIH引物（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?link_loc=blasthome）获得的引物显示在补充表3中 。
如上所述，从野生型（n = 3）或R/R（n = 3）ECM生长的KPC样品中分离总RNA 。RNA纯度由Agilent 2100生物分析仪评估。通过与寡-A（T）磁珠（NEB，S1419S）双重孵育 ，将五百个总RNA的总RNA富集 ，并在2×Superscript III III第一股First股缓冲液中以94°C的碎片片段碎片，含有10 mm DTT（InvitRogen ，p2325） 。在25°C下进行反向转录反应10分钟 ，然后进行50°C 50分钟 。用Rnaclean XP纯化反向转录产品（Beckman Coulter，A63987）。将库与双重独特双指数（UDI）（IDT）或单个UDI（BiOO Scientific）连接 ，对11-13个周期进行了PCR放大 ，使用单侧0.8×Ampure清洁珠尺寸选择，使用Qubit DSDNA HS HS ASSAY KIT（SEMENE QUIT）（sequienq of Hexte quip）进行量化（Illumina） 。
使用Star将RNA-Seq读数与小鼠基因组（GRCM38/MM10）对齐 。在所有实验中使用生物和技术重复。使用荷马（V.4.11）进行转录本的定量 。主成分分析（PCA）是基于所有样品的所有基因的每千碱基百万（TPM）的转录本获得的 。使用ashanezerepeats.pl工具计算每个成绩单的表达值。使用homer的getDiffExpression.pl工具计算差异表达分析 。使用GSEA的分子签名数据库进行途径分析 。
从PDAC患者和1个PDAC肝转移患者的五个原发性肿瘤的样品中获得33 ，并分别分析以更好地识别细胞异质性和簇。在R（v.4.0.2）和Seurat34（v.4.0.5）中处理数据集 ，并保留了至少3个基因的基因和基因的细胞，以进行至少3个细胞中的基因 ，以进一步质量控制分析 ，以进一步的质量控制分析，以表达的线粒体基因的百分比表达，表达的总基因和独特的分子标识符（UMI）计数。在质量控制分析分析后获得的基因 - 细胞条形码矩阵 ，并鉴定3,000个可变基因并缩放以执行PCA 。然后使用“ Find Integrationanter ”和“ IntegratedAta ”功能在Seurat中使用相互PCA（RPCA）管道对五个PDAC初级患者样品进行批处理校正和集成 。再次对“集成”测定法进行了缩放以执行PCA。使用每个数据集中使用“肘图”鉴定了PCA的最重要的主要组件 。为了聚集和可视化单元格 ，在每个数据集中使用的顶部确定的主要组件都使用了“ Findneighbours ”，“ Findclusters ”和“ Runumap”功能 。
细胞类型是通过众所周知的制造商的手动注释33的33 ，即：上皮 - 肿瘤细胞（Epcam和Krt8） ，胰腺上皮细胞（CPA1和CTRB1），T细胞（CD3D和IL7R） ，髓样细胞（CD14 ，CD68，CD68 ，FCGRLY3A和LYZ和LYZ ，NK），NK（CD3D和IL7R）(CD79A and MS4A1), dendritic cells (FCGR1A and CPA3), endothelial cells (PECAM1, KDR and CDH5), fibroblasts (ACTA2, COL1A1, COLEC11 and DCN), vascular smooth muscle cells (MYH11 and ACTA2), hepatocytes (ALB, APOE and CPS1), cholangiocytes（Anxa4 ，Krt7和Sox9） ，浆细胞（JCHAIN和IGKC）和循环细胞（TOP2A和MKI67）。
M1/M2巨噬细胞被指定为35：M1样巨噬细胞（Azin1，CD38，CXCL10 ，CXCL9 ，CXCL9，FPR2 ，IL18 ，IL1B，IRF5 ，Nifkbiz ，Nifkbiz，tlr4 ，tlr4 ，tnf和cd80），以及m2-like巨噬细胞（M2-like Mocrophages）IL10RB ，IRF4 ，KIF4，MRC1，MYC ，SOCS2和TGM2） 。使用“ AddModulesCore ”功能为每个巨噬细胞群计算M1和M2特征的平均表达评分 ，并分别分配了M1或M2签名评分较高的群集，分别分配了M1样或M2样注释 。
在带有或不带ECM的12孔板上生长的细胞。代谢物提取和分析如前11 。使用配备有30 m db-35ms毛细管柱的敏捷6890气相色谱仪进行气体色谱 - 质谱法（GC-MS）分析 ，该气相色谱仪连接到70 eV时电子撞击电离下运行的敏捷5975B质谱仪 。为了测量氨基酸 ，将气相色谱烤箱温度保持在100°C 3分钟，并在每分钟3.5°C时增加到300°C。质谱仪源和四极分别保持在23°C和150°C ，检测器以扫描模式运行 ，记录了100-605 m/z的离子丰度 。如前所述36，通过整合适当的离子片段并校正天然同位素丰度来确定代谢物池中稳定同位素的摩尔％富集 。
将细胞铺在每个孔中的3,000个细胞（MIA ，1305）的密度（MIA ，1305）或1,500个细胞（KPC或KC）密度下的96孔板中，并在处理前孵育过夜。7RH（500 nm） ，ML120B（10μM） ，EIPA（10.5μm），IPI549（600 nm），MBQ-167（500 nm） ，MRT68921 ，MRT68921（600 nm）（600 nm）或ML385（600 nm）或ML385（10μm）或其组合介质（培养基），该培养基的介质（介质）介质（介质）或培养基（comment）。72 h 。用计数KIT-8分析（GLPBIO）确定细胞活力 。在450 nm处读取光密度 ，并使用具有SoftMax 6.5软件（FILTERMAX F5 ，Molecular Devices）的微型读取器进行分析。对于所有实验，每24小时更换培养基 。
在有或没有EIPA（10.5μm）的100μlcm或LG培养基的情况下 ，将KPC或KC细胞生长在带有或没有指示的ECM的96孔板上生长 ，MBQ-167（500 nm），MRT68921（600 nm）或组合24小时 。然后测量单元格。根据制造商的协议 ，用发光ATP检测测定系统（Perkinelmer）确定细胞内ATP 。最后 ，测量发光并标准化为细胞数 。
在有或没有EIPA（10.5μm），MRT68921（600 nm）的100μLLG培养基的情况下 ，将KPC或KC细胞生长在带有或没有指示的ECM的六孔板上生长。根据制造商的协议 ，使用L-氨基酸测定试剂盒（比色法，抗体）测量了总氨基酸（甘氨酸除外） 。通过将样品光密度与标准曲线进行比较并标准化为细胞数，在样品中计算了 - 氨基酸的浓度 。
通过使用Image J（NIH）中的“分析颗粒 ”特征来定量大型体体或线粒体。大型诱导摄取指数或线粒体数是由大型或线粒体面积计算的 ，相对于每个场的总细胞面积 ，然后通过确定所有磁场的平均水平（六个磁场） 。通过使用斐济图像J中的“多边形”和“度量 ”特征对肿瘤面积（％）进行量化，并通过肿瘤面积与每个田地的总面积进行计算 ，然后通过确定所有磁场的平均水平（五个磁场） 。通过使用“颜色反卷积 ” ，“ H DAB”和“分析颗粒 ”特征在fiji Image J中定量蛋白质表达的正面积（％），并通过蛋白质阳性面积与每个场的肿瘤区域进行计算 ，然后通过确定所有场的平均水平（5-6个场）来计算。这些测量是在随机选择的视野上进行的。使用GraphPad Prism软件进行了两尾未配对的学生的t检验 ，以进行统计分析 。数据表示为平均值±S.E.M.通过对数秩检验分析了Kaplan-Meier生存曲线 。通过两尾卡方检验确定人PDAC标本中Col I – DDR1 – NRF2信号蛋白之间的统计相关性。（**** p <0.0001，*** p <0.001 ，** p <0.01和*p <0.05） 。除了对106个人类标本的IHC分析以外的所有实验至少重复3次 。
有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然研究报告摘要中获得。
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本文概览： 将所有细胞在37°C的加湿腔室中孵育，含5％CO2。MIA PACA-2（MIA），UN-KPC-960（KPC）和UN-KC-6141（KC）细胞，野生型和R/R成纤维细...
文章不错《依赖性DDR1信号传导决定胰腺癌结果》内容很有帮助