在马萨诸塞州波士顿的马萨诸塞州综合医院和马里兰州贝塞斯达的NIH临床中心招募了感染HIV-1的人作为研究参与者。根据相应的机构审查委员会批准的方案获得PB单核细胞（PBMC）样品。所有研究参与者均给予书面收集血液或LN活检的知情同意 。研究参与者的临床特征总结在扩展数据图2中 。2和9。研究参与者是根据先前研究中分析的HIV-1感染CD4+ T细胞的高频预选的 。
根据马萨诸塞州综合医院机构审查委员会批准的协议，在研究参与者的知情同意书中对腹股沟LN进行手术切除 。解剖LN组织，并通过补充10％胎牛血清的RPMI培养基中的70 µM尼龙细胞过滤器进行机械分解。
使用Ficoll -Paque密度离心分离PBMC和LN单核细胞（LNMC） 。PBMC和LNMC在90–95％的胎牛血清和5-10％二甲基硫氧化物中迅速冷冻 。为了进行分析 ，使用商业产品（根据制造商的规程 ，将细胞解冻，并对记忆CD4+ T细胞进行负免疫磁分离 ，并使用商业产品（Steamcell EasySep人体记忆CD4+ T细胞富集试剂盒 ，第18000号）。
用商业供应商（Biolegend）定制制造并作为冻干的单反应小瓶供应，单克隆抗体被定制为冻干的单反应小瓶 。使用了以下表面标记的抗体：PDL1（克隆29e.2a3） ，CD276（克隆DCN.70） ，HVEM（克隆122），CD155（克隆SKII.4） ，CD154（CD154） ，CD154（也称为CD40L）（CD40L）（克隆24-31），CCRONE L28（CCRONE L28 L291）Tigit（Clone A15153G） ，CD44（克隆BJ18） ，CXCR3（克隆G025H7），CCR5（克隆HEK/1/85A），CCR6（克隆G034E3） ，CXCR5 ，CXCR5（CXCR5HP-3G10），CTLA4（克隆BNI3） ，lag3（克隆11C3C65） ，KLRG1（克隆14C2A07），CD95（克隆 ，DX2） ，OX40，OX40（也称为CD134）（也称为CD134）（CD135）（clone ber-act35） ，CD57（CD57（CD57）（CD57（CLONE HNK-1）（CLONE HNK-1） ，TIM3（CLONA，TIM3（CLONA） ，FIM3（CLONA ，CLONA，CLA），FIM3（CLONA ，CLO ，Clone，Clone f ，Clone f ，Clone FONA，Clone FANE ，Clone f ，Clone，Clone ，clone ，clone f 。作为CD272）;(clone MIH26), CD244 (also known as 2B4) (clone 2-69), IL-2R (clone TU27), CD137 (also known as 4-1BB) (clone 4B4-1), GITR (also known as CD357) (clone 108-17), CD28 (clone CD28.2), CD127 (clone A019D5), IL-6R(clone UV4), HLA-E (clone 3D12), MICA or MICB (clone 6D4), IL-15R (also known as CD215) (clone JM7A4), IL-21R (clone 2G1-K12), TNFR2 (clone 3G7A02), CD160 (clone BY55), LIGHT (also known as CD258) (cloneT5-39), IL-10R (also known as CD210) (clone 3F9), TGFβR (clone W17055E), IL-12R (clone S16020B), CD6 (clone BL-CD6), CD49d (clone 9F10), CD25 (clone BC96), CD30 (clone BY88), CD69 (clone FN50),CD45RA（克隆HI100），CD38（克隆HIT2） ，HLA-DR（克隆L243） ，CD4（克隆RPA-T4），CD2（克隆TS1/8），CD3（CLONE UCHT1） ，CD62L（CD62L）（CLONE DREG-56） ，CD45RO（CD45RO（CD45RO（CD45RO）（CLONE UCHL1）。包括两种小鼠IgG对照抗体（Biolegend，第400299号 ，第400383号） ，与不同的总SESSEQ-D寡核苷酸连接为同种型对照 。用60μl的细胞染色缓冲液重构含有上述抗体的冻干抗体鸡尾酒（Biolegend，第420201号） 。用人信任FCX阻断细胞（Biolegend ，编号422301） 在冰上进行15分钟 ，然后在冰上与50μl重构的抗体鸡尾酒一起孵育30分钟。用预冷的细胞染色缓冲液洗涤三个洗涤后，用40μm的细胞流量过滤器（Fisher Scientific ，No。14-100-150）过滤细胞 ，用自动细胞计数器计数，然后将其装入微流体弹药筒中 ，以用于单细胞多重PCR分析 。
根据制造商的协议 ，使用磁带平台（Missionbio）进行了定义的基因组DNA片段的单细胞扩增18 。将生存的单细胞固定在带有裂解缓冲液（含有蛋白酶和温和洗涤剂的）的液滴中，并在50°C下孵育1小时，然后在80°C下10分钟 ，以使酶热失活。含有单细胞条形码珠的液滴（用带有细胞条形码的寡核苷酸标记和定制设计的引物）与封装的细胞裂解物融合在一起 。在HIV-1和N = 27个不同基因组区域扩增N = 18个不同基因组区域的引物小组 ，在我们的研究参与者中还使用了我们的研究参与者中（图1B和补充表1），除了两个引物集中综合群中 ，还将其放大了ROMPPP 30 。紫外线到裂解PCR引物 ，其中包含来自珠子的独特细胞条形码。为了放大选定的基因组DNA片段和抗体寡核苷酸标签，将液滴用于24个周期的PCR ，并使用制造商建议的温度梯度 。
将放大产物与Ampure XP珠（Beckman Coulter ，no 。A63882）混合，以0.7的比例混合 ，并放置在磁场中 ，以分离DNA和蛋白质标记文库。用80％乙醇洗涤与安培珠结合的DNA库，并将含有蛋白质标记文库的上清液洗涤 ，并与抗体标签5'端的生物素化寡核苷酸一起孵育 ，然后使用链霉亲蛋白链胶片进行磁分离 。对于库放大，根据制造商的协议，分别在纯化的DNA和蛋白质库上使用Illumina Index Primers P5和P7进行了PCR；DNA文库进行了12个周期 ，并为蛋白质标签文库运行了18个周期 。
DNA和蛋白质标签库以高灵敏度D1000屏幕截图仪器（Agilent Technologies ，5067-5584）运行，并带有Agilent 4200 Tapestation System ，以评估DNA质量。通过荧光计（Qubit 4.0 ，Invitrogen）对库进行定量，并在Illumina的下一代测序平台上进行测序 ，其中具有20％的phix Control DNA（Illumina ，no 。FC-1110-3002） 。DNA and protein tag libraries were sequenced separately on a NextSeq 500 instrument (Illumina), using the NextSeq 500/550 High Output flow cell v2.5 (Illumina, no. 20022408) and the NextSeq 500/550 High Output Kit v2.5 (300 cycles; Illumina, no. 20024908) in 2 × 150-bp paired-end runs.
使用次要修改的磁带管道（Missionbio，v2.0.1）用于处理测序数据。简而言之 ，对于DNA库数据 ，使用CASADAPT（v2.5）54用于修剪5'和3'衔接序列，并从读取1中提取18 bp细胞条形码序列。使用与2个hamming距离内的白色锤子上的唯一条形码对齐的细胞条形码进行下游分析 。使用BWA（v0.7.12）55 ，将序列与基于人类基因组（GRCH38）和先前研究中确定的患者特异性HIV-1序列构建的自定义参考基因组对齐 。根据磁带管道中实现的标准对单细胞对齐进行过滤 ，并使用Samtools（V1.9）56进行索引。候选HIV-1感染的细胞由在挂毯管道中建立的细胞调算法确定 。BCFTools（V1.9）57用于调用变体并生成共识序列 。为了减少伪造的比对，只有在每个给定扩增子覆盖了参考序列的至少80％时，病毒测序读数才被认为是有效的。宿主测序读数必须覆盖至少占相应扩增子长度的50％ 。对于抗体库数据 ，使用CASADAPT类似提取细胞条形码 。对于具有有效细胞条形码的读数 ，从读取2中提取了15 bp抗体条形码。从已知的抗体条形码中接受抗体条形码序列1的抗体条形码序列 。处理两个文库中的候选细胞进行了处理以进行下游分析 。使用中心的对数比率转换58将每种抗体的读数归一化为每个单元格中的总读数。给定表型标记的截止值是通过标记特异性读数计数来定义的，该计数高于1的平均绝对偏差的平均绝对偏差 ，对应于非特异性IgG对照抗体 。为了生成更均匀的细胞种群进行分析 ，所有cd3-cd4-候选细胞的中心对数比率值 （非CD4+ T细胞）和CCR7+ CD45RA+（污染的幼稚CD4+ T细胞）被排除 。
通过单镜3（参考文献59）和UWOT60包装进行中心对数值值的两个维度的UMAP嵌入，并将所有细胞的主组件数量设置为15 ，单独使用HIV-1感染的细胞为10；在k-neartimt邻居中使用的邻居数量分别设置为9和5。所有其他设置都将其保存到默认值。使用莱顿群落检测算法通过单镜3聚类 ，将K-Near邻居设置为500 。
HIV-1测序读取与18种HIV-1扩增产物中的每一种以及与预定义的病毒 - 霍斯host连接相对应的其他扩增产物的读取与参考HIV-1基因组HXB2，与自体完整的HIV-1序列以及与人类参考基因组GRCH38对齐 。使用Los Alamos国家实验室HIV序列数据库HyperMut 2.0 Program61确定与APOBEC3G或APOBEC3F相关的过度过度的存在或不存在。使用Muscle62进行序列比对 。Phylogenetic distances between sequences were examined using maximum-likelihood trees in MEGA (https://www.megasoftware.net) and MAFFT (https://mafft.cbrc.jp/alignment/software), and visualized using highlighter plots (https://www.lanl.gov).根据以下标准 ，将Provirus分类为4个不同的类别：类别1（任何病毒）：至少20个总有效病毒测序读数 ，至少在至少2个不同的HIV-1扩增子中读取至少4个读数；category 2 (enriched for intact proviruses): a total of at least 20 viral sequencing reads with at least 4 sequencing reads from amplicons 2 and 16 (corresponding to IPDA amplicons) each or at least 4 reads from at least 15 amplification products each or at least 4 reads from amplification products spanning known virus–host junctions of intact proviruses (all viral sequencing reads in category 2 had to be without统计学上显着的过度突变的证据，不能对应于已知有缺陷的病毒的病毒 - 霍斯特连接处）；类别3（克隆原病毒）：具有相同病毒整合位点的原病毒（基于至少4个病毒测序读取来自已知病毒 - 孔 - 霍斯特连接点的放大产物）或完全相同的病毒序列；类别4（高压病毒）：1类表现出具有统计学意义序列高压的类别序列（FDR调整后的P <0.05） 。分析中排除了具有不符合上述标准的HIV-1测序读数的细胞。类别0细胞是通过完全不存在与HIV-1相对应的测序读数来定义的 。
Memory CD4+ T cells isolated from PBMCs by negative immunomagnetic enrichment were incubated with defined fluorophore-labelled surface antibodies: CD3–PerCP–Cy5.5 (BioLegend, clone UCHT1, catalogue no. 300430), CD4–BUV395 (BD, clone RPA-T4, catalogue no. 564724),PD1 – FITC（Biolegend ，Clone A17188B ，CatalogNo 。621612），Tigit – Bv421（Biolegend，Clone A15153G ，CatalogNo。372710） ，PVR – PE（PVR – PE）（Biolegend，克隆122 ，目录编号318808） ，BTLA – FITC（Biolegend，Clone Mih26 ，CatalogNo 。344524） ，KLRG1 – APC（Biolegend，clone ，克隆14C2A07 ，CATALONE 14C2A07，CATALOG NO.368606） ，BIO.368606） ，HLA-BBV421（HLA-BBV421）;目录编号342612），PDL1 – PE（Biolegend，Clone Mih2 ，目录号393608） 。孵育25分钟后 ，将细胞洗涤，并使用Facsaria Cell Sorter（BD Biosciences）以每平方英寸70磅的速度将细胞群体分类为特定指定的生物安全柜（Baker Hood）。细胞分类是由马萨诸塞州综合医院的Ragon Institute Imaging Core设施进行的 。使用FlowJo软件（树星）分析数据 。使用全长个体病毒测序测定法（FLIP-SEQ）对分类的细胞进行病毒测序分析。
使用了先前描述的协议11,23。简而言之 ，使用Qiagen Dneasy血液和组织试剂盒从分类的细胞群中提取基因组DNA 。使用Invitrogen platinum taq和横跨足够长的HIV-1的嵌套引物对基于泊松分布统计的DNA进行稀释至单基因组水平 。PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳可视化；放大产物在Illumina平台上进行单基因组测序。从头组装并与HXB2进行了简短的读数 ，以使用自动化的内部管道（https：//github.com/bwhlichterub.com/bwh-lichterterfeld-labab/intactelness-inintactness and） 。使用Los Alamos HIV序列数据库HyperMut 2.0程序确定与APOBEC3G或APOBEC3F相关的高温的存在或不存在 。缺少上面列出的所有致命缺陷的病毒序列被归类为基因组独立。使用肌肉进行序列比对 。使用Clustal X生成的邻居加入算法检查序列之间的系统发育距离 。完全相同的序列物种被认为是克隆。
通过阴性免疫磁富富集从PBMC分离的记忆CD4+ T细胞在带有或没有表现肽的R10培养基中孵育1小时，并彻底洗涤 。之后 ，将细胞与先前分离的HIV-1特异性CD8+ T细胞克隆在选定的效应子与靶向（E/T）的比率上共孵育16小时 。洗涤后 ，用蓝色活力染料（Invitrogen，CatalogNo。L34962） ，CD3 – FITC（Biolegend ，Clone UCHT1，CatalogNo 。300406）和CD4 – Bv711（Biolegend ，Biolegend ，biolegend，clone Rpa-t4，Catalog o.300558）+ CD3+ CDBIBODIES染色 。使用IPDA测定法对分类细胞进行完整和HIV-1病毒的评估。
IPDA使用数字液滴PCR来量化缺乏明显的致命缺陷（尤其是大删除和高压）的预科病毒 ，并如前所述进行22。
数据显示为饼图 ，维恩图，火山图 ，UMAP图和热图 。计算每个标记的两个细胞群之间的富集比为第一个群体中标记阳性细胞比例的比例除以第二个群体中标记阳性细胞的比例 。通过将每类细胞中标记阳性细胞的数量除以相应类别中的细胞总数来计算灵敏度值。通过从每个参与者的每个单元格类别重新采样相等数量的单元格来构建一个引导数据集 ，同时使每个单元格类别的总单元格总数等于引导数据集和RAW数据集之间 。使用Fisher的精确测试，卡方检验 ，t检验或Mann-Whitney U检验 ，测试了差异的统计显着性 。p值<0.05被认为是显着的；使用Benjamini -Hochberg Method63或Bonferroni方法进行FDR校正。使用Prism（GraphPad Software，Inc 。） ，Spice39 ，R（R统计计算基金会64）和Python（Python软件基金会）进行分析 。使用Adobe Illustrator生成数字。
有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得 。
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本文概览： 在马萨诸塞州波士顿的马萨诸塞州综合医院和马里兰州贝塞斯达的NIH临床中心招募了感染HIV-1的人作为研究参与者。根据相应的机构审查委员会批准的方案获得PB单核细胞（PBMC...
文章不错《HIV-1储层细胞中免疫选择的表型特征》内容很有帮助