如前所述6
，从来自北美和欧洲的患者的CRC肿瘤组织标本中分离出镰刀菌菌株。简而言之，将组织切片用手术刀切碎 ，并在选择性刺激性的Anaerobe琼脂（FAA）板上（Oxoid
，Thermo Fisher Scientific），补充了7％或​​10％的降压马血液（DHB; Lampire; Lampire; Lampire生物实验室 ，Fisher Scientific
，fisher Scientific）at josamycin and vancymycin and Norflocomycin和Norflosomcin in grfancomycin and norffancomycin和Norflocomycin，分别（Sigma Aldrich） 。在厌氧条件下（厌氧气体产生系统 ，Oxoid
，Thermo Fisher Scientific）在37°C下在37°C下孵育板，并每2天检查一次生长
。采摘菌落并进行条纹纯化 ，并在选定的细菌菌落上进行菌落PCR
，如先前用16S rRNA基因通用引物（342F和1492R）所述6。将菌落PCR产物用于Sanger测序，并使用痕量序列的BLASTN分析来证实细菌种类的身份 。将培养物悬浮在胰蛋白酶大豆汤（TSB）和40％甘油中 ，并储存在-80°C下
。 　　如前所述44，从口腔微生物学（KCOM）收集的韩国口腔微生物学（KCOM）收集中分离出fusobacterium菌株。来自ATCC和KCOM存储库的菌株是从补充维生素K1的Schaedler琼脂平板上的Amboules生长的
，并获得了5％的去纤维化绵羊血（Becton Dickinson）和FAA板（Oxoid，Thermo Fisher Scientific） ，补充了7％DHB（Lampire Biologologic Laboratories
，Fisherecitial，Fisherericific） 。将板在Bactron600厌氧室（Sheldon Manufacturing）中在37°C下孵育5-7天
。将培养物悬浮在Schaedler肉汤中 ，含维生素K1和30％的甘油
，并储存在-80°C下。 　　Fusobacterium strains were cultured under anaerobic conditions at 37 °C (AnaeroGen Gas Generating Systems, Oxoid, Thermo Fisher Scientific) for 48–72 h on FAA plates (Oxoid, Thermo Fisher Scientific) supplemented with 10% DHB (Lampire Biological Laboratories, Fisher Scientific) and plates for CRC-associated strains were further supplemented with josamycin,3、4和1μgml -1分别在3 、4和1μgml -1（Sigma Aldrich）处 。使用Masterpure Gram阳性DNA纯化试剂盒（Epicenter，Lucigen）提取高分子量基因组DNA
。将来自两个板的细胞重悬于1.5 mL 1×PBS中 ，并通过离心收集。按照制造商的说明处理颗粒
，通过将所有试剂量加倍并去除涡旋步骤以防止DNA剪切进行修改 。使用量子荧光计（Thermo Fisher Scientific）对高分子量基因组DNA进行定量。 　　单分子实时测序18在明尼苏达大学基因组学中心的PACBIO续集仪器（Pacific Biosciences）或PACBIO续集II仪器（Pacific Biosciences）上进行
。使用微生物组装管道处理太平洋生物科学的Smrtanalysis Pipeline v.9.0.0.0.92188中的微生物组装管道。根据需要使用Flye Assembler v.2.8（https://github.com/fenderglass/flye）进行其他组件 。 　　将镰刀杆菌的基因组亚属性扩展到物种水平，并根据单个标记基因的累积分数进一步将FN基因组进一步从亚种水平
。使用了先前用于螺杆分型的标记基因：16S rRNA基因 ，RPOB和锌金属蛋白酶基因30。从每个完整的
，封闭的基因组，其物种或亚种分类中 ，首先分别由所有三个标记基因分析 。使用BLASTN分离并分析了每个标记基因，并指出了百分比身份的最高命中
。对于每个可能的物种或亚种
，计算置信度评分为一致的亚种结果的数量除以存在的标记基因的数量。对于每个基因组，其最终分类取决于最高置信度评分 。在补充表1中指出了该分析的结果
。使用补充表2中列出的GTDB-TK（参考文献64; https：//github.com/ecogenomics/gtdbtk）进一步测试系统发育分类。 　　使用ANVI’O Workflow21 ，Ppanggolin Tool51和Gig-Map工具（https://github.com/fredhutch/gig-map）进行了Pangenome分析
，以表征135 FN基因组的FN Pangenome，以表征FNA pangenemes跨51 FNA基因组的FNA Pangenome 。对于FN基因组 ，将ANVI’O阈值设置为MINBIT为0.9
，MCL为2，Ppanggolin阈值设置为90％的身份和90％的覆盖率
。对于FNA基因组 ，将ANVI'O阈值设置为MINBIT为0.9
，MCL为7，Ppanggolin阈值设置为90％的身份和90％的覆盖率。对于这两个基因组集 ，GIG-MAP都使用默认设置运行 。panggolin的对齐功能用于将ANVI'O基因簇映射到相应的panggolin节点。为了评估pangenome的大小
，随着采样基因组的数量增加，将FN和FNA ANVI'O衍生的pangenomes独立采样 ，以分别从1到1至135个基因组和1至75个基因组进行了最多10,000或其他随机取样的组合
。这种方法是由利基市场和进化枝属于适当的。 　　使用肌肉聚类算法通过Mega X（参考文献65）对齐单个基因和蛋白质序列，从中产生了最大样品模型的树状图 。K-MER大小为13的KSNP3（参考文献45）
，导致核心K-mers的比例为0.217，用于生成我们集合中135 FN基因组的最大样本系统发育
。最终图像是使用生命工具v.5（参考文献66）生成的最终图像。 　　为了查询我们在FN基因组集合中存在规范FN毒力基因的存在 ，我们将跨原核生物的操纵子上下文化以最小百分比的身份标识阈值60％
，以发现同步工具（https://github.com/fredhutchub.com/fredhutch/octapus） 。 　　使用原核抗病毒定位器67查询了先天细菌防御系统的存在，并使用Phage搜索工具增强的Release 68,69工具分析了完整的预言
。 　　FN ANVI'O衍生的基因含量的PCA是在基因簇存在下 - 使用R PRCOMP函数在stats软件包中 ，v.3.6.2进行的。FNA甲基化核苷酸基序的PCA使用r factoExtra软件包中的PCA函数
，v.1.0.7进行甲基化基序 - 放弃基质（补充表7） 。 　　人类结肠癌上皮细胞系HCT116购自ATCC
。细胞系没有认证。使用支原体支原体检测试剂盒（R＆D Systems）进行了支原体测试 。将HCT116细胞与补充10％（v/v）胎牛血清（Sigma）的-g谷氨酰胺（康宁）中培养在McCoys 5A中，并在5％CO2中在37°C下孵育
。将HCT116细胞以1.25×106个细胞在每个孔的底部（Nunclon Delta表面 ，Thermo Scientifitific）的玻璃盖玻片上播种到6孔板中
，并允许粘附16小时。在McCoys中制备了FNA C1（SB048，KCOM 3363和KCOM 3764）和FNA C2（SB001 ，SB010和KCOM 2763）菌株的FNA C1（SB048
，KCOM 3363和KCOM 3764）的培养物 。用5 µg mL-1 FM 4-64FX（分子探针）染色细菌膜。每种细菌菌株与HCT116细胞在井中以100：1的多种感染为单位
。将这些细菌 - 核培养物在37°C的5％CO2中孵育3小时。通过为每种菌株制备连续稀释液，并在FAA平板上（Oxoid ，Thermo Fisher Scientific）补充10％DHB（Hemostat，Fisher Scientific）
，在时间（t）= 0，t = 1.5和t = 3 h评估细菌生存力 ，并通过准备串行稀释液 。将板在Bactron600厌氧腔（Sheldon Manufacturing）中在37°C下孵育2天
，直到计数菌落
。孵育后，将孔用带动旋转的PBS洗涤四次 ，以去除未附加的细菌和HCT116细胞。在室温下
，将细胞固定在PBS中的4％多聚甲醛中30分钟 。固定后，将细胞在PBS中洗涤3次 ，然后在室温下用0.2％（v/v）Triton X-100透化4分钟
。将细胞在PBS中洗涤3次
，然后在室温下染色20分钟，每毫升固定细胞染色剂（Invitrogen）和Actingreen 488 Readyprobes（Invitrogen） ，以染色DNA和肌动蛋白
，肌动蛋白，染色剂固定细胞染色（Invitrogen）和肌动蛋白 ，染色20分钟。 分别 。解剖显微镜用于视觉上确认处理后的细胞保留在盖玻片上
。使用Leica SP8共聚焦激光扫描显微镜（Leica）查看样品以获取图像。使用63×油透镜和以下参数获取每个共培养的三个Z-stacks：1,024×1,024分辨率，像素尺寸100.21 nm
，速度600，变焦因子1.9和z-step 0.3 mm 。 　　与FNA C1（SB048 ，KCOM 3363和KCOM 3764）或FNA C2（SB001
，SB010和KCOM 2763）共孵育的HCT116细胞细菌 - 核核共培养的共聚焦Z-stacks被进口到IMARIS中
。所有测量均在每个生物学重复的三个不同的Z堆栈上进行，并具有三个生物学重复。在Imaris中 ，使用FM 4-64FX膜染色的荧光创建细菌表面体积（表面细节0.223 mm
，使用最大球的直径为0.5 mm） 。真核细胞检测工具用于使用核染色和肌动蛋白染色来定义和ID细胞。细胞核被种子点分裂
。将检测到的真核细胞导出以形成细胞表面掩模。为了定义细胞内细菌细胞，细菌表面通过到真核细胞表面的最短距离（最小到-0.0000001到真核细胞膜） 。这种新的分类被导出为一种新的“细胞内细胞细胞”表面
。为了评估具有细胞内细菌的真核细胞的数量 ，计算了由真核细胞表面掩模定义的物体数量的数量
，并计数由“细胞内细菌细胞 ”表面掩模定义的内部物体。通过使用GraphPad Prism v.7.0软件（GraphPad Software）应用Welch的t检验，对HCT116细胞与细胞内FNA细菌细胞的HCT116细胞百分比进行了比较 。 　　FNA C1和FNA C2应变细胞尺寸是使用Fiji和Biotormats插件测量的（要导入Leica.lif文件）
。首先 ，通过进行分析
，然后设置比例，然后将1 mm设置为等于9.979像素（像素尺寸100.21 nm）来设置图像的比例。然后使用徒手直线工具从每个细胞膜污渍上的最明亮点捕获测量 。通过使用GraphPad Prism v.7.0软件（GraphPad Software）应用Welch的t检验 ，对细胞长度和细胞宽度进行了细胞长度和细胞宽度的比较
。 　　FN菌株SB010和KCOM 3764在补充10％DHB（Fisher Scientific）的FAA板上（Oxoid，Thermo Fisher Scientific）生长。将板在Bactron600厌氧室（Sheldon Manufacturing）中在37°C下孵育2天 。随后在FAA+10％DHB板上制备随后的草坪
，并在Bactron600厌氧腔中在37°C下孵育2天
。将细胞重悬于TSB（Becton Dickinson）中，并在600 nm（OD600nm）为0.5时标准化为光密度。对于每种条件 ，将培养物分为一式三份
，并在37°C下在厌氧条件下孵育4小时 。条件如下：单独使用TSB肉汤，补充了50 mm 1,2-PD（Fisher Scientific）和20 nm维生素B12（Fisher Scientific）或补充15 mM EA（Fisher Scientific）和20 nm Vitamin b12的TSB ，在37°C的情况下在Anaerobic条件下37°C持续4 h。在相同条件下
，在补充20 nm维生素B12的TSB中进一步孵育SB010
。细胞在8,000 r.p.m.持续5分钟，并以1×PBS洗涤一次 ，并在相同条件下再次颗粒。然后将细胞洗涤一次在Rnalater（Thermo Fisher）中
，然后再次颗粒，并在-80°C存储之前除去所有上清液 。使用rneasy提取试剂盒（QIAGEN）提取RNA ，以用核糖剂加RRNA耗竭的光明滞留的RNA文库制备
。将RNA库测序为最低读数为1200万个配对读数。 　　购买了多个肠道肿瘤（APCMIN +/-）小鼠（Jackson Laboratory
，No. 002020菌株） 。年龄在6-8周龄的雌性小鼠进行了两项实验试验，每个试验都有三个治疗臂
。将小鼠随机分配到治疗臂。在饮用水中用链霉素（2 mg ml -1; Sigma aldrich）处理小鼠7天 ，然后在饮用水中用1.5％葡萄糖硫酸钠（MP Biomedical）处理7天，以诱导结肠炎并促进结肠肿瘤 。然后向小鼠提供正常水24小时
，然后再接受口服FNA菌株
。治疗臂1只小鼠每只接受200 µL的PBS车辆对照，每只手臂2只小鼠在200 µl体积中接受1×109 FNA进化枝1（FNA C1）细胞 ，并且每只ARM 3小鼠在200 µl体积中收到1×109 FNA进化枝2（FNA C2）细胞。FNA C1浆料是菌株KCOM 3363
，KCOM 3764和SB048的均等混合物，而FNA C2浆液是菌株SB001 ，SB010和KCOM 2763的均等混合物 。选择菌株混合物而不是单链代表
，而不是单链代表来捕获更大的FNA叶酸属性基因比例
。FNA菌株在补充10％DHB（Fisher Scientific）的FAA板（Oxoid，Thermo Fisher Scientific）上生长。将板在Bactron600厌氧室（Sheldon Manufacturing）中在37°C下孵育2-3天 。随后在FAA+10％DHB板上制备随后的草坪 ，并在Bactron600厌氧腔中在37°C下孵育2天。对于每个FNA菌株
，将细胞重悬于PBS中
。根据od600nm = 1的每个菌株的菌落形成单位标准化的OD600nm，以od600nm的标准制备应变混合物（FNA C1：KCOM 3363 6.71×107 ，KcOM 3764 7.27×1072763 1.82×108）
，每种FNA C1和每个FNA C2菌株的细胞混合物相等。监测小鼠直到终点（大量后6周） 小鼠年龄15-17周 。弗雷德·哈钦森癌症中心动物护理和使用委员会批准了所有实验方案（IACUC Proto202100004）
。所有动物工作都符合相关的道德准则。将小鼠放在12小时的光/12小时黑暗周期中，温度（65-75°F（约18–23°C））和湿度（40–60％） 。最大肿瘤大小取决于明显的肿瘤数量（1个肿瘤 ，最大直径2厘米； 2个肿瘤，最大直径为1.5 cm；≥3个肿瘤
，最大肿瘤，在兽医酌情下最大） ，这些限制不超过
。通过病理学盲目评估所有小鼠的肠道（n = 8）的肠道腺瘤负荷。为了通过治疗组来评估肠道腺瘤负荷的差异
，通过使用GraphPad Prism v.7.0软件（GraphPad软件）应用单向方差分析来计算P值 。 　　代谢组学分析是使用代谢组学提供者代谢物对第二种小鼠研究的小鼠肠道组织切片的超高表现液相色谱 - 转向质谱法进行的（n = 4）
。Mepabolon使用的全球发现面板包括70个主要途径中的5,400多种代谢产物，包括真核和细菌起源的代谢产物。代谢途径富集分析是由Metabolon进行的 。进一步的分析 ，包括对检测到的代谢产物和热图聚类的部分最小二乘分析
，并使用Mepaboanalyst70，v.5对样品纳向数据进行了分析
。 　　根据制造商的说明 ，使用Zymo Quick-DNA MicroPREP试剂盒（Zymo Research）从小鼠粪便样品中提取DNA。如先前所述
，使用自定义的Taqman底漆和探针组来扩增梭杆菌DNA（综合DNA技术）71 。将每个反应中小鼠粪便基因组DNA的输入量归一化的循环阈值（CT）值，并在20 µl的20 µl反应中进行分析 ，其中包含1×最终浓度的Taqman unises unises unises PCR Master Mix（Applied Biosystems）和Fusobactium Tapman prbr Primer primer和Primer primer和96-wee in in in ccr and a primer and a in a in a a in taqman noverse pr。每个定量PCR运行中都包括阳性对照和非组板对照
。在具有纯FNA C1和FNA C2 DNA输入的标准曲线生成后
，估算了梭菌拷贝数。使用以下反应条件在95°C下进行10分钟，在95°C时在95°C和60°C下1分钟15 s的40分钟 ，使用量化3实时PCR系统（Applied Biosystems）进行扩增和检测DNA 。使用自动设置（Applied Biosystems）计算CT
。Taqman分析的底漆和探针序列如下：五杆属前向底漆，5'-AAGCGCGCGCGTCTAGGTGGTGGTGGTTATTATGT-3';Fusobacterium属反向引物
，5'-TGTAGTTCCGCTTACCTCTCCAG-3';梭菌属FAM探针，5'-CAACGCAATACAGAGTTGAGCCCTGCATT-3'。 　　生物学PM10板和相应的IF-0A和IF-10B溶液在4°C的厌氧条件下预先降低过夜（厌氧气体产生系统 ，Oxoid
，Thermo Fisher Scientific） 。FNA菌株在补充10％DHB（Fisher Scientific）的FAA板（Oxoid，Thermo Fisher Scientific）上生长
。将板在概念1000厌氧室（Bakerruskinn）中在37°C下孵育24小时。在这种相同的厌氧条件下 ，将FNA细胞重悬于2 mL预先降低的IF-0a中
，并根据Biolog建议在所有样品中归一化为OD600NM = 0.179 。通过将0.75 mL的归一化细菌悬浮液与11.25 mL混合B（100 mL预先降低IF-10B和1.2 mL染料混合D和11.18 mL预先降低的无菌水）与最终体积为12 ml的液体来制备最终悬浮液
。对于每个PM10板井，加入了100μl的最终悬浮液。然后将PM10板在室温下在有氧条件下平衡10分钟 ，然后在37°C下在无氢的厌氧条件下孵育24小时（厌氧气体产生系统
，Oxoid，Thermo Fisher Scientific） 。对板进行成像 ，并使用板读取器（Biotek）定量在590 nm处的吸光度
。 　　在FAA板（Oxoid
，Thermo Fisher Scientific）上种植FNA菌株，并在37°C的概念中补充了10％DHB（Fisher Scientific）（Fisher Scientific）2天。无菌棉签被用来在补充有2.5％酵母提取物（Becton Dickinson）和0.4 mg ML -1-甲级半胱氨酸（Alfa aesar）的TSB（Becton Dickinson）中重塑细胞 。FNA菌株在概念培养物中生长在概念1000厌氧室（Bakerruskinn）37°C约20小时。对于每种菌株 ，标准化为OD600nm = 1的0.75 mL培养物在7830 r.p.m上旋转
。将细胞沉淀重悬于1 ml的GLS溶液中。GLS溶液含有0.2 g-谷氨酰胺（Sigma aldrich），0.01 g溴化剂绿色（Sigma aldrich）
，18 g氯化钠（Sigma aldrich），0.6 ml Triton X -100（Sigma Aldrich）和200 ml去离子水 。GLS溶液是滤过pH后调整为3.1的滤波器
。对于每个菌株 ，将300μl的体积分成一式三份的圆锥形底部96孔板
，并在37°C下厌氧2小时。该板在3,000 r.p.m上旋转1分钟 。将上清液转移到平底96孔板上，并使用板读取器（Biotek）定量600 nm的吸光度
。 　　在FAA板（Oxoid ，Thermo Fisher Scientific）上种植FNA菌株
，并在37°C的概念中补充了10％DHB（Fisher Scientific）1-2天。将这些细胞重悬于50 mL TSB（Becton Dickinson）中，并补充了2.5％的酵母提取物（Becton Dickinson）和0.4 mg Ml -1-蜜饯（Alfa aesar） 。在概念1000厌氧室（Bakerruskinn）37°C中 ，将细胞生长在液体培养物中25小时
。所有菌株在5 ml补充的TSB中标准化为OD600nm = 1
，在pH 3处进行了模拟的胃液（Biochemazone），或在pH 3中补充了10 mM谷氨酸（Sigma Aldrich）的模拟胃液。在37°C的概念1000厌氧室（bakerruskinn）中厌氧孵育3天 。 　　分析中包括的所有患者肿瘤组织均被诊断出结肠直肠腺癌
。对于患者队列1 ，患者签署了知情同意
，以收集和分析其肿瘤标本。弗雷德·哈钦森癌症中心机构审查委员会批准了患者标本对这项工作的使用，该协议编号RG 1006552
、1005305、1005305 、1006664和1006974 。患者的年龄 ，性别和种族不是标本获得的选择标准。对于微生物培养工作，对治疗的原发性CRC肿瘤进行了优先级
。对于患者队列2
，使用了来自Bioproject PRJNA362951的样品。 　　如前所述从患者组织中提取DNA，并使用Zymobiomics服务 - 靶向元基因组测序（Zymo Research）进行处理 。进行了细菌V3 – V4 16S核糖体RNA基因靶向测序
。Zymo研究对V3-V4靶向引物进行了定制设计 ，以提供16S基因的最佳覆盖范围
，同时保持高灵敏度。它们基于一般细菌16S rRNA基因引物341F（cctacgggnggcwgcag）和805R（Gactachvggggtatctaatcc），该基因扩大了16S rRNA基因的V3 – V4区域 。放大在更高的退火温度下进行 ，以确保仅扩增细菌序列
。包括提取控制
，在库制备过程中没有显示（运行到42个周期）。使用Accubiome扩增子测序试剂盒（Zymo Research）制备了测序文库，其中在实时PCR机中进行了PCR反应 ，以防止PCR嵌合体的形成 。用Zymo Research的精选DNA清洁和浓缩器（保留了> 200个基本对片段）清理扩增子库
，并用挂接，归一化和合并在一起
。用定量PCR对最终文库进行定量 ，并在Illumina Miseq上测序
，并使用V3试剂盒（600个循环）进行测序。测序是使用> 10％的PHIX混合物和配对模式进行的 。将原始序列读取用Trimmomatic-0.33（参考文献72）修剪
。FNA特异性扩增子序列变体是由提供商Cosmosid设计的。我们为所有FNA C1和FNA C2菌株提供了16S rRNA基因序列 。作为FNA C1的16S序列与FNV紧密分支（扩展数据图2A），我们还为所有FNV菌株提供了16S rRNA基因序列 ，以确保FNA C1 Amplicon序列变体的特异性无法检测到FNV。使用这些16S rRNA基因序列和SILVA 138.1 SSU Ref生成了自定义的SILVA数据库
。NR99版本， 以及物种训练集的DADA2版本。首先
，从SILVA中除去了与提供序列相匹配的SILVA数据库中的所有序列 。接下来，将自定义序列添加到SILVA数据库文件中 ，其中将物种名称基于提供的元数据信息（FNA C1
，FNA C2或FNV）
。Analysis on this database was then run through the nf-core AmpliSeq pipeline, with the parameters --FW_primer CCTACGGGRSGCAGCA, --RV_primer GACTACHVGGGTATCT, --trunc_qmin 20, --trunc_rmin 0.2, --max_ee 6, --min-frequency 1, --picrust, and -- dada_ref_tax_custom. 　　To study the association between each Fna clade and CRC, we profiled shotgun stool metagenomic samples from 9 publicly available cohorts (Supplementary Table 22), for a total of 627 patients with CRC and 619 healthy individuals using MetaPhlAn4 (ref. 63; https://github.com/biobakery/biobakery/wiki/metaphlan4) against an Fna clade-specific来自我们的FNA基因组生成的数据库，可在国家生物技术信息中心（NCBI）下获得生物投影登录号PRJNA549513。可以为每个FN亚种和FNA进化枝确定一个独特的物种水平的基因组箱（SGB）73（FNA C1：SGB6013 ，FNA C2：SGB6007
，FNN：SGB6011，FNP：SGB6011 ，FNP：SGB6001
，FNV：SGBBB6014） 。每个SGB都与样本条件拟合形状的普通最小二乘模型有关：Arcsin-squared-root转换的SGB丰度〜研究条件 + C（性别） + C（性） +年龄 + BMI + BMI +样品的测序深度
。For each model, an adjusted standardized mean difference between the two study conditions was extracted as previously described74: standardized mean difference = (t × (n1 + n2))/(sqrt(n1 + n2) × sqrt(n1 + n2 − 2)), in which t defines the t-score of the corresponding variable, n1 is the number of samples in the zero class, n2 is the number of samples in the one class, andN1+N2 - 2是模型的自由度。相应的标准误差计算为：S.E.= sqrt（（（（（n1+n2 - 1）/（n1+n2 -3）））×（4/（n1+n2））×（1+（（（（（（标准化平均差））2）/8））） 。通过两尾WALD检验评估统计显着性
。使用Paule-Mandel异质性估计值76合并并使用随机效应荟萃分析进行汇总和分析效应大小。荟萃分析的统计显着性计算为无效假设的z评分，即平均效应为Zero75 。使用Benjamini – yakuteli方法校正了所有P值
。 　　为了评估CRC患者中推定的EUT ，PDU和GDAR系统操纵子与健康个体相比
，我们介绍了来自9个公开可用队列的shot弹枪粪便元基因组样品（补充表22），共有627例CRC患者和619名健康个体。使用Bowtie2（2.4.5版 ， - 敏感参数）77，将宏基因组样品映射到FNA SB010 EUT
，PDU和GDAR操纵子上 。使用CMSEQ工具的BRATTTH_DEPTH.PY脚本评估操纵子中每个基因覆盖的广度和深度（参数-Minqual 30 -mincov 1）78。检测到的基因的覆盖阈值广度高于50％
。对于EUT和PDU的结果，相对于FNA SB010操纵子结构 ，推定的操纵子具有90％的EUT和PDU基因的阈值。对于GDAR结果
，相对于FNA SB010操纵子结构，推定的操纵子具有100％GDAR基因的阈值 。 　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得
。