The following cell lines were used in this study: human fetal foreskin fibroblast cells immortalized with human telomerase (HFFF-TERTs; male)53, HeLa (American Type Culture Collection (ATCC) CCL-2), HEK293T (ATCC CRL-11268), T-REx-293 (Life Technologies), BS-C-1 (ATCC CCL-26) and RK13 (ATCCCCL-37）。所有细胞系均在DMEM（Gibco）中培养，并补充了10％FBS（PAN Biotech）和50μgml -1青霉素 - 链霉素（Gibco）。用稳定转染PCDNA4/至质粒的T-REX-293衍生的细胞进一步补充了10μgml-1蓝花素（Thermo Fisher）和100μgml-1 Zeocin（Gibco） 。将转导至过表达Myc标记的蛋白质10的HEK293T细胞补充了1μgml-1嘌呤霉素（Invivogen） 。补充表1中描述了细胞系的完整列表。
这项研究中使用的病毒是VACV-WR和衍生病毒-V6/2（参考文献54） ，VΔC6（参考文献16） ，VTAP-C6（Ref 。55），VTAP-N1（参考文献55）（Ref 55） ，VA5L-EGFP22和VL3LI355-RPXV菌株Utrecht ，Cpxv aftrus cpxv brimon，Elepl brimen ，cp brimen ，cp brime，cp rade cl radem corm derp redcl 。CMS56和2022年从格拉斯哥（英国）患者分离的MPXV进化枝IIB菌株（MPXV-CVR-S1）。病毒在RK13细胞中生长 ，除了MPXV ，该细胞在HFFF-TERT中生长 。对于VL3LI，在存在25μMIPTG的情况下进行感染 。从培养瓶中刮下感染的细胞 ，通过离心收集 ，并重悬于1 mL DMEM中，补充了2％FBS（DMEM – 2％FBS）。将病毒储备冷冻三次，并超声释放细胞内病毒颗粒 ，并通过对BS-C-1细胞上的斑块测定法测量病毒感染性 。
使用UCSC基因组浏览器设计的单个指南RNA靶向编码TRIM5 ，CYPA或小的G蛋白信号调节剂的基因组DNA，将其用作非靶向 ，负面对照 ，将其置于CRISPR – CAS9元素PX45988888888888888888888888888的sativa Japonica组（RIES） 。用于TRIM5α，TRIM5γ和TRIM5δ同工型的cDNA从用IFNα刺激的HEK293T细胞扩增 ，并将其克隆到具有FLAG或TAP TAGS的基于PCDNA4/至基于PCDNA4/的质粒中；TAP标签由链球菌II表位的两个副本和一份旗帜表位副本组成57。将用于PPIA的cDNA用DNA在5'端的DNA中克隆到PCDNA4/TO中 。通过使用Q5位置定向的诱变试剂盒（按照制造商（New England biolabs）指示 ，将带有氨基酸取代的突变体的TRIM5α和PPIA基因）被克隆到PCDNA4/中，并用DNA编码TAPTAS将质粒克隆到5'''Ender的DNA中 。TRIM5α结构域缺失突变体 ，环（氨基酸1-87） ，RB（氨基酸1-129），BSC（氨基酸90-493） ，CS（氨基酸130-493）和Δspry（氨基酸1-280） ，由PCR从Trim5α的表达中产生。通过Genscript Biotech合成了Vacv-WR L3L密码子优化用于人类细胞中的表达，并将其克隆到PCDNA3和PCDNA4//pCDNA4//质粒中，分别在5'端具有DNA编码HA和TAP TAGS的质粒。来自MPXV UK2022（OP413717.1） ，MPXV Zaire（NP_536509.1）和India 1967（APR62813.1）的L3L直系同源物是通过站点定向的密码子刺激的诱变而产生的 。以前已经描述了表达VACV-WR蛋白C6 ，B14和N1的基于pCDNA4/至基于表达VACV-WR蛋白的质粒 。通过Geneart（Thermo Fisher）合成了cODON优化的VACV-WR C1L，并将其克隆到基于PCDNA4/至基于质粒的质粒中。从病毒基因组DNA（对于CPXV ，RPXV ，ElephantPox病毒和CMLV）扩增了来自正托病毒的C6L， 由Genscript Biotech（用于MPXV UK22）或由位置定向的诱变（分别为MPXV Zaire和CORDIMON-OPTIMITIMET MPXV UK2022和VACV C6L的VARV）生成的密码子进行了反序和合成 ，并将其串入PCDNA4/top tag tag tag tag tag tag eind od tag nod od of pcdna4/varv 。NF-κB萤火虫荧光素酶记者和TK-Renilla荧光素酶质粒是来自A. Bowie（爱尔兰三一学院 ，都柏林）的礼物 。对于体外转录和翻译测定，HDAC5 – HA ，HDAC1 – HA ，HA –TRIM5α，HA – L3L ，TAP – L3L ，TAP-TRIM5α，TAP-TRIM5α（ΔSpry）（ΔSpry），TAP-CYPA（PPIA） ，TAP – L3L和TAP – C6 l从PCDNA4/tapne cymplied放大到pcdna4/tapne clasts and。进入PF3A WG（BYDV）质粒（Promega） 。为了构建具有不同标签（HA或TAP）蛋白质的向量 ，使用限制性酶来消化一个无一个矢量的无标签的开放式阅读框架，并将其取代到编码另一个标签的另一个向量 。补充表2列出了用于克隆和测序的寡核苷酸和引物。补充表3中描述了质粒的完整列表 。
为了生成TRIM5和CYPA CRISPR – CAS9基因敲除细胞系 ，将HELA（用于TRIM5 - / - ）和T-REX-293（TRIM5 - / - 和CYPA - / - ）克隆细胞被用PX459衍生的质粒表达靶向其相应基因的单个指导RNA 。选择转染的细胞 ，用1μgml -1嘌呤霉素，并通过限制稀释度获得的克隆细胞系通过免疫印迹和TOPO TA克隆（Thermo Fisher）和DNA测序筛选。T-Rex-293细胞中TER抑制剂（TETR）的T-Rex-293细胞中TER5同工型的互补和过表达的过表达是通过稳定的线性化pcDNA4/基于基于的质粒的稳定转染来完成的 。在补充有10μgml -1 blasticidin（Thermo Fisher）和100μgml -1 Zeocin（Gibco）的DMEM – 10％FBS中选择转染的细胞 。
对于病毒生长测定 ，每个细胞至少3次用0.01或5 PFU感染细胞。将接种物在1 HPI处除去 ，并用温暖的DMEM洗涤一次细胞，并用DMEM – 2％FBS覆盖。每个细胞感染分别在16和24 HPI中收获5和0.01 PFU ，并进行冻融三次并进行超声处理 。对于MPXV生长测定 ，将感染的细胞以48 hpi收获，每个细胞感染为0.01 PFU 。通过BS-C-1细胞上的斑块测定确定传染性病毒滴度。为了评估病毒扩散 ，T-REX-293或HELA细胞单层以每口孔50-300 PFU感染VA5L – EGFP22 ，并用补充了2 mM-谷氨酰胺的MEM-2％FBS覆盖，并覆盖了2％的羧甲基纤维素 。以24 hpi的形式拍摄斑块，并使用ImageJ测量斑块尺寸 。为了进行免疫印迹 ，共沉淀和免疫荧光测定 ，细胞在DMEM – 2％FBS中感染了适当的病毒。为了感染VL3LI（指示），在感染时添加了25μMIPTG ，以诱导L3L的表达 。在37°C下进行病毒吸附1小时 ，然后用DMEM – 2％FBS覆盖细胞 。
使用HELA细胞的Transit-LT1试剂（MIRUS BIO）和T-REX-293（用于报告基因测定法和质谱）或HEK293T或T-REX-REX-REX-REX-293细胞进行转染。在转染当天，将细胞播种在适当的组织培养皿中 ，达到50％汇合 。将所需量的质粒DNA和Transit-LT1（Mirus Bio）或聚乙基亚胺（每1μgDNA2μL）混合到Opti-MEM（Gibco）（Gibco）（每1μgDNA）中 ，并在室温下孵育25分钟 。将培养基与DMEM – 2％FBS补充，并将转染混合物滴入细胞中。
将细胞刮擦 ，用PBS（Sigma-Aldrich）洗涤两次 ，并用细胞裂解缓冲液（50 mM Tris-HCl（pH 8.0），150 mm NaCl ，1 mm EDTA ，10％（V/V）甘油，1％（V/V），Triton X-100和0.05％（V/V）（V/V/V/V/V/v）NP-40和Mini Min和NP-40和NP-40和NP-40和NP-40和NP-40和NP-40 ，磷酸酶（Phosstop ，Roche）抑制剂在冰上抑制40分钟 。通过以13,000g离心在4°C下以13,000克离心10分钟来阐明细胞裂解物 。使用Pierce BCA蛋白测定（Thermo Fisher）测定蛋白质浓度。将Laemmli缓冲液（5×）添加到样品中，并在100°C煮沸10分钟。将相等浓度的蛋白质样品加载到SDS-聚丙烯酰胺凝胶或NUPAGE 4-12％BIS-Tris预制凝胶（Invitrogen）上 ，通过电泳分离 ，并转移到硝酸纤维素膜（GE Healthcare）中 。将膜在室温下用5％（v/v）的TBS中的5％（v/v）脱落，含有0.1％（v/v）Tween-20（TBS/T） ，持续1小时 ，然后在室温下与适当的原始抗体孵育1小时或在4°C下孵育过夜 。用TBS/T洗涤三个5分钟后，将膜与荧光团偶联的二抗（Li-Cor Biosciences）在室温下孵育1小时。用TBS/T将膜洗涤3次 ，并在成像之前干燥 。使用Image Studio软件（LI-COR Biosciences）对免疫印迹和图表中指示的条带强度进行了标准化 ，并标准化为蛋白质的负载控制水平（α-肌动蛋白或GAPDH） 。补充表4列出了使用的原始和二抗。
将T-Rex-293或HEK293T细胞播种在10厘米的培养皿中，用指示的表位标记的质粒转染 ，或转染 ，然后转染特定的病毒 。转染后24小时收集细胞，或在冰上12 hpi收集细胞，并用冰冷的PBS洗涤两次 。为了与链球菌 - - - - tactin superflow琼脂糖树脂（IBA）共同沉积 ，PBS中的0.5％NP-40用作裂解和洗涤缓冲液。为了用抗HA琼脂糖（Sigma-Aldrich）免疫沉淀 ，使用HA裂解/洗涤缓冲液（50 mM Tris-HCl（pH 6.8），150 mM NaCl和1％NP-40） 。裂解缓冲液补充了蛋白酶（完整的Mini ，Roche）和磷酸酶（Phosstop ，Roche）抑制剂 。裂解在4°C下进行3小时。通过在4°C下以13,000克离心15分钟来收集不溶性馏分 。收集了10％的可溶性馏分作为输入，其余体积在4°C下与适当的树脂一起孵育16小时 。用冰冷的洗涤缓冲液洗涤蛋白质结合的树脂 ，并通过在2x Laemmli缓冲液中煮沸 ，然后通过SDS-PAGE和免疫印迹分析，从而洗脱蛋白质。
根据制造商的说明 ，将相等量的PF3A衍生的质粒添加到TNT SP6高产量小麦发芽蛋白表达系统（Promega）中 ，并在适当的情况下将10μMCSA添加到混合物中。
将T-Rex-293衍生的细胞系种植在六孔板中的多赖氨酸（Sigma-Aldrich）涂层的无菌玻璃盖玻片上 。用150 ng ml -1强力霉素（Melford）转染或诱导细胞，以在每个细胞2.5 pfu之前用适当的VACV菌株在感染前至少12小时表达感兴趣的蛋白质 。要收获 ，将细胞用温暖的PBS洗涤两次 ，并用4％（v/v）多聚甲醛固定15分钟。将样品用150毫米氯化铵淬灭5分钟，用PBS洗涤两次，并用0.1％Triton X-100在PBS中透化5分钟 。将细胞用PBS中的10％（v/v）FBS封闭30分钟 ，然后在室温下用10％（v/v）FBS染色的10％（v/v）FBS染色1小时 。将盖玻片用10％（v/v）在PBS中洗涤3次 ，每人5分钟，并与适当的Alexafluor荧光团偶联的二抗（分子探针）在10％（v/v）FBS中稀释的PBS中稀释的PBS中与相应的正常血清中的2.5％（donkey Atkey Atkey Atkey或got gothem-hterme s inich; sigmma-s inich; sigmma-a inich inich ichich inich ichich inich ichich;用PBS中的10％（v/v）FBS洗涤盖玻片3次 ，然后用PBS洗涤一次 ，然后用含有0.5μgml-1 4'，6-Diamidino-2-phenylylinyylinyylinylindole（DAPI; Biotium; Biotium）的Mowiol 4-88（Calbiochem）安装在载玻片上。使用ZEN系统软件（Zeiss）在LSM700共聚焦显微镜（Zeiss）上获取图像 。免疫荧光中使用的抗体在补充表4中列出 。
T-Rex-293 Trim5 - / - 或Trim5 - / - Cypa - / - 细胞在96孔板中播种 ，并在50％汇合时使用。使用Transit-LT1（Mirus Bio）共同转染表达标记蛋白的质粒与100 ng-κB-核酸酶和10 ng肾荧光素酶报告质粒共转染 。为了诱导蛋白质表达 ，在转染时加入150 ng ml -1强力霉素 。然后在被动裂解缓冲液（Promega）中收获细胞。测量萤火虫荧光素酶活性并标准化为肾荧光素酶对照，并计算相对于空载体的折叠诱导 。通过免疫印迹确定蛋白质表达水平 。
T-REX-293 TRIM5 - / - CYPA - / - 细胞通过稳定的转染与空载体或Tags Tagged CYPA相辅相成 ，每个样品中的三个10厘米盘中播种 ，并在第二天以50％融合使用。转染或诱导细胞分别表达TAP标记的TRIM5α或CYPA，持续12小时 ，然后以每个细胞为3 pfu感染VΔC6 ，持续10小时，持续10 h。在适当的情况下，在1 HPI处添加20μMCSA 。为了收获细胞 ，将它们用冰冷的PBS刮擦并洗涤两次 ，然后在1 ml IP裂解缓冲液（PBS中的0.5％NP-40）中裂解，并在4°C下添加蛋白酶（完整的Mini ，Roche）和磷酸酶（Phosstop ，Roche，Roche ，Roche）的磷酸酶（Phosstop ，phosstop，Roche）2 h 。通过在4°C下以13,000克离心15分钟来除去不溶性馏分。在可溶性级分中 ，将10％收集为输入 ，其余部分与抗Flag M2琼脂糖珠（Sigma）在4°C下孵育2小时 。用冰冷的洗涤缓冲液洗涤蛋白质结合的树脂 。将树脂结合的蛋白用250μgml-1的Flag肽溶液（Sigma-Aldrich）在4°C下洗脱1.5 h，然后将洗脱的馏分转移到新鲜管中 ，并在4°C下用链球链球菌超级流量琼脂糖树脂（IBA）孵育8小时。用冰冷的洗涤缓冲液洗涤蛋白质结合的树脂 。在树脂结合的蛋白中 ，通过在2x Laemmli缓冲液中煮沸25％，然后通过SDS-PAGE和COOMASSIE染色分析以验证下拉效率 。
使用S-trap方案（ProtiFI）减少，烷基化和胰蛋白酶消化的剩余体积。将所得的胰蛋白酶肽冻干并重新溶解在3％乙腈和0.1％三氟乙酸中 。使用Q精确加上与配备有100-µm ID×2厘米好评的PEPMAP PROPOMAP PROCOLMAP（THERMO FISHER）和50-µm ID×50 cm ，2- µm粒子粒子粒子颗粒Pepmap Pepmap Rslc Rslc RSLC RSLC RSLC分析列的最终3000 RSLC NANO UHPLC耦合获得质谱数据 。用分析溶剂A（0.1％甲酸）和溶剂B（80％乙腈加0.1％甲酸） ，负载溶剂为0.1％甲酸。在开始分析梯度之前，将样品在5 µl min -1中加载5分钟 。分析梯度在67分钟内为10–40％B ，在80分钟内增加到95％B ，然后在95％B时进行4分钟的洗涤，并在3％B时平衡12分钟 。柱保持在40°C。数据以数据依赖性的采集模式获取 ，并具有以下设置：（1）质谱的第一阶段（MS1）：400–1,500 th ，17,500分辨率，1×105自动增益控制目标和250 ms的最大注射时间。（2）MS2：在M/z 3.0的隔离宽度和更高能源的C陷阱解离片段（归一化碰撞能量30）处的四极杆分离 。将动态排除设置为30 s ，并在3.2×104及以上的前体上触发MS2片段化 。使用MaxQuant（V.2.0.1.0）处理RAW文件 ，并针对人类Uniprot数据库进行搜索（于2020年9月23日下载）和一个Uniprot vercinia病毒数据库（于2022年3月10日下载）。用氧化（M）和乙酰基（蛋白质N末端）作为固定修饰，将氨基甲米甲基（C）设置为可变肽修饰 。使用Perseus软件（1.6.2.1）59进行了其他分析 ，在去除潜在污染物和反向蛋白质鉴定后 ，获得样品相对蛋白丰度，并获得了相对蛋白的丰度，并获得了相对蛋白质的丰度 。 和数据插补以说明各个样本中缺少值。用双面学生的t检验进行了空矢量和TRIM5或CYPA下拉之间的比较 ，其显着性截止值是由基于排序的错误发现率定义的0.05 ，S0参数为0.1和250置换率（在Perseus中实现） 。
质谱蛋白质组学数据已沉积到proteomexchange联盟（http://www.proteomexchange.org/）合作伙伴IPROX REPOSITION60，与数据集识别器IPX0005650001和PXD039094 。
如先前所述61 ，对NF-κB反应基因进行了逆转录（RT-QPCR）分析的定量PCR。简而言之 ，对Trim5 - / - CYPA - / - 细胞系进行了修改，以表达诱导VACV TAP标记的L3或空载体 。将这些细胞以每孔的6×105细胞密度为12孔板中 。第二天 ，将这些细胞在没有血清的培养基中孵育3小时 ，然后用多西环素（150 ng ml-1）进行模拟处理或处理4小时。从细胞中提取总RNA，并使用Oligo-DT引物（Thermo Fisher）通过逆转录合成cDNA 。NF-κB反应基因NFKBIA ，CCL2 ，CXCL8，CXCL10 ，IL6和管家控制基因GAPDH的mRNA水平通过QPCR使用快速SYBR Green Master Mix（Thermo Fisher）和VIIA 7实时PCR机器（Thermo Fisher）测量 。使用诱导的T-Rex-293空载体和GAPDH作为内部对照 ，通过2-ΔΔCT方法计算了mRNA水平的折叠诱导。QPCR中使用的引物在补充表2中列出。
正ox病毒基因组中C6L直系同源物的标识符如下：VADV（YP_232904.1），RPXV（AAS49727.1），CPXV（NP_619819.1） ，CMLV（NP_570410.1） ，MPXV UK 2022222222222222222222222. UW 。Zaire（NP_536441.1）和Varv Major Strain India 1967（p0dsx3.1） 。正ox病毒基因组中L3L直系同源物的标识符如下：VADV（YP_232972.1），RPXV（AAS49792.1） ，CPXV（ADZ24099.1） ，CMLV，CMLV（NP_570478.1） ，MPXV UK 202222333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333223333333333333333222222222222223年333岁。Zaire（NP_536509.1）和Varv Major Prain India 1967（APR62813.1） 。使用Clustal Omega对齐氨基酸序列 。
数据以平均值±S.E.M.表示 ，并使用Welch的ANOVA测试在PRISM（GraphPad）中分析了统计显着性，然后进行了事后Dunnett的T3 T3多重比较测试 ，其中指示或两尾未涂的t检验与Welch的校正。确切的P值在每个图中显示 ，水平条表示要比较样品 。每个实验中的重复序列数量和N值在相应的图例中指示；n代表生物学重复的数量 。
有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得。
本文来自作者[admin]投稿，不代表永利号立场，如若转载，请注明出处：http://www.siyonli.com/jyfx/202506-1699.html
评论列表（3条）
我是永利号的签约作者“admin”
本文概览： The following cell lines were used in this study: human fetal foreskin fibroblast cell...
文章不错《TRIM5α限制了痘病毒，并被CYPA和病毒蛋白C6拮抗》内容很有帮助