通过鼻裂纤维刷从鼻turpinate收集的遗传筛查和呼吸性上皮细胞的外周血样品是从受影响的个体和健康志愿者中获得的。街头儿童健康研究所（Rec 19/NW/0171 ，IRAS 261511 ，西北利物浦东部研究伦理委员会） 。在入学之前，所有参与者获得了知情书面同意 。根据欧洲呼吸学会（ERS）诊断指南 ，受影响的个体被诊断为PCD 51。
如前所述42对单个ID01进行了遗传筛查 ，并通过对个体ID02，ID03和ID04使用有针对性的下一代测序面板52进行了遗传筛查 。根据ERS诊断准则51获得了确定的遗传诊断 ，涉及在每种PCD基因中鉴定出双质致病变异（在每种情况下在纯合状态下发现） ，这是每种PCD基因一致的TEM观察到的每个缺陷 。
对于先前报道的C.853G> ODAD1中的替代物，第一个个体（ID01）是纯合的 ，该替代导致内含子插入最终导致下游无义密码子（P.Ala248THRFS52*）42。第二个人（ID02）携带纯合c.448c> t替代 ，该替代物引入了ODAD1（P.ARG150*）的过早停止密码子，并且以前与PCD53相关 。第三个人（ID03）在CCDC40中具有纯合外显子1-3删除，第四个人（ID04）具有纯合5个基本对删除（C.1964_1968DELCTCTTT）（CCDC39 CCDC39） ，在CCDC39中引入了通过FRAMESHESTIFT（p.glulusefs frameshift（p.glulusef）介绍了一个早期的停止代码 。235555555555555555。
鼻皮细胞的TEM在英国莱斯特大学进行 。通过鼻刷获得的细胞在索伦森的磷酸盐或0.05 m cacodylate缓冲液中固定在2.5％的戊二醛中超过24小时 。随后将样品在嵌入2％琼脂中之前 ，将样品在1％四氧化os中孵育。使用酒精系列将样品脱水，其中包括在嵌入环氧树脂中增加浓度的乙醇/甲醇和氧化丙烷。切割超薄切片并用乙酸铀酰和雷诺的柠檬酸铅染色 。使用室温JEOL 1400+传输电子显微镜获取图像 。在扩展数据中提供了代表性示例图7C。
通过高速视频显微镜获得了纤毛呼吸上皮的视频 ，并使用MATLAB R2022A（MATHWORKS）设计的程序根据以前的出版物进行了分析 。54,55 。简而言之 ，记录了纤毛的底部和纤毛尖端在节拍周期的活动阶段的开始和结束时。通过快速的傅立叶变换和视频响应术计算睫状节拍频率 。该分析允许计算睫状节拍模式参数，例如纤毛长度 ，跳动角度和跳动幅度 。睫状节拍幅度每秒（跳动振幅×睫状节拍频率）先前被描述为识别有PCD55和没有PCD55的个体之间的最佳方法。我们分析了来自11个人的104个没有PCD的视频作为对照 。
如前所述56 ，从鼻丝刷的视频中计算出上皮破坏评分 。简而言之，在每个样品中鉴定出上皮边缘 ，研究了突起或异常 ，并从1到4分，其中1表示正常的纤毛边缘 ，2表示纤毛边缘带有较小的投影 ，3表示带有主要投影的纤毛边缘，4个用于单个，单位 ，固定的 ，纤毛的细胞。
将含有胶原蛋白涂层的井（Purecol，Sigma-Aldrich ，5006-15mg）播种为含有pneumacult-ex Plus培养基（Stemcell Technologies ，05040）的细胞（健康个体和四个个体的PCD）的细胞 。将细胞传递两次：一旦进入T25烧瓶，然后进入12个Transwell插入物 ，每个插入物的表面积为1.12 cm2（Corning ，CLS3460），密度约为0.5-10亿个细胞 。将细胞培养在肺气酸ex加培养基中 ，直到融合为止 ，此时，基底腔室中的培养基被肺化培养基（Stemcell Technologies ，05001）代替 ，并且顶部表面暴露以提供空气 - 液体界面（ALI）。所有培养基均含有原蛋白（Invivogen，ANT-PM-05）和青霉素 - 链霉素（Thermo Fisher Scientific，15070063） ，以防止细菌的生长。过渡到ALI后4-6周观察到纤毛 。在分化过程中 ，每2-3天对基底外侧培养基进行一次刷新，并用PBS洗涤顶部表面以去除粘液 。
在分解之前 ，将分化的ALI培养物用PBS两次洗涤5分钟 ，以去除细胞碎片和粘液。然后将冰冷的PBS添加到培养皿的两个隔间中，然后将菜放在冰上 。5分钟后 ，除去PBS溶液和50μl冰冷的断裂缓冲液（10 mM Tris pH 7.5 ，50 mm NaCl，10 mM Cacl2 ，1 mm EDTA ，0.1％Triton X-100，7 mmβ-cercapto乙醇 ，1％蛋白酶抑制剂蛋白酶抑制剂cocktail；孵育2分钟而不会发抖后 ，将含纤毛的溶液转移到微量离心管中 。重复此过程六次，以确保收集所有分离的纤毛。通过在4°C下以1,000g离心1分钟来除去细胞碎屑和粘液 。通过以15,000g离心在4°C下以15,000克离心5分钟收集轴突 。将轴突颗粒重悬于缓冲液中（30 mm HEPES pH 7.3，1 mm EGTA ，5 mm MGSO4 ，0.1 mm EDTA，25 mm NaCl ，1 mm二硫代硫醇 ，1％蛋白酶抑制剂鸡蛋鸡肉鸡肉cocce），液体氮气中的闪光液体固定 ，并储存。
C. reinhardtii（CC-1690）藻类在室温下在室温下在12 h：12 h的光中培养在室温下的标准三角磷酸盐培养基中：黑暗循环 。如前所述57 ，使用二氨甲蛋白方法57从C. reinhardtii中提取鞭毛 。去除细胞体后，通过以3,000克离心15分钟来收集上清液中的分离的鞭毛。如前所述5 。简而言之 ，首先在新鲜的HMDEKP（30 mM HEPES ，25 mM KCl，5 mM MGSO4、0.5 mM EGTA ，蛋白酶停滞（G-Biososciences））中去除鞭毛膜 ，通过在4°C下在4°C下添加1％NP-40，同时旋转30分钟 。清洗洗涤剂和其他可溶性蛋白后，通过用10 mM MG2+ATP2--和750μMCACL2在HMDEKP中在室温下以10 mM MG2+ATP2-和750μMCaCl2处理 ，以0.5 mg mL -1的终浓度散布轴突。通过在2,500G处离心浓缩散布的轴突 ，并立即用于制备低温EM网格。然后将2.5μl在16–26 mg ml-1处使用2.5μl的轴突样品，将其用于玻璃体标记IV（Thermo Fisher Scientific）内的发光含量C-FLAT 1.2/1.3-4CU网格（原子） 。然后将冷冻EM样品孵育10 s ，将10 s印迹 ，然后浸入液氮冷却的液态乙烷中 。
在280 nm为5.8时具有吸光度读数的人轴突（3μL）被应用于发光的量化量化量孔碳网格（R2/1，R2/1 ，铜 ，400网格，Quantifoil Micro Tools ，Q410CR1）。将网格用10–11 s的湿度在100％的湿度中斑点10-11 s ，然后使用Vitrobot Mark IV（Thermo Fisher Scientific）将其浸入液体乙烷中 。
在与我们先前的研究相同的条件下，使用Serialem（Themo Fisher Scientific）上所述的Serialem ，总共收集了36,918个显微照片的骨骼c. reinhardtii轴突 。显微镜设置在扩展数据表1中总结了。
除非另有说明 ，否则所有图像处理均使用RISION-3.1（参考文献59）或RELION-4.0（参考文献60）进行 。使用MotionCor2 Software将剂量分级的图像堆栈对齐并加权剂量加权61 。CTFFIND4用于估计对比度传输函数（CTF）62的参数。总共31,275个显微照片在不存在冰污染，刺环的质量以及显微照片中张开的轴突的存在的基础上幸存了质量控制 。微管（包括DMT和SINGLET微管）通过定义其相关的启动和终端坐标来手动挑选在每个显微照片上 。避免了重叠的微管。将所选的微管分为重叠框（200×200像素，bin 2） ，在相邻盒之间具有82-Å非重叠区域（步长） ，对应于tubulinα/β-heterodimer的近似长度 。总共提取了8,546,747个8 nm颗粒，并通过多个2D分类的多个回合对齐 ，其中106,857个颗粒落入了丢弃的较差的类别 。使用以DMT为中心的方法13和以ODA为中心的方法5分析了其余的8,439,890个颗粒（补充图1-3）。在以DMT为中心的方法中 ，8 nm颗粒进行了3D细化和分类，以选择具有良好分辨DMT密度的2,058,898个颗粒。在600像素盒中重新提取这些颗粒 ，即3D重新精制 ，CTF重新精制，抛光和CTF再次进行了缩减 。在以ODA为中心的方法中 ，8-nm颗粒接受了3D细化和分类 ，以产生三个ODA结合的类别 。这三个类别对应于地图中居中的ODA，两个类别从中心移动±8 nm。重新提取了中心的类 ，以将ODA置于地图中的中心 ，以生成“ 24 -NM粒子”集 。为了最大化粒子数， 我们从这组中提取了24 nm和48 nm的新颗粒 。第二轮的3D细化和分类产生了1,028,815 24 nm颗粒，具有中心的ODA。然后重新提取这些颗粒 ，而不会在600像素盒中降低缩放 ，该盒子是第二次进行了3D修饰，CTF重新精制 ，抛光和CTF进行了缩放 。
对于以DMT和以ODA为中心的方法 ，通过使用3D分类，使用a-pulule Protifiarments a08 – A13的掩码获得了48 nm重复的地图 ，其中MIP具有48 nm MIP的周期性13 。对于以DMT为中心的方法 ，这产生了48 nm重复的六个不同的注册表，对于以ODA为中心的方法 ，确定了先前确定的24 nm重复映射的两个注册表。然后 ，我们使用第二轮3D分类获得了96 nm的地图，其中使用自定义掩码在外部轴突络合物上 ，包括RSS ，N-DRC底板和IDAF，从以DMT为中心的方法中得出12个不同的注册表，以及来自ODA中心方法的4个不同的注册表 。
为了克服样品制备过程中构象异质性和单个复合物的丧失 ，在感兴趣区域以外的信号减法后 ，通过3D分类和细化分析了每个轴突复合物（补充图4-9） 。在适当的情况下，通过合并来自不同注册表的减法颗粒以及以DMT和ODA为中心的方法获得地图。当组合颗粒时 ，使用严格的对照来防止粒子重复 。
使用包含IDA ，ODA和N-DRC的3D细化的未掩盖框600参考地图将单个轴突复合物的聚焦图定位在DMT上 。由于分辨率低，IDAB和IDAE的运动域是IDAG的副本 ，它是其他含Centrin的IDA的副本。然后将地图合并到单个复合图中 ，该图使用Chimerax63中的“ VOP Maxix ”命令覆盖了DMT的96 nm部分。然后使用Chimera的子区域选择工具裁剪初始的复合图，以删除空区域并减少文件大小 。
在与我们先前的研究64相同的条件下 ，使用Titan Krios显微镜（Thermo Fisher Scientific）获得了37,071个显微照片的人类呼吸DMT 。显微镜设置在扩展数据表1中汇总。视频分别使用MotionCor2（参考文献61）和CTFFIND4（参考文献62）进行了运动和CTF校正 。16,933个显微照片在质量控制中幸存 。使用Relion手册拾取从显微照片中选择了微管的起点和终点。从512像素盒中的显微照片中提取2,582,833 8 nm颗粒 ，降低到256像素盒以加速计算 。进行了2D分类以检查图像质量，而不是排除粒子 。
牛呼吸道DMT（EMD-24664）37的15Å分辨率图被用作3D细化的初始参考 ，然后进行3D分类而无需图像对齐 ，以排除不良颗粒。为了增加保留颗粒的数量，我们重复了该过程，并合并了所有良好的颗粒 ，同时排除了重复 。总共将1,903,665个8 nm颗粒保留并重新提取而无需嵌套 。然后使用3D分类从8 nm颗粒中产生16 nm颗粒 ，并在内部连接附近重复MIP上的圆柱掩模。随后，使用3D分类从16 nm的颗粒中产生48 nm颗粒 ，并在48 nm重复MIP上的圆柱掩模在A小管的接缝附近产生 。最后 ，使用3D分类从48 nm颗粒中生成96 nm颗粒，并在96 nm重复轴突蛋白上的圆柱膜上在原生膜A02-A03上重复轴突蛋白 。这导致96 nm中的两个部分重复使用90,482和87,789个颗粒。然后 ，使用60种不同的圆柱面膜进行局部改进 ，每个遮罩对应于2或3个原丝的16 nm纵向截面，以改善原丝的分辨率和密切相关的微管结合蛋白。每个面膜内的分辨率提高到3.3–3.8Å 。使用粒子重心 ，3D分类 ，以面膜为中心的局部细化和多体细化，改善了外部轴突配合物的地图质量 。在补充图14中列出了所得的地图及其标称分辨率（基于FSC = 0.143标准）。仅观察到13,340个含ODA的颗粒 ，这阻止了对我们的Reinhardtii Dataset进行的不同构象状态的分析 。使用phenix_autosharpen对地图进行后处理 ，并合并在Chimerax中以生成复合图 。补充图13中提供了处理方案的示意图。
在与野生型相同的条件下，在Titan Krios显微镜上收集了CCDC39和CCDC40突变患者的呼吸DMT的冷冻EM数据，分别产生3,423和3,483个显微照片 。在配备有K3检测器（GATAN）的TALOS ARCTICA显微镜（Thermo Fisher Scientific）上收集了来自ODAD1突变患者的呼吸DMT的冷冻EM数据 ，分别产生56和146个显微照片ODAD1和146个显微照片 。在-1.0μm和-2.2μm之间收集数据 ，并以×36,000的标称放大倍率收集数据，产生的像素大小为1.1Å。每个显微照片被将50个视频帧分数分配为每Å2的总剂量为52.562个电子 。数据处理遵循为野生型数据集建立的计划（补充图13） 。为了进行CCDC39和CCDC40突变体的数据处理 ，随机选择了约280,000个8 nm颗粒 ，并用于生成48 nm图。以相同的方式处理相同数量的野生型颗粒以生成匹配的控制 。将三个48 nm图低通滤波至8Å，以在图6E中进行比较 。对于ODAD1突变体的数据处理 ，分别为ODAD1废话突变体和剪接突变体提取了12,884和35,541 8 nm颗粒。由于颗粒数有限 ，仅生成8 nm图。ODAD1突变图和8 nm野生型图（来自上述280,000个颗粒）被低通滤波至12Å，以在图6d中进行比较 。
通过结合先前的结构 ，AI引导的结构预测65 ，Cryo-Et研究3,24,39,41,66,66,67,68和使用COOT69的DE NOVO建模来解释Reinhardtii DMT的地图 。先前的结构用于建模DMT及其相关的MIP（PDB：6U42）13，RS1和RS2（PDB：7JTS ，7JTK和7JU4）14 ，N-DRC底板（PDB：7JU4）14和ODA和其Docking Complect（PDB：PDB：7KZM和7KZM和7KZM和7KZM和7KZM和7KZM和7KZM和7KZM和7KZM）6l4p）70。使用C1（PDB：7SQC）15和C2（PDB：7SOM）的模型15微管制作图1B 。使用Alphafold2（参考文献71），使用植物杂志V.13和Uniprot的主序列获得了其他轴突蛋白的结构预测 。使用Swiss-Model72生成了Dynein运动结构域（包括接头，AAA+模块 ，茎和微管结合结构域）的同源模型 ，因为它们太大，因为它们太大而无法由Alphafold2建模 ，因为它们太大了。使用AlphaFold2 Multimer73对蛋白质 - 蛋白质相互作用进行建模 。使用Alphafold2多聚体建模的子复合物的示例在补充图2中显示 。10–12。通过使用Chimerax63或COOT69将轴突络合物从建模蛋白和亚复合物组装而成 。Reinhardtii（EMD-6872）24的96 nm重复重复的亚图平均图用于帮助定位IDAB和IDAE的运动域 。使用多个回合的AlphaFold2多聚体预测来改善相邻蛋白质之间的界面。最后 ，使用COOT将所有链条合并到一个PDB文件中，并给出了唯一的链ID 。在补充表1中提供了在这项研究中鉴定出的蛋白质 ，并在补充表2中给出了其放置的理由 。
我们的样品制备方法的张开方法导致轴突动蛋白失去与相邻DMT的联系。结果 ，我们没有观察到轴突动力蛋白的微管结合结构域的密度，但我们将它们包括在模型中以进行完整。通过拟合接头 ，单个AAA+模块以及可能的茎的底部 ，将运动结构域的同源模型定位在观察到的冷冻EM密度中 。与邻近DMT的连接丧失也可能导致动力蛋白电动机相对于完整纤毛的构象的细微变化 。因此，可能需要对模型进行少量调整 ，以模拟完整轴突的子图平均图。此外 ，尽管我们观察到了reinhardtiiβ-HC的两个不同构象状态，如先前所述5，但我们仅建模了茎向近端末端延伸的方向 ，因为这种构型在Intact Axonemes74中最常见的ODA结构中最常见 。
为了构建Axoneme 9+2架构的模型（图1B） ，我们使用了DMT1（EMD-2113），DMT2-8（EMD-2132） ，DMT9（EMD-2118）3（EMD-2118）3的亚图平均图（EMD-2118）3和中央设备（EMD-31143）75 ，和EMD-6756（EMD-6756）（29） 。其他。
最初，人类DMT 48-nm重复（PDB：7UNG）的两个副本拟合了人类96 nm重复的图 。这揭示了一个额外的MIP ribc1 ，该MIP在48 nm重复中被错误地分配为RIBC2 。然后 ，由C. renhardtii 96-nm重复的模型来指导外部轴突复合物的建造，并发表了牛ODA-DC（PDB：7RRO）37和鼠标RS头（PDB：7DMP）76的模型。从爆炸搜索的结果（可从http://chlamyfp.org/)77中获得的结果 ，可以鉴定出Reinhardtii轴突蛋白的人类同源物 。通过AlphaFold2多聚体预测人蛋白的子复合物 ，并将其放置在冷冻EM密度中 。补充表3中提供了定位蛋白的完整列表。在补充表4中给出了无明确同源性蛋白质的理由 。
对于这两种结构，使用COOT ，NAMDINATOR78和PHENIX79中实现的真实空间改进进行了优化 。完善C. renehardtii DMT的96 nm长原子模型所需的计算记忆要求意味着无法进行全原子的细化。取而代之的是 ，在合并到最终的PDB文件中之前，单独完善了三个子区域。较小的人类模型被改进为Phenix中的单个PDB文件 。使用Phenix79完善了两种模型的原子位移因子 。天冬酰胺，谷氨酰胺和组氨酸残基的侧链自动翻转以改善氢键网络。使用phenix.molprobity80生成96 nm模块重复的模型统计数据 ，并在扩展数据表1中提供 。
使用Chimerax63生成了显示冷冻EM图或原子模型的图形面板和视频 。使用依赖生成了由局部分辨率颜色的地图。使用Clustal Omega81计算多序列比对和系统发育树 。将图形绘制在GraphPad Prism（GraphPad软件）中 。使用R V4.0.3计算了优势比（图3A）。该项目中使用的软件由SBGRID82管理 。
从患者获得的基因组样本和测序数据存储在伦敦大学学院 。通过UCL Great Ormond街儿童健康研究所管理的UCL Living Airway Biobank中 ，气道电池是生物群。
有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得 。
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文章不错《轴突结构揭示了调节和疾病机制》内容很有帮助