斑马鱼（Danio Rerio）在28°C下在14 h – 10 h的灯光周期下维持 ，并根据欧洲和国家伦理和动物福利指南在经过认证的动物设施（LA1500474）中在标准条件下升高 。所有动物程序均由相应的道德委员会（委员会D'Ethique et duBienêtreAnimal（Cebea）
，Universitélibrede Bruxelles，协议批准编号：CEBEA-IBMM-2016：65和CEBEA-07 GOS IBMM）
。如先前所述51进行了斑马鱼分期。The following published transgenic and mutant lines have been used in this study: Tg(kdrl:EGFP)s843 (ref. 52), Tg(kdrl:ras-mCherry)s896 (ref. 53), Tg(7xTCF-Xla.Siam:GFP)ia4 (ref. 54), Tg(fli1a:Gal4FF)ubs3 (ref. 55),TG（UAS：KAEDE）RK8（REF 。56） ，TG（UAS：GCAMP7A）ZF415（REF
。57）
，TG（GATA1：DSRED）SD2（REF。58），GPR124S984（REF 。11） ，REF
。11）
，WND7AAAAULB2（REF。17），REF 。17） ，kdr.59（Ref。59）（kreuc.59）（Rec.ucreb3）（Rec.ureb3）（krec.ureb3）（k. 59）（krec.ureb3（urec.ureb3）（Ref
。60）和COL4A5S510（参考文献45）。MMP25AULB26和MMP25BULB27等位基因是在本研究中使用CRISPR -CAS9诱变产生的 。所有斑马鱼实验均在施肥后5天以下的胚胎和幼虫上进行，然后才能独立进食
。 　　在标准条件下
，在12 h – 12 h的灯光周期下，在20°C下饲养小鼠 ，并根据欧洲和国家道德和动物福利指南保持在经过认证的动物设施（LA1500474）中。相对环境湿度水平为45％至65％ 。所有动物程序均由相应的道德委员会批准（委员会D'Ethique et duBienêtreAnimal（Cebea）
，Universitélibrede Bruxelles，协议批准编号：CEBEA-08 GOS IBMM）
。将小鼠维持在C57BL/6J背景上 ，对于实验
，使用了两种性别的小鼠。Bat-Gal Reporter（B6.CG-TG（BAT-LACZ）3PICC/J）MICE61和MMP25-KNOCKOUT MICE23分别由S. Piccolo和C.López-Otín提供 。Vascular networks were quantified as the number of CNS-invading sprouts in the E10.5 midbrain and forebrain in five consecutive 60 μm sections, and as the organ surface-normalized vascular density (length or surface, depending on the vascular morphologies) in 60 μm sections of E10.5 forelimbs and E12.5 intestine, stomach, liver and lung. 　　如先前所述，使用CRISPR -CAS9生成了种系斑马鱼MMP25AULB26和MMP25BULB27等位基因62
。使用CRISPOR（V.5.01）63选择目标位点。将以下引物退火并克隆到PT7-GRNA载体中（Addgene ，46759）：5'-Taggggggagcaatgccctgcgcgagtg-3'和5'-aaccaccactcgcaggggcattgcctcattgcc-3'；5'-tagggGacagctacagagaaga-3'和5'-aActctttgcttgctgtgtgtgtcc-3'用于MMP25B 。SGRNA通过BAMHI-LINEAREARIZED PT7-GRNA载体的体外转录（Hiscribe T7快速高产量RNA合成试剂盒； New England Biolabs）合成
。MMP25a靶向外显子4（催化结构域）
，MMP25B靶向外显子2（亲域）。使用MMESSAGE MMACHINE T3试剂盒（Ambion）从Xbai-Learearized PT3TS-NLS-ZCAS9-NLS载体（Addgene，46757）中转录合成上限的ZCAS9 mRNA 。在单细胞阶段进行了SGRNA（每个30 pg）和NLS-ZCAS9-NLS mRNA（150 pg）的共同注射。 　　对于体细胞基因破坏 ，使用以下引物对合成了两个靶向同一外显子的SGRNA：MMP2 SGRNA1：5'-taggggggggggggggggggaCtttatgatgggtggtggtg-3'和5'-aaaaccaccaccaccccatcatcataaaagttccccc-3'';MMP2 SGRNA2：5'-taggggaActttattatgatgggtga-3'和5'-aaActcacccatcatCataAagttcc-3';MMP14B SGRNA1：5'-taggccagtccatttgatggaga-3'和5'-aActctccatccatccatcaaaatggactgg-3';MMP14B SGRNA2：5'-taggattcctgggagtaagcat-3'和5'-aaacatgcttacttacttcccagggaat-3';MMP25A SGRNA1：5'-tagggGCAATGCCCTGCGAGTG-3'和5'-AAACCACTCGCAGGGGGGGCATTGCC-3';MMP25A SGRNA2：5'-tagggtctggtggtgcttatttt-3'和5'-aaaAcaaaaaAtaAgcctccctcaccagac-3';MMP25B SGRNA1：5'-taggtaggactggtgcgcgcggta-3'和5'-aActaccggcgctCaaCcagtccta-3';MMP25B SGRNA2：5'-taggaggaggcagatatccatac-3'和5'-aaAcgTatgatgatgatCtgcctcctcct-3';LAMA1 SGRNA1：5'-TAGGGACGGCCGTCAGTCCACT-3'和5'-AAAACAGTGGAACTGACTGACGCGCCGCGTTC-3';LAMA1 SGRNA2：5'-TAGGCGGACTCCCCACAGGT-3'和5'-AAACACCTGTGGTGGTGGTGGTGGCAGAGAGTCCG-3';LAMA1 SGRNA1-SCRAMBLED：5'-TAGGGAGGAGGCCGTCAGTTACCTC-3'和5'-AAACGAGGGTAACTGACGGCGCGCGTTC-3';LAMA1 SGRNA2-SCRAMBLED：5'-TAGGCGGACTCCCCCCCGATGAC-3'和5'-AAACGTCATCATCGGTGGTGGTGGCAGAGTCCG-3';LAMA2 SGRNA1：5'-TAGGCGCGCAGCAGGCTCCGGTCAG-3'和5'-AAACCTGACGCGGCCTGTCTGCGCG-3';LAMA2 SGRNA2：5'-TAGGTCAGCGGGTCACAGCTCAG-3'和5'-AAACCTGAGCTGTGACCCCCGCTGACCTGA-3'
。LAMA2 SGRNA1-SCRAMBLED：5'-TAGGCGCACAGGCTCCACGGGT-3'和5'-AAACACACCCCGTGGTGGCCTGTCTGCG-3';LAMA2 SGRNA2-SCRAMBLED：5'-TAGGTCAGCGGGTCACATGCAGC-3'和5'-AAACGCTGCATGCATGCATGCCCCCGCTGACCTGA-3';COL4A1 SGRNA1：5'-taggataggtcctggcggtcgggg-3'和5'-aaaccccgcgcgcgcgcgcgccgcaggacctat-3';COL4A1 SGRNA2：5'-TAGGCAGGTCCCAAAGGAACTGAT-3'和5'-AAAACATCAGTTCCTTTGGACCTG-3';COL4A2 SGRNA1：5'-TAGGTGGCAGTCCCGGATCTCCAG-3'和5'-AAACCTGGAGATCCGGGACTGCCA-3';COL4A2 SGRNA2：5'-TAGGAGGGGTTTGGATGGAGCTTCAG-3'和5'-AAACCTGAAGCTCCATCCATCCAAACCT-3';COL4A3 SGRNA1：5'-taggaaggttgtgtgctgggggttca-3'和5'-aaactgaAcccccagcagcacaAcctt-3';COL4A3 SGRNA2：5'-taggaaggattcccaggattgtgt-3'和5'-aaacacacaatcctgggaatcctt-3'; COL4A4 SGRNA1：5'-TAGGTGGGTGTCGACGGCCCCCAG-3'和5'-AAACCTGGGGCCCTGCCTGCCTGTCGACCCA-3';COL4A4 SGRNA2：5'-taggagaAccttggggcccctgg-3'和5'-aaacccagggggccccaaggcccaaggttct-3';COL4A5 SGRNA1：5'-taggcctgggaaacctggaacacc-3'和5'-aaAcggtgtgtgtgttccaggttttccccagg-3';COL4A5 SGRNA2：5'-TAGGCCGGGGTTAAAGGGTCAGCC-3'和5'-AAACGGCTGACCTTAAACCCGG-3';COL4A6 SGRNA1：5'-TAGGCTTGGACCAGTGGGCAGCGG-3'和5'-AAACCCCGCTGCCCCCACTGCGCCACTGGTCCAAG-3';COL4A6 SGRNA2：5'-taggatggggggccgcgcgcgcgcagtt-3'和5'-aaacaactggtcccgggccccccccccccat-3';serpina1 sgrna1：5'-taggtgctgccttgctgctggtggtagcaa-3'和5'-aActtgctaccagcagcaaggcagcagcagcagca-3';serpina1 sgrna2：5'-taggctggtggtagcaAcggcctggg-3'和5'-aaaccccccaggccgcgcgcgttgctaccag-3'。 　　通过使用Illumina Eco实时PCR系统
，通过高分辨率熔体分析（HRMA）对体细胞基因破坏的效率进行了评分，并使用Illumina Amplicon深层测序（Azenta Life Sciences）进一步表征 。 　　斑马鱼GPR124S984 ，WNT7AAULB2，KDRLHU5088
，RECKULB3和COL4A5S510和鼠标MMP25等位基因是基因分型的，如前所述11,17,23,45,59,60
。MMP25AULB26和MMP25BULB27等位基因是通过高分辨率融化分析（Eco Illumina实时PCR系统）使用以下引物进行基因分型的：5'TTTTTTCCCCTCCTCCTCCTCCTCAGTGTC-3'''和5'-GTGGAAACGACGAGAACGCAGAGGGTGGTGTGTGTGTGT-35'-CGCACAGGACCTACAGAGAG-3'和5'-CTGCATTTCTCTCTATGGCTCTCTCG-3'用于MMP25B。 　　MOs targeting gpr124 (4 ng; splice blocking; ACTGATATTGATTTAACTCACCACA)11, reck (0.4 ng; splice blocking; CAGGTAGCAGCCGTCACTCACTCTC)64, wnt7aa (4 ng; splice blocking; TTCCATTTGACCCTACTTACCCAAT)17, lama1 (0.5 ng; translation blocking;ATCTCCATCATCGCTCAAACTAAAG), lama2 (1 ng; translation blocking GCCACTAAACTCCGCGTGTCCATGT), lama4 (0.5 ng; translation blocking; GCCATGATTCCCCCTGCAACAACTT), lama5 (0.25 ng; translation blocking; CTCGTCCTGATGGTCCCCTCGCCAT)65,lamb1a (0.125 ng; translation blocking; TATTTCCAGTTTCTTTCTTCAGCGG), lamc1 (0.125 ng; translation blocking; TGTGCCTTTTGCTATTGCGACCTC)66, col4a1 (1 ng; translation blocking; ACACATGGAAGCCGCATCTTCACAC)67, col4a2 (2 ng;translation blocking; TTCTCACCCTCCATGCGAGCCTAAA), col4a5 (2 ng; translation blocking; ATGTTCCTCTGTTAAGCTAACTGCA), col4a6 (2 ng; translation blocking; AGGTAAAGTAGGCTATCCTCCTCGT) were obtained from Gene Tools and were injected at the zygotic stage at the indicated doses.注入标准对照MO（CCTCTTACCTCAGTTACAATTTATA ，最多8 ng）不会影响脑脉管系统 。 　　通过在单细胞阶段25 pg的TOL2转座酶mRNA和25 pg的PTOL2-FLI1A：KDRL-2A-NLS-MTAGBFP2
，PTOL2-FLI1A：MMP25B-2A-TAGRFP，TOL2-FLI1A：MMP25B-2A-TAGRFP ，PTOL2-FLI1A：MMP25BΔZN2+-BD-2A-TAGRFP或PTOL2-FLI1A：MMP25BZN2+-BDH237A
，H241A，H247A-2A-2A-TAGRFP构建体68
。 　　使用Mmessage Mmachine SP6试剂盒（Thermo Fisher Scientific）在体外从Noti-Linearized PCS2+构建体进行盖帽mRNA转录 ，并以200 pg的剂量在单细胞阶段注射。编码Zn2+结合域（Zn2+-bd; His237 – His247）的片段被删除在ΔZN2+-BD MMP25B变体中 。在Zn2+-BDH237A
，H241A，H247A变体中 ，三个对Zn2+螯合所必需的组氨酸被丙氨酸取代
，缩写为Zn2+-BDH-A
。在Pro -MMP2 mRNA变体中，删除了编码Prodomain（ALA30 -VAL107）的序列。与GPI+ MMP2变体中的MMP25B（Ser658-GLN697）相对应的MMP25B（SER658 – GLN697）的序列与MMP2 ORF融合 。 　　主机TG（KDRL：RAS-MCHERRY）S896和供体TG（KDRL：EGFP）S843 S843胚胎在28°C的1/3 Ringer溶液中用Pronase（Millipore ，53702; 1 mg Ml-1）在5分钟的1/3 Ringer溶液中用pronase（Millipore，53702; 1 mg Ml-1）进行解剖
，并补充penicillin（50 u mml-1）（50 u mml-1）（50 u mml-mlym1）和Stropt-stropt-lock-1）
。随后将胚胎在同一培养基中的琼脂糖涂层菜肴上孵育。在中间阶段，将20至50个供体细胞移植到阶段匹配的宿主胚胎的胚胚缘 。移植后 ，将胚胎孵育直至指定的阶段。在使用Leica M165立体显微镜评估EGFP+移植细胞的贡献后
，使用延时共聚焦显微镜记录镶嵌血管
。定义基因型对TC位置的细胞的贡献被计算为镶嵌血管总数（CTAS或ISV）的比例。对TC位置在内部次级分支中的贡献被评分为初始脑介入脑部CTA中茎细胞基因型的比例 。 　　斑马鱼和小鼠胚胎固定在PBS中的4％多聚甲醛（PFA）中
。对于切片，将胚胎在PBS中洗涤 ，并在4°C下在PBS（w/v）中平衡30％蔗糖。然后将胚胎安装在7.5％的明胶（w/v）中
，在PBS中安装15％蔗糖（w/v），并储存在-80°C下 。斑马鱼和小鼠胚胎分别在-30°C下使用Leica CM1850低温恒温器（Leica）切成20和60 µm冷冻切片
。 　　对于免疫荧光染色 ，将切片用PBS Triton X-100（0.4％; PBST）洗涤3次
，持续5分钟，使用阻止缓冲液（PBST ，5％山羊血清）封闭1小时
，然后在4°C下盖上封闭缓冲液中的原代抗体孵育。在PBST中进行三个洗涤步骤5分钟后，将切片暴露于在4°C下封闭含有0.001％DAPI过夜的缓冲液中稀释的二抗 。在PBST中进行三个洗涤步骤5分钟后 ，将切片安装在Dako荧光安装培养基中（Agilent，S3023）
。The following primary antibodies and lectin were used: rabbit anti-laminin-111 (Merck, L9393, 1:250, used for zebrafish immunostaining, polyclonal immunization with an Engelbreth–Holm–Swarm mouse sarcoma extract), rat anti-laminin-111 (R&D systems, MAB4656, 1:250, used for mouse immunostainings,对LAMA1/B1）
，鸡抗GFP（Aves Labs，GFP-1020 ，1：200）的单克隆反应性
，IV型兔抗胶原型（Sigma-Aldrich，AB756P ，1：300）
，鸡抗β-Galactsidase，Abcam ，Abcam
，AB9361，1：1：1：300）结合（ABCAM ，AB196149
，1：250）和分离蛋白B4-AF594结合（Thermo Fischer Scientific，I21413 ，1：200）。使用了以下二级抗体：山羊抗chicken AF488（Thermo Fischer Scientific，A11039
，1：500），山羊抗兔AF594（Thermo Fischer Scientific ，A11012
，1：500）和DONKEY ANTIKEY ANTIKEINANKE ANTIKEN AFI-RAT AFI-RAT AF647（THERMO FISCHERIDIC，1.500） ，A4427272727272727272 。 　　对于原位杂交
，使用DIG RNA标记套件和SP6 RNA聚合酶（Roche）通过体外转录产生二氧素（DIG）标记的反义核糖核；从48 hpf WT胚胎cDNA放大模板，并使用以下引物克隆到NCOI/SACI消化的PGEMT中：KDRL：5'-GCATGCTCCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCATGGCAGGCAGGATGGCAGGATGCAGTTGATTGAGTGAGTGGTGG-3'''和and and5'-catccaacgcgtgtgggagctctagtgtggggtcctcaatccgcag-3';MMP25B：5'-ATGAGTTTTCTCAGGATTCTTGGTCTGG-3'和5'-TTATTGCGAGTTGAAGCCCAATATATGAAGC-3';MMP14B：5'-GCATGCTCCCGCCGCCGCCGCCATGGTGGTGCCTCTCTCTCTCTCTACACG-3'和5'-CATCCAACGCGCGCGCGTGCGTGGCCCCATGCTGCTGCTGCTGCTGCTGGAAATGTGTGC-3';MMP2：5'-GCATGCTCCCGCGCCGCCGCCATGCTGCTCACACACACAAAGAAGAGAGAGTGG-3'和5'-CATCCAACGCGCGCGCGCGTGCGTTGGCTTTTCCTGACATCATCAGCCGCGTCC-3';MMP9：5'-GCATGCTCCGCCGCCGCCGCCATGCATGCTGTGTGTCGTGACGTTCCC-3'和5'-CATCCAACGCGCGCGCGTGCGTGGGAGCTCCTCTCCTTGATTGATTTGGCGCAGGCAGGCATCG-3'';LAMA1：5'-GCATGCTCCGCCGCCGCCATGCGCACAAACAAACAAAGCCGACGACTG-3'和5'-CATCCAACGCGCGCGTGCGTGGCTGCTCTGCGTCGTTCCCTCCTCAGCGCTGCTGTGT-3';COL4A1：5'-GCATGCTCCGCCGCCGCCGCCATGGGGGGGGGGGGGTGAAGGAGGTG-3'和5'-CATCCAACGCGCGCGTGCGTGCGCCCCCCTCTCTTCATGCACACTTGAC-3';COL4A2：5'-GCATGCTCCGCCGCCGCCCATGCCTAAAGGAGAGAGATACCGGACCC-3'和5'-catccaacgcgcgcgcgcgtgcgtggcctcctcctacggttcttcattcatgcacacac-3';COL4A3：5'-GCATGCTCCGCCGCCGCCGCCATGGACAAAAAAAGGACAGTGTGGTGTGTC-3'和5'-CATCCAACGCGCGCGTGCGTGGCGCAGCCAGGCAAGGCCACCTTGAGGGCTTGAGGCTGCTGTGTTGTTG-3' ，COL4A4：COL4A4：COL4A4：5'-GCATGCTCCGCCGCCGCCATGGCTGGGTCCCAGTGGTGCAAAAG-3'和5'-CATCCAACGCGCGCGCGCGTGGTGGCTCCCTCCATTGGTGGTGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGTCATTCATC-3';COL4A5：5'-GCATGCTCCGCGCCGCCGCCATGGGGGTTTTTTTCCAGGATCTAAAGGAG-3'和5'-catccaacgcgcgcgcgcgcgcgtggcgcgtccgtcctctttcatacacacaccaccac-3';COL4A6：5'-GCATGCTCCGCGCCGCCGCCATGCGCGTCCAGGAATAATAAGGACC-3'和5'-CATCCAACGCGCGTGCGTGGTGGGAGCTCCTACCTACACAAGATCTTCATGCAGAGAC-3';SLC2A1A：5'-GCATGCTCCCGCCGCCGCCGCCATGCACTTGGCATTGTCATTG-3'和5'-CATCCAACGCGCGCGTGCGTGGCGTCGGTCGGTGTGTGATCTCTTCTTCAAACG-3';SLC16A1A：5'-GCATGCTCCCGCGCCGCCGCCCATGCCTCCCCCCAGCAACAGGAGGG-3'和5'-CATCCAACGCGCGCGCGTGCGCGTGCTCCTATACCCTATACGACTCCATCCATCTGCCTCCTCCTCCTTTTTTTT-3'; FABP11A：5'-GCATGCTCCGCCGCCGCCGCCATGATGATCAATCTCAATTTACAGCTGTGTGTG-3'和5'-catccaacgcgcgcgcgcgtggcgtggctttcaaagcaccaccataaagactaaagactgataat-3'
。如先前所述的69使用抗Dig-Ap抗体（Merck
，11093274910，1：10,000） ，进行了整个定期的发色原位杂交。使用抗数据POD抗体（Merck
，11207733910，1：1,000）和TSA Plus CY3检测试剂盒（Akoya Biosciences ，NEL7444001KT），使用抗DIG POD抗体（默克
，11207733910，1：1,000）进行合并的免疫染色和鱼 。 　　TG（FLI1A：GAL4FF）UBS3;（UAS：KAEDE）RK8 PHBC或CTA ECS的光转化是使用Zeiss LSM710共聚焦显微镜（Carl Zeiss ，目标镜片：Plan-Apochromat×20/0.8 M27）进行的
，如前所述。简而言之，将麻醉的胚胎横向安装在1％的低熔点琼脂糖中 ，并通过使用405 nm激光器（50 s的五个迭代为50 s）扫描了所选的感兴趣区域（ROI）
，从而将荧光kaede蛋白拍摄
。从琼脂糖分离后，将胚胎在Ca2+/mg2+hank的平衡盐溶液（HBSS ，Gibco）中洗涤
，并在28.5°C下在Tryple Select（Thermo Fischer Scientific，12563011）中分离30分钟。通过添加FBS和离心来停止解离 。将细胞沉淀重悬于含有Ca2+/Mg2+和5％FBS的HBSS中 ，过滤并提交进行FACS分析（BD Biosciences FACSARIA III）
。 　　对于SCRNA-SEQ分析
，将单个照片开关（红色荧光）WT EC分布在包含2.3 µL智能Seq2裂解缓冲液的384孔板的单个井中（5'-AAGCAGTGGTATATATATATATATATATATACTACT30VN-3'）使用Smart-Seq2协议在mRNA-SEQ之前存储在-80°C下，并使用seurat v4工具包在Rstudio中进行了分析（V.1.1.463）。管道（BCL2FASTQ V.2.19.0.316）使用Nextera XT索引KIT v2适配器进行绘制 。v.1.16.1软件
。根据映射位置对包含对齐结果的生成的BAM文件进行排序 ，并且使用SubRead软件包v.1.4.6-P5的fartialecounts函数计算了每个基因的原始读数计数。 　　对于散装RNA-Seq分析，TG（FLI1A：GAL4FF）UBS3;（UAS：KAEDE）RK8胚胎是否被注射
，或者不注射，在与上述30 HPF处隔离为30 HPF的GPR124 ，RECK或WNT7AA MOS和PHBC EC的一个单元期 。或者
，如上所述，将胚胎从26 hpf开始用IWR-1处理 ，并以36 hpf的形式对CTA EC进行了光接合并分类
。如前所述71
，将80个胚胎的光转换PHBC EC合并并提交用于RNA提取和RNA-Seq。使用DESEQ2（V.1.12）74分析转录组并进行比较 。 　　使用Leica M165立体显微镜，Zeiss LSM710或配备有Leica Application Suite（LAS）V.4.2或Zen Blue Blue V.3.1显微镜软件的Zeiss LSM900共聚焦显微镜获取所有图像
。使用ImageJ V.1.53C进行图像分析。斑马鱼胚胎现场成像或在4％PBS中固定在4°C下的4％PFA中 。固定小鼠胚胎（PBS中的4％PFA） ，并在切片后染色。在低融化点琼脂糖中使用低剂量的三甲蛋白固定的胚胎固定化（在E3斑马鱼培养基中为1％
，补充了n-苯基硫蛋白和三酸酯），在玻璃瓶中的玻璃瓶中（Mattri noce（Mattek）（Mattek corporation）中 ，进行了脱落的斑马鱼胚胎的实时成像
。使用孵化室在28.5°C的稳定温度下记录共焦延时图像。通过TG（FLI1A：GAL4FF）的延时成像记录Ca2+ - 振荡；（UAS：GCAMP7A）胚胎
，在CTA发芽前的30分钟内每5 s摄入Z堆栈（31-31.5 hpf） 。圆形ROI（直径<5 µm）以振荡的PHBC EC为中心
。计算F/F0以量化荧光的变化，其中F0是基线荧光。Ca2+尖峰被确定为f/f0≥1.5的事件 。 　　对于血管造影 ，在72 hpf幼虫中，使用显微镜使用显微镜
。通过注射1 nl 150,000 fitc标记的葡萄糖（FD150s
，25μgµl-1）的1 nL进行示踪剂泄漏测定，并在注射后1小时成像。在手动虚假颜色之前 ，使用Imaris丝形示踪剂软件（BITPLANE）进行了三维重建
，以突出显示出表现出或不具有BBB特性的脑外和脑内容器 。 　　WT斑马鱼胚胎（32 hpf）在2.5％戊二醛（电子显微镜）中固定过夜，在4°C下为4％PFA ，并用1％四氧化甲醛（Electon显微镜科学）和1.5％的氟氰化物（Electron Microscoppy）（Electron Microcoppy）（Electron Microcoppy）（0.15）中固定
。将胚胎用1％乙酸铀酰（电子显微镜科学）进一步染色
，串行脱水并嵌入环氧树脂（琼脂100树脂；琼脂科学）中。修剪包含加工胚胎的树脂块以达到ROI，通过薄切片（15μm）的甲苯胺染色来评估ROI 。然后用Leica EM UC6 Ultromicrotome生产超薄70 nm的切片 ，并安装在铜型 - 碳网格（电子显微镜科学）上
。使用Tecnai 10传输电子显微镜（FEI）进行观察
，并使用veleta摄像头捕获图像，并使用SIS Item V.5.1 v.5.1软件（Olympus）进行处理。 　　将样品在螺栓LDS样品缓冲液和还原剂（Thermo Fischer Scientific ，B0007和B0009）中定性为70°C 10分钟 。使用4–15％迷你蛋白质TGX预制蛋白凝胶（Bio-Rad
，4561085）进行凝胶电泳。将蛋白转移到硝酸纤维素膜上
。在Tris缓冲盐水（TBS）中阻塞5％牛奶后，将膜与原代抗体（0.05％Tween-20-20 TBS ，TBST，TBST）一起在4°C中孵育。在TBST中洗涤后
，将膜与二抗在TBST的1％BSA中孵育，在室温下孵育1小时 。使用Western Lightning Plus ECL（Perkinelmer ，NEL103001EA）揭示了印迹
。 　　使用了以下主要抗体：兔抗HA（Merck
，H6908，1：1,000） ，鸡肉抗GFP（Aves Biolabs
，GFP-1020，1：10,000） ，Rat Anti-Laminin-1111（R＆D Systems
，MAB4656，1：250 ，Monoclonal Reactivity
，Monoclonal to Lama to Lama1/B1）。使用了以下二级抗体：山羊抗兔IgG HRP HRP偶联物（Promega，W401b ，1：5,000），山羊抗chicken Igy igy igy hrp conjugate（Thermo Fischer Scientific
，A16054，1：40,000）和Rabbit Anti-anti-anti anti-anti-Rat anti-Rat-rat I conjate（5000） ，conjatect conjugate（Merc） 。补充图1中提供了无工艺印迹
。 　　从HUVEC cDNA扩增人MMP25和MMP2催化域
，斑马鱼MMP25B催化域在密码子优化后合成。将碎片克隆到PET21D的NCOI和XHOI限制位点 。催化域将残基Tyr113延伸至斑马鱼MMP25B的Gly284（UniprotkB：E7F1N5），Tyr108至人类MMP25的Gly280（UniprotkB：Q9NPA2）和人类MMP2（uniprotkb：P08253）的ASP452
。用PET21D-ZMMP25B-6XHIS ，PET21D-HMMP25-6XHIS或PET21D-HMMP2-6XHIS转化BL21（DE3）大肠杆菌细胞
，并在100-300 mL LB培养基中生长（补充100 µg ML-1 ampicillin）。当培养物以0.9的600 nm（OD600）的光密度达到光密度时，用1 mM异丙基β-1-1-硫代乙型甲糖苷（IPTG）诱导蛋白质表达 。在搅拌下在37°C下过夜孵育后 ，通过离心（5,000g
，20分钟，4°C）收集细胞 ，并在-80°C下冷冻
。在50 mM Tris（pH 8）中重悬于后
，将细胞在冰上机械裂解（微流体，110SCE ，3个周期）。通过离心（16,000g，20分钟
，4°C）从裂解物中回收夹杂物，并在8 m尿素 ，50 mM Tris（pH 7.6）
，150 mM NaCl，5 mM CaCl2和50 µm Zncl2中溶解 。通过离心（16,000g ，20分钟
，4°C）去除不溶性部分，并将上清液与100 µL的Ni+/硝基曲酸酸琼脂糖珠（Qiagen）在4°C下孵育过夜。将珠子用20 mM咪唑在TBS 8 m尿素中洗涤 ，并用500 mM咪唑在TBS 8 M尿素中进行洗脱
。通过SDS -PAGE和COOMASSIE蓝色染色评估重组蛋白纯度
，并通过BCA蛋白质测定法测量蛋白质浓度（Thermo Fischer Scientific，23223）。通过在50 mM Tris ，150 mM NaCl
，5 mM CaCl2，50 µM Zncl2 ，0.005％Brij-35（Thermo Fischer Scientific，20150）中稀释（1/20
，V/V）在12°C下1 h 。通过离心（21,400G，10分钟 ，4°C）去除不溶性部分
。补充图1中有未编工的凝胶。 　　对于α-1抗胰蛋白酶
，将2 µM的α-1抗胰蛋白酶（雅典研究与技术，16-16-0011609）与2 µM RZMMP25B或75 nm RHMMP25在28°C和37°C和37°C和37°C下过夜 ，在50 µL MMP25 CLEAVAGE（500 MMMM）（PHRIS）（500 MMMM）（PH）（分别为37°C）（PHNACL
，5 mM CaCl2，0.005％Brij-35（Thermo Fischer Scientific ，20150）） 。 　　对于层粘连蛋白-111
，将15 µg的基质（Corning，354230）在37°C下与1 µm的Rhmmp25一起在50 µL MMP25裂解缓冲液中孵育过夜
。在SDS -PAGE -PAGE和LAMA/B1的Western印迹分析之前 ，通过丙酮沉淀浓缩样品（R＆D Systems
，MAB4656）。 　　对于胶原蛋白IV，将20 µg从人体胎盘（默克 ，C7521）纯化的胶原蛋白IV与1 µM Rhmmp25在37°C下在50 µL MMP25裂解缓冲液中孵育过夜 。在SDS -PAGE和COOMASSIE蓝色染色之前，通过丙酮沉淀浓缩样品
。 　　For recombinant HA-tagged Col4a5 expressed in HEK293T cells, Zebrafish col4a5 was amplified from 48 hpf zebrafish cDNA, cloned in fusion to a C-terminal HA tag into pCS2+ (digested with BamHI and XhoI) and transiently expressed using PEI (polyethylenimine) in HEK293T cells (ATCCCRL-3216
，通过ATCC STR分析验证，对支原体污染进行了阴性测试）。空PCS2+用作负对照 。然后 ，转导后48小时
，在收集和细胞破坏MMP25裂解缓冲液中，在收集和细胞破坏之前将细胞洗涤两次
。离心（21,400g ，10分钟
，4°C）后，将4 µg上清液在28°C下与2 µm的RZMMP25B孵育过夜 ，或在37°C下在50 µL MMP25切割缓冲液中在37°C下在37°C下在37°C下孵育RHMMP25。 　　对于人体COL4A1-6在大肠杆菌中以GST – GFP连接器表示的假定切割位点
，DNA序列编码了12个氨基酸片段之间的N端融合，该氨基酸片段中心于MMP25的MMP25的col4a11-6和GFP中的PGEX-6P-1-6p-1 pgex-6p-1 specific spenvience spenvience collavage s-6p-1 pgex-6p-1预缩蛋白酶编码序列 。用这些构建体转化BL21（DE3）大肠杆菌 ，当OD600达到0.7时
，用1 mM IPTG诱导蛋白质表达。在搅拌下在30°C下过夜孵育后，通过离心（5,000g ，4°C下的20分钟）收集细胞，并使用FastPREP-24细胞distruupter和裂解基质Bulk（M.P. Biomedicals）在50 mM Tris（pH 8）中裂解细胞
。三个细胞破坏周期为20 s后
，通过离心（21,400g，10分钟 ，4°C）阐明细胞裂解物。使用BCA（Thermo Fischer Scientific
，23223）确定上清液的蛋白质浓度 。将总共​​500 ng的可溶部分在MMP25裂解缓冲液中与75 nm的RHMMP25或RHMMP2在37°C下孵育过夜，或者在37°C下或与1×10-3 IU在50255°C 25°C IN 50255°MMMMMMMMMMP2555°C中与1×10-3 iu一起使用
。补充图1中有未编写的凝胶和印迹。 　　对于蛋白质消化 ，从SDS -PAGE凝胶中切除感兴趣的带
，用蒸馏水洗涤两次，并在100％乙腈中缩小 。通过在37°C下添加4 µL胰蛋白酶（Promega；在50 mM NH4HCO3中）和隔夜孵育 ，进行凝胶内蛋白水解消化
。 　　对于MS
，使用Nano-liquid色谱 - 电喷雾电离– MS/MS（Bruker V.5.3）系统分析蛋白质消化剂（上清液）。通过Nanouhplc（NanoElute，Bruker）在75μm的内径 ，25 cm C18柱上分离肽
，并以200 nl min -1的流速为200 nl min -1，在50°C下以200 nl min -1的流速为5 。LC流动相A为H2O中的0.1％甲酸（V/V） ，流动相B为0.1％甲酸的甲酸（V/V）
。直接在色谱柱上，将摘要（1 µL）直接在600 bar的恒定压力下加载。注射摘要（1 µL）后
，移动相位在18分钟内从2％B线性增加到13％，从13％B到19％ ，在7分钟内从19％B到22％
，在4分钟内从22％，从22％B中从22％B中 ，在3分钟内从22％B到85％ 。 　　使用Hystar v.5.1和Timscontrol v.2.0对Timstof Pro上的数据采集
。TIMS的积累时间为100 ms
，迁移率（1/K0）范围为0.6至1.6 V s cm -2。使用平行的积累序列碎片（PASEF）采集方法进行分析75 。每个总周期为1.1 s，一个MS频谱之后是十个Pasef MS/MS光谱。 　　为了进行数据处理 ，提取了串联质谱
，通过数据分析（BRUKER）v.5.3提取了电荷状态卷积并取消了v
。All MS/MS samples were analysed using Mascot (Matrix Science; v.2.8.1), searching the Human Proteome database (https://www.uniprot.org/uniprotkb?query=(proteome:UP000005640), 101,673 entries) assuming semi-specific trypsin digestion.可以容忍三个错过的分裂。搜索吉祥物的片段离子质量耐受性为0.050 DA，父离子耐受性为15 ppm 。半胱氨酸的氨基甲基甲基被指定为吉祥物中的固定修饰
。在吉祥物中指定了蛋氨酸的氧化 ，赖氨酸和脯氨酸的羟基化
，天冬酰胺和谷氨酰胺的脱氨酸以及N-末端的乙酰化。 　　使用支架（V.Scaffold_5.10.0，蛋白质组软件）进行肽和蛋白质鉴定 。如果建立高于96.0％的概率以达到低于1.0％的FDR ，则可以通过支架局部FDR算法接受肽鉴定
。如果概率高于5.0％以达到低于1.0％并至少包含两个确定的肽，则可以接受蛋白质鉴定。蛋白质概率由蛋白质先知算法分配 。仅根据MS/MS分析而无法分化含有相似肽的蛋白质
，以满足简约的原理
。共有大量肽证据的蛋白质分为簇。 　　Seurat V.4用于分析SCRNA-SEQ数据集 。使用DESEQ2 V.1.12分析了大量RNA-Seq数据
。使用RSTUDIO V.1.1.463和GraphPad Prism V.9进行统计分析。使用GGCorrplot V.0.1.3进行了Pearson相关分析和可视化 。正态分布的数据表示为平均值±S.D。并分别使用单尾单向方差分析（带有事后Dunnett的测试）和两尾学生的t检验进行了分析，分别进行了多个和单一比较
。非正常分布的数据表示为中位数±四分位数范围 ，并使用单尾Kruskal – Wallis测试（带有HOC DUNN的测试）进行多次比较和两尾Mann-Whitney U-Tests进行分析。没有使用统计方法来确定样本量 。样本量取决于实验的技术限制
，以及我们和其他人先前关于斑马鱼神经血管发育的工作11,12,13,14,17,71
。一细胞阶段的胚胎是不可区分的，无论其基因型如何 ，因此在注射过程中被随机分组​​。将生物体分配到实验组中 。在相同条件下
，实验组始终并行升高
。对于斑马鱼和小鼠孟德尔遗传学实验，在表型评估后始终进行基因分型。因此 ，研究人员固有地对实验条件视而不见 。在MO和体细胞基因破坏实验中
，研究人员没有盲目
。未确定动物的性别（胚胎或幼虫斑马鱼），也没有在感兴趣的发育阶段分析（胚胎小鼠）。图表中指出了观测值（N） ，均值或中位数
，误差线的类型以及用于分析的统计测试的类型 。免疫荧光，原位杂交 ，透射电子显微镜的图像， 蛋白质凝胶或印迹代表了至少三次独立重复的实验
。所有复制尝试都是成功的。 　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得 。