BHK-21J（婴儿仓鼠肾脏成纤维细胞）细胞51由P. bredenbeek提供
，并以最小必需培养基（Gibco）（Gibco），Vero E6（非洲绿色猴子肾脏 ，ATCC CRL-1586）和HEK293T（HEK293T）和HEK293T（人类胚胎肾细胞
，ATCC CRL-3216）细胞维持DULBECCO和DULBCO ea efecco and dulbecco ea efecco和hek293t保持（Gibco）。所有培养基均以10％的胎牛血清（Hyclone），2 mM-谷氨酰胺（Gibco） ，1％碳酸氢钠（Gibco）补充 。BSR-T7/5（表达BHK-21的T7 RNA聚合酶）由I. Goodfellow提供
，并保存在补充了0.5 mg Ml-1遗传素（Gibco）的DMEM中
。 　　对于仓鼠中的所有挑战实验，SARS-COV-2菌株BetaCov/Belgium/GHB-03021/2020（EPI ISL 407976 | 2020-02-03）从Vero E6细胞上生长 ，如前所述2。使用前
，YF17D（Stamaril，Sanofi-Pasteur）在Vero E6细胞中被传递了两次 。定期监测所有细胞 ，以缺乏支原体污染
。 　　使用YF17D的传染性cDNA克隆（在诱导型BAC表达载体Pshuttle-YF17D
，专利号wo2014174078 A1中）生成不同的疫苗构建体34,53,54。通过将SARS-COV-2 S蛋白（GenBank：MN908947.3）的密码子优化序列或其变体插入YF17D的全长基因组（GenBank：genBank：genBank：X03700）中的全长基因组中，将几个SARS-COV-2疫苗的候选面板进行了设计 。区域6,55
。产生的变体包含（i）来自氨基酸14–1273的S蛋白序列 ，以其可裂解和/或不可裂解的形式或版本（YF-S1/2和YF-S0）表达S，或（YF-S1/2和YF-S0）
，或（ii）其亚基S1（氨基酸14-722）（YF-S1）（YF-S1）。为了确保在黄热病病毒主链中有适当的黄热病病毒拓扑并正确表达不同的S抗原，插入了从西尼罗河病毒衍生的跨膜结构域 。 　　通过将s cDNA（在PCR上获得重叠的合成cDNA片段; idt）克隆来克隆SARS2-COV-2疫苗的候选物 ，由NEB构建器克隆套件（新英格兰Biolabs）与Pshuttle YF17D Backbone一起克隆
。NEB构建器反应混合物被转化为大肠杆菌EPI300细胞（Lucigen）
，并通过Sanger测序确认S蛋白cDNA的正确整合。重组质粒在过夜后通过柱色谱法（Nucleobond Maxi Kit，Machery -Nagel）纯化 ，然后通过添加2 mM -Arabinose对BAC载体进行6小时的额外扩增
，如前所述34 。 　　通过标准方案（Transit-LT1，Mirus Bio）将传染性疫苗病毒从质粒构建体中产生。转染后四天收集上清液 ，当时大多数细胞显示出细胞病变作用的迹象
。如前所述15,34
，通过在BHK-21J细胞上的斑块测定法测定了传染性病毒滴度（PFU ML-1）。通过RNA提取和DNase I处理（Direct-Zol RNA试剂盒，Zymo Research） ，随后RT – PCR（QScript XLT
，Quanta）和Sanger测序，通过RNA提取和DNase I处理（Direct-Zol RNA试剂盒）和DNase I处理（Direct-Zol RNA试剂盒）和新鲜感染细胞提取物的免疫印迹（如在Immununununono'中所描述的）证实了在产生的疫苗病毒量中的插入序列的存在 。YF-S0疫苗病毒病毒用于猕猴研究的库存是通过切向流量过滤（少量 ，pall）集中的，并在建立的元基因材料管道56,57或质量控制或质量控制（身份
，一致性和遗传同质性）和以前描述了生存的善良的质量控制下，在Miseq平台（Illumina）上进行深度测序
。 　　为了测试YF-S0疫苗病毒的遗传稳定性 ，从转染的BHK-21J细胞中回收的病毒上清液（P0）被菌斑纯化一次（P1）
，并在BHK-21J细胞上串行传递（P3 – P6）。此外，在扩增后分析了第二轮菌斑纯化的25个斑块分离株的遗传稳定性（P4*） 。 　　对于所有通过 ，将新鲜的BHK-21J细胞从各个以前的段落中对病毒上清液的1：2稀释感染1小时
。感染后
，用PBS洗涤两次细胞。感染后72小时常规收集感染细胞的上清液 。通过RNA提取和DNase I处理（Direct-Zol RNA试剂盒，Zymo研究） ，随后是RT – PCR（QScript XLT
，Quanta）和Sanger测序，证实了插入序列在生成段落中的存在 ，以及通过“ Immunonoblot Blastot Anallys”的免疫印象
。 　　如前所述34
，通过免疫荧光染色验证了疫苗候选物的体外抗原表达。简而言之，BHK-21J细胞被100 PFU的YF-S疫苗候选物感染 。感染后三天染色感染细胞
。为了检测黄热病病毒抗原 ，使用多克隆小鼠抗YF17D抗血清。为了检测SARS-COV-2 S抗原，使用了Rabbit Sars-CoV S1抗体（40150-RP01
，Sino生物学； 1：250稀释）和兔SARS-COV S的原代抗体（40150-T62-COV2，SINO生物生物学； 1：250稀释） 。次级抗体是山羊抗小鼠Alexa Fluor 594和山羊抗兔Alexa Fluor 488（Life Technologies; 1：500稀释）。用DAPI（Sigma）对细胞进行染色
。所有共聚焦荧光图像均使用Leica TCS SP5共聚焦显微镜上的相同设置 ，使用HCX PL APO 63×（Na 1.2）水浸入物镜中获取。 　　收集感染的BHK-21J细胞并用冰冷的磷酸盐缓冲盐水洗涤一次
，并在含有1倍蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂鸡尾酒鸡尾酒鸡尾酒（Thermo Fisher Scientific）的无线电免疫沉淀测定缓冲液（Thermo Fisher Scientific）中裂解 。在4°C下以15,000 rpm离心10分钟后，使用BCA（Thermo Fisher Scientific）测量清除裂解物中的蛋白质浓度
。通过制造说明 ，通过简单的基于西方大小的蛋白质测定（蛋白质简单）进行免疫印迹分析。简而言之
，在将400 ng的总蛋白载到每个毛细管上后，使用特定的原代抗体（NB100-56578 ，Novus Biologicals和40150-T62-COV2
，Sino Biological; 1：100稀释）和HRP-Conjuged二级抗体（protiboty; 1：100 dimution; 1：100：100：100：100：100：100：100：100：使用指南针软件（蛋白质简单）分析化学发光信号 。为了评估从糖蛋白中去除N连锁的寡糖，根据制造商（New England Biolabs） ，用PNGASE F处理蛋白质提取物
。 　　野生型叙利亚仓鼠（M. auratus）和BALB/C小鼠和幼崽购自Janvier Laboratories。型I-I-Interferon受体不足（IFNAR1 - / - ）小鼠58
，类型-I-II-II-INTERFERON-受体 - 受体不足的AG12959和STAT2 - / - 仓鼠在内部繁殖 。先前已经描述了STAT2 - / - 仓鼠（基因标识符：101830537）的产生60
。I型和III信号的功能消融已得到证实2。STAT2 - / - 仓鼠先前已被证明特别容易受到黄病毒感染61 。 　　在整个研究中，都使用了六到十周大的男性和雌性IFNAR - / - 小鼠 ，六到八周龄的雄性和雌性AG129小鼠以及六到八个周大的女性野生型仓鼠
。对于疫苗安全研究，使用了相等量的年龄匹配的男性和女性野生型以及STAT2 - / - 仓鼠。 　　在这项研究中
，使用了十二种杂种成熟的雄性cynomolgus猕猴（M. fascicularis） 。猕猴是专门的，并安装在生物医学灵长类动物研究中心（BPRC）。为该研究选择的所有猕猴都具有良好的身体健康状况 ，基线生化和血液学值正常
。 　　仓鼠和小鼠饲养在单独通风笼（Sealsafe Plus
，Tecniplast）中，每5（用于小鼠）（笼子型GM500）或PER 2（用于仓鼠）（GR900）（笼子型GR900） ，在21°C
，55％湿度，湿度为55％和12:12 Light：12:12 Light：Dark Cycles。仓鼠和小鼠随意提供食物和水 ，以及棉花和纸板游戏隧道（小鼠）或额外的床上用品和木制gnawing块（仓鼠） 。根据欧洲实验室动物科学协会联合会（FELASA）批准的机构指南
，该项目得到了鲁文伦理委员会（P015-2020）的批准
。通过腹膜内给予100μL（小鼠）或500μl（仓鼠）Dolethal（200 mg ML -1五丁丁基钠钠，VétoquinolSA） ，对仓鼠和小鼠安乐死。 　　对于小鼠和仓鼠
，根据试点实验的结果选择样本量 。至少两个独立的生物学重复序列进行了关键研究
。在猕猴的情况下，与非接种疫苗的对照相比 ，统计功率计算考虑了检测到显着诱导免疫反应所需的猕猴的数量。在n = 6组的组中，可以证明疫苗功效> 85％（α= 0.05
，β= 0.2（功率= 80％），正态分布） 。随机进行实验组的分配
。除了ELISPOT（基于机器的计数） ，流式细胞术（在阴性对照样本上定义的门
，所有组相同的门）和生存数据（预定义的人道终点）外，对动物样品进行了分析。 　　使用Prime和Boost方案（在第0天和第7天） ，用指示的疫苗构建体PFU量接种仓鼠 。作为对照
，在第0天和第7天用103 PFU的YF17D或含有2％FBS的MEM（假）接种了两组
。在第21天，所有仓鼠都均为BLIS ，以分析血清与SARS-COV-2的结合和中和抗体。在疫苗接种后和挑战之前的指示时间
，仓鼠通过腹膜内注射木嗪（16 mg kg-1，Xyl-M ，V.M.D 。）
，氯胺酮（40 mg kg-kg-1，nimatek ，eurovet）和阿托帕丁（0.2 mg kg kg-kg-kg-kg-kg-kg-kg-kg-kg-kg-kg-kg-kg-kg-1，sterop）解决了麻醉。通过在两个鼻孔中轻轻地添加50μl含有2×105 TCID 50的SARS-COV-2的病毒库存
，从而在鼻内接种仓鼠
。每天对仓鼠进行疾病的迹象（嗜睡，呼吸沉重或皱巴巴的皮毛）。挑战四天后 ，所有仓鼠被安乐死
，以分别在rnalater，mem或福尔马林中收集末端血清和肺组织 ，分别用于基因表达
，病毒滴定或组织病理学分析 。为了确定疫苗病毒的病毒血症概况，用104个PFU YF17D或YF-S0腹膜内接种了一部分仓鼠 ，并在第1
、2、2 、3
、4、5 、7
、9、11 、15和29天疫苗接种
，以测量血清病毒量
。 　　IFNAR1 - / - 小鼠通过使用每个4×102 PFU的素数（在第7天和第7天）的素数和增强来腹膜内接种疫苗构建体接种。作为对照，用YF17D或假手术接种了两组（在第0天和第7天）接种疫苗 。所有小鼠均为每周流血 ，并通过离心间接免疫荧光测定法（IIFA）和血清中和试验（SNT）分离血清
。第一次疫苗接种后三周
，将小鼠安乐死，收集脾脏以进行ELISPOT细胞因子检测 ，通过RT-QPCR和细胞内细胞因子染色（ICS）进行转录因子分析。对于黄热病的挑战，如前所述14,34
，通过颅内途径接种致命的YF17D小鼠 。简而言之，腹膜内疫苗接种YF-S0 ，YF17D或假手术后的三周后
，将小鼠麻醉并在颅内接种，并在颅内接种30μl的3×103 PFU的YF17D ，然后对每天的疾病和体重变化4周进行监测
。生病的小鼠是根据发病率（后肢瘫痪
，无力和毛茸茸的皮毛）或超过25％以上的25％的生命的。 　　为了评估神经电动机和神经质主义，BALB/c小鼠幼崽和AG129小鼠分别在颅内或腹膜内与所指定量的PFU量的YF17D和YF-S疫苗接种量 ，并在收集21天后进行了每日的发病率和死亡率 。为了研究内脏疾病
，STAT2 - / - 仓鼠通过腹膜内途径接种了最高暴露，使用104 PFU的YF17D或YF-S0接种 ，并随后每天21天进行幸福感
。如果发生以下情况
，则进行安乐死：总体重减轻> 20％；日常体重减轻> 10％；瘫痪的明显迹象；痛苦的迹象（呼吸困难，头发皱纹 ，异常或弯曲的姿势，严重的躁动或抑郁）。 　　所有住房和动物程序均在BPRC
，由独立伦理委员会（DEC-BPRC）的积极建议下，根据中央动物实验委员会发布的项目许可证AVD5020020209404 ，并在批准了机构动物福利机构详细研究方案后 。根据荷兰法律
，在动物科学系中进行了所有动物处理，并由负责国家管理局（Nederlandse voedsel- warenautoriteit ，NVWA）和动物福利机构定期检查。 　　将猕猴与社会兼容的笼子配对配对
，并随机分配给两组
。六个（n = 6）猕猴在内部的上肢中皮下疫苗接种，在第0天（Prime）和7（Boost）时 ，YF-S0的剂量为105 PFU。作为对照
，用匹配的安慰剂疫苗的105 PFU接种n = 6猕猴，由重组YF17D和与与SARS-COV-2插入的序列同源性无关的重组YF17D组成 ，该抗原与同一位置插入的SARS-COV-2同源性（E/NS1 Junction） 。 　　在研究开始前三周（ANAPILL DSI）将温度监测器植入了每个猕猴的腹腔
，从而提供了体温和活性的连续实时测量
。每天检查健康，并监测猕猴的食欲 ，一般行为和粪便一致性。收集血液以定期评估全血数量和临床化学，没有发现正常范围的变化 。 　　在疫苗接种后的第21天
，所有猕猴均受到鼻内 - 室内接种接种的挑战，其SARS-COV-2的名义上为1.5×104 TCID50（由总体积5 ml确定 ，由Vero细胞上的背部滴定确定）；在气管（4毫升）和鼻孔（每个0.25 mL）上分裂
。如描述的
，在喉纳拭子中定量了所得的病毒RNA负荷，如所述 ，每ML62的200 RNA拷贝的下限。随访21天后
，押押慕地塔被安乐死，以进行肺26的组织学分析 。 　　RT – QPCR2定量仓鼠肺匀浆中传染性SARS-COV-2颗粒的存在
。简而言之 ，为了定量挑战后的病毒RNA水平和基因表达
，根据制造商的说明，使用Nucleospin Kit Plus（Macherey-Nagel）从均质器官中提取RNA。使用ITAQ通用探针一步RT-QPCR试剂盒（Biorad）进行了反应 ，并在补充表1中列出了引物和探针（集成的DNA技术） 。使用家政β-肌动蛋白进行施加量子化的2-ΔΔΔCQ方法63计算了相对RNA折叠
。为了检测血液中的疫苗病毒
，用Nucleospin RNA病毒试剂盒（Macherey-Nagel）提取50μL血清的RNA。引物和探针源自黄热病病毒非结构基因3，并在补充表1中显示了RT-QPCR ，使用ABI 7500快速实时PCR系统（Applied Biosystems）进行 。为了绝对定量，使用已知浓度的cDNA质粒模板（质粒Pshuttle/YFV-17D14,34）的五倍稀释液生成标准曲线。基于重复的标准曲线
，以每毫升的8,900副本建立了检测的下限，对应于35的CT值
。CT值高于35以下 ，低于检测极限
，并表示为检测下限的平方根。 　　为了量化感染性SARS-COV-2颗粒，对96孔板的汇合E6细胞进行了终点滴定 。在250μl最小的必需培养基中使用珠状破坏（前ellys）和离心（10,000 rpm ，5分钟
，4°C）中的肺组织匀浆，以弥补细胞碎屑
。病毒滴度通过Reed和Muench Method64计算 ，并表示为每毫克组织TCID50。 　　为了进行组织学检查
，将肺组织（用于猕猴，用10％中性缓冲福尔马林充气后）固定在4％多聚甲醛（仓鼠）中 ，或中性缓冲的福尔马林（猕猴）
，并嵌入在石蜡中 。用血久毒素和曙红染色组织切片（仓鼠为5μM，猕猴3μm） ，并通过专家病理学家分析了肺损伤
。 　　为了监测SARS-COV-2挑战后的肺病理发展，使用X-Cube微型计算机扫描仪（Molecubes）对仓鼠进行成像
，如前所述2。使用DataViewer和CTAN软件（Bruker Belgium）进行了重建的微型计算机层析成像数据的量化 。如前所述2,65,65,66,67,68，对微型计算层析成像数据进行了半定量评分作为主要结局指标和成像生物标志物（非肺部体积）作为次级测量
。 　　为了检测仓鼠和小鼠血清中的SARS-COV-2特异性抗体 ，使用了内部开发的IIFA。使用CRISPR-CAS9
，CMV-SARS-COV-2-SPIKE-FLAG-FLAG-MCHERRY-P2A-BLASTIR CASSETTE稳定地集成到HEK293T细胞的Rosa26 Safe Harbous基因座中69 。为了确定SARS-COV-2 S结合抗体末端滴度，在HEK293T尖峰稳定细胞上的96孔板和HEK293T野生型细胞的平行中 ，在96孔板中进行了1/2系列血清稀释液
。山羊抗鼠鼠IgG Alexa Fluor 488（A11001
，Life Technologies; 1：250稀释），Goat-anti-Mouse IgG1 ，IgG2B和IgG2C Alexa Fluor 488（分别分别是115-545-205
，115-545-207，115-545-207和115-545-207和115-545-545-208）作为二抗。与DAPI对抗后 ，用细胞Insight CX5高含量筛选平台（Thermo Fischer Scientific）测量了蓝色通道（386 nm的激发）和绿色通道（485 nm激发）的荧光 。特定的SARS2-COV-2 S染色的特征是绿色通道中的细胞质（内质网）富集。为了量化这种特定的SARS-COV-2 S染色
，从HEK293T SARS-COV-2 S条件的细胞质和核信号差中减去了HEK293T野生型条件的细胞质和核信号的差异
。所有正值被认为是特定的SARS-COV-2染色。样品的IIFA端滴定被定义为以这种方式得分为阳性的最高稀释度 。由于血清的数量有限，因此在大多数情况下（除非另有说明） ，在两个或三个样品的小木上确定了IIFA末端滴度
。 　　如先前所述70,71,72，生成了SARS-COV-2 VSV假型。简而言之
，HEK-293T细胞用PCAGGS-SARS-COV-2Δ18-FLAG表达质粒编码SARS-COV-2 S蛋白含有C-末端18-氨基酸酸删除73,74 。转染后一天，用VSVΔG感染细胞 ，表达绿色荧光蛋白（GFP）报告基因（感染的多重性2）2小时
。用含有抗VSV-G抗体的培养基（I1
，小鼠杂交瘤上清液从CRL-2700; ATCC）更改培养基，以中和任何残留的VSV-G病毒输入75。二十四小时后 ，收集了含有SARS-COV-2 VSV伪型的上清液 。 　　为了量化SARS-COV-2 NABS
，将血清样品的系列稀释液在37°C下与相等体积的SARS-COV-2伪型VSV颗粒一起孵育1小时，并在VERO E6细胞上接种18小时
。 　　使用YF17D病毒的MCHERRY标签变体34,54 ，用内部开发的基于荧光的测定法测定了用于黄热病病毒的中和滴度（SNT50）。为此
，将血清稀释液与YF17D-MCHERRY病毒在37°C的96孔板中孵育1小时，然后将血清 - 病毒配合物转移了72小时 ，向BHK-21J细胞传递了72小时 。在细胞洞察CX5/7上量化了GFP或MCHERRY表达细胞的百分比百分比
，通过拟合与病毒（1％）和细胞对照软件（0％）（0％）（GraphPad Prism）（图形）（图）（图）（Thermo Fischer Scientific）和中和半最大抑制浓度值（通过拟合血清中和中和抑制浓度值的确定）
。 　　在室温下孵育1小时之前，将血清用相等体积的SARS-COV-2或40 PFU YF17D连续稀释。将血清病毒复合物添加到Vero E6（SARS-COV-2）或BHK-21J（YF17D）细胞单层中的24孔板中 ，并在37°C下孵育1小时 。三天后，用3.7％PFA固定后
，将叠加层除去并用0.5％的晶体紫色染色。测试血清样品的中和滴度（PRNT50）被定义为最高测试血清稀释的倒数，导致斑块减少至少50％
。 　　PEPMIX黄热病（NS4B）（JPT-PM-YF-NS4B）和子池1（158个重叠15-Mers）Pepmix SARS-COV-2 S（JPT-PM-WCPV-S-2）用作ELISPOT和ICS的回忆抗原。稀释的Vero E6细胞裂解物（50μgml-1）和PMA（50 ng ml-1）（Sigma-Aldrich）和离子霉素（250 ng ml-1）（Sigma-Aldrich）的组合分别用作负和阳性对照 。 　　将新鲜的小鼠脾细胞与1.6μgml -1黄热气NS4B肽混合物一起孵育
。1.6μgml -1 S肽子池1;PMA（50 ng mL -1）;离子霉素（250 ng mL -1）或50μgml -1 Vero E6细胞在37°C下18小时。用Brefeldin A（Biolegend）处理4小时后 ，将脾细胞染色
，以使僵尸固定的可生存力试剂盒（Biolegend）（Biolegend）和FC受体通过小鼠FCR阻断试剂（Miltenyi Biotec）（每孔0.5μl）（0.5μl）（0.5μl）（0.5μl）（0.5μl）染色15分钟 。然后用细胞外标记BUV395抗CD3（17a2; 1：167稀释）（BD），Bv785抗CD4​​（GK1.5; 1：100稀释）（Biolegend）（Biolegend）（APC/Cyananine7抗CD8（53-6.7; 1：100; 1：percrif）（Biolegend）（Biolegend）（Biolegend）（Biolegend）（Biolegend）（BIOLEGEND）（BIOLEGEND）（BIOLEGEND）（BIOLEGEN）（BIOLEGEND）（BIELIDE）（BIELIDE）（BIELIDE）（BIELIDE）（BIELIDE）（pecpp）（pecpp）（pecpppp）（GL3; 1:67稀释）（Biolegend）在明亮的染色缓冲液（BD）中孵育25分钟之前
。根据制造商的规程 ，使用FOXP3转录因子缓冲套件（Thermo Fisher Scientific）
，将细胞用PBS洗涤一次，并固定并透化30分钟。最后 ，用以下抗体进行染色：PE抗IL-4（11B11; 1:50稀释）
，APC抗IFNγ（XMG1.2; 1：100稀释），PE/DAZZLE 594抗TNF（MP6-XT22; 1:50稀释） ，Alexa Fluor 488 Anti-FILUTION 488 ANTI-FILUCTOR 48 ANTI-FIRITUCE（MMFAPH 488）和1:20；抗IL-17A（TC11-18H10.1; 1:50稀释）（全部来自Biolegend）
，并在BD LSRFortessa X-20（BD）上获得 。通过从相应的刺激样品中减去未刺激的样品（与未感染的VERO E6细胞裂解物孵育）来计算所有测量
。用于ICS分析的门控策略在扩展数据中描述了图6a。在扩展数据中概述了疫苗诱导的T细胞群体比较表达分析的策略图6b 。使用FlowJo版本10.6.2（LLC）分析所有流式细胞仪数据）
。基于门控的脾细胞样品分别将尖峰特异性CD4和CD8 T细胞串联后，在FlowJo中产生T-SNE图。 　　用小鼠IFNγ试剂盒（IFNγ试剂盒（IMFOT MIFNG-1M/5 ，CTL欧洲）进行了检测分泌IFNγ的小鼠脾细胞的ELISPOT分析 。通过逐步添加生物素化检测抗体，链霉亲和蛋白酶结合物和底物
，可以看到IFNγ斑点。使用免疫疗法S6通用读取器（CTL欧洲）对斑点进行计数，并通过从相应刺激样品的点数中从对照样品（与未感染的VERO E6细胞裂解液（未感染的Vero E6细胞裂解液）中减去斑点数量进行标准化
。负值校正为零。 　　S肽刺激的脾细胞用于使用Nucleospin Kit Plus Kit（Macherey-Nagel）进行RNA提取 。通过使用高容量的cDNA逆转录试剂盒（Thermo Fisher Scientific）产生cDNA
。使用ABI 7500快速平台上的Taqman基因表达测定（Applied Biosystems）进行实时PCR。将TBX21 ，GATA3
，RORC和FOXP3的表达水平（全部来自集成DNA技术（IDT））归一化为GAPDH（IDT）的表达 。使用2 -ΔΔCQ方法评估相对基因表达
。 　　没有使用统计方法来预先确定样本量。实验不是随机的，研究人员在实验和结果评估过程中并未对分配视而不见 。GraphPad Prism（GraphPad软件）用于所有统计评估
。图例中指出了动物和独立实验的数量。如果没有另行说明 ，使用非参数Mann-Whitney U-Test和Kruskal-Wallis检验确定统计显着性 。在p≤0.05时
，认为值显着差异
。 　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然研究报告摘要中获得。