从40名志愿者那里获得了血液样本，这些志愿者收到了3剂Coronavac ，39名接受了2剂的冠状冠和1剂ZF2001的助推器剂量
，54名从BA.1感染中恢复过来的人，这些人以前曾收到3剂Coronavac43,44剂量的人 ，并从SAF和SARS的30个人中恢复了30名coronav saf和coronav kars的coronav和30个人
。助力射击后四周或从医院出院后四周获得志愿者的血液样本。1COVID-COVID-19疾病的严重程度定义为无症状
，轻度，中度 ，中度
，严重或严重的疾病，根据WHO对COVID-1945临床管理的WHO生活指导 。北京迪坦医院首都医科大学（伦理委员会归档第LL-2021-024-02-02） ，天津市市政卫生委员会和蒂安吉第一中央医院委员会（Ethics First Contern Compastion no）（Ethics First Compante no no n no no no no no.202ny.2022）
，对SARS康复和SARS-COV-2疫苗的血浆进行了相关实验
。根据赫尔辛基宣言，从每个参与者那里获得了书面知情同意。所有参与者均提供了书面知情同意书 ，以收集其临床样本的信息，用于研究目的以及本研究产生的数据 。 　　将全血样品混合
，并在PBS+2％FBS中1：1稀释后进行FICOLL（Cytiva，17-1440-03）的梯度离心 ，以分离血浆和PBMC
。离心后
，从上层收集血浆，并在界面收集细胞。通过离心 ，红细胞裂解（Invitrogen Ebioscience 1X RBC裂解缓冲液
，00-4333-57）和洗涤步骤进一步制备PBMC 。如果不立即用于下游过程，则将样品存储在液氮中的FBS（Gibco）中 ，将其存储在液氮中
。冷冻保存的PBMC在DPB+2％FBS中解冻（Stemcell
，07905）。 　　这项研究得到了北京迪坦医院伦理委员会的批准（伦理委员会归档LL-2021-024-02），Tianjin Municipal Health委员会和Tianjin First Centrally Hospital Hospital委员会（Ethics First Commits）（Ethiving No. 20222n045ky） 。所有人类研究参与者获得了知情同意
。 　　SARS-COV-1和SARS-COV-2 RBD交叉结合记忆B细胞是从已接收SARS-COV-2疫苗和BA.1感染的康复中心的SARS康复中的PBMC中分离出来的。简而言之 ，从具有EasySEP人CD19阳性选择试剂盒II（Stemcell
，17854）的PBMC中分离出CD19+ B细胞 。然后用2.5μLFITC抗人CD19抗体（Biolegend，392508） ，2.5μlFITC抗人类CD20抗体（Biolegend，302304）
，3.5μl抗紫外线421抗紫外线CD27抗体（3024），将100μL中的每106个B细胞染色（Biolegend ，392508）
，2.5μlFITC抗人CD20抗体（Biolegend，302304） ，302424PE/Cyanine7抗人IgM IgM抗体（Biolegend
，314532），0.21μg生物素化的卵蛋白（SINO Biological）与明亮的紫罗兰色链球菌605（Biolegend）（Biolegend ，405229）
，0.13μg-SARS-SARS-COV-COV-COV-COV-COV-COV-BIOLIGATIAN（BIOLEGEN）（BIOLETAVIDIN）（BIOLEGENDIN）（HES）（HES）（and and）（0.13μg-sars-cov-140634-V27H-B）与Pe-streptavidin（Biolegend，405204） ，0.13μgSARS-COV-2生物素化RBD蛋白（His和AVI TAG）（Sino Biologal
，40592-V27H-B）与Apc-treptavidin（40592-V27H-B）共偶，且405207- 405207 ，405207，（Invitrogen
，00-6993-50）。7-AAD-CD19/CD20+ CD27+ IGM-ova-sars-cov-1 rbd+和SARS-COV-2 RBD+细胞用Moflo AstroiS EQ细胞分类器（Beckman Coulter）分选
。 　　SARS-COV-2 BA.1 RBD结合记忆B细胞是从BA.1感染的接受SARS-COV-2的BA.1感染的委托人中分离出来的。简而言之，用EasySep人CD19阳性选择试剂盒II分离CD19+ B细胞 。然后用3μLFITC抗人CD20抗体（Biolegend ，302304）
，3.5μl亮紫421抗人类CD27抗体（Biolepolegend，302824） ，2μLPE/Cyanine7抗抗体（Bi-cyman7抗抗体（Bi-Human-Human Antibody）（314）
，将100μl溶液中的每个106 B细胞染色（Biolegend，302304） ，3.5μl亮紫色421抗体（Biolepergend
，302824），PE/Cyanine7 anti-human IgD antibody (BioL​​egend, 348210), 0.13 μg biotinylated SARS-CoV-2 BA.1 protein (His and AVI Tag) (Sino Biological, 40592-V49H7-B) conjugated with PE-streptavidin or APC-streptavidin (TotalSeq-C0971 Streptavidin, BioLegend,405271和TotalSeq-C0972链霉亲和素 ，Biolegend
，405273），0.13μgSARS-COV-2 WT生物素化的RBD蛋白（他的和AVI TAG）与出色的Violet紫罗兰色605链霉素链霉素和总Sepeq-C0973链霉素蛋白（Bright violet 605）链蛋白（和ave）链霉素（Bright violet streptavidin and totalseq-c0973 streptavidin（bibereptavidin）（405273）链霉亲和素（Biolegend ，405277），0.21μg生物素化的卵蛋白与TotalSeq-C0975链霉亲素结合（Biolegend
，405279）和5μL7-AAD（Invitrogen，00-6993-50）
。用MOFLO ASTRIOS EQ细胞分类器对7-AAD-CD20+CD27+CD27+IgM-igm-igm-igd- sars-cov-2 ba.1 rbd+细胞进行排序。使用FlowJo V10.8（BD Biosciences）分析FACS数据 。 　　然后 ，在制造商的用户指南（10倍基因组学
，CG000208）之后，用铬铬铬铬单细胞V（d）J试剂盒V1.1处理排序的B细胞
。简而言之 ，在离心后将分类的细胞重悬于PBS中。用10倍铬控制器获得乳胶珠（GEM）
，然后进行逆转录 。GEM-RT清理后，逆转录产物会经过启动
。用Spriselect试剂试剂盒（Beckman Coulter ，B23318）的逆转录产物进行扩增和纯化后
，用10倍BCR引物富含BCR序列（配对V（d）J）。在图书馆准备后，通过运行Novaseq 6000 S4 Reagent Kit v1.5300循环（Illumina ，20028312）或Novaseq XP 4 Lane Kit V1.5的Novaseq 6000 S4 Reagent Kit v1.5300循环对库进行测序 。 　　使用Cell Ranger（V6.1.1）管道
，对MRNA FASTQ读数进行处理并与人Grch38基因组进行对齐，以进行基因表达谱
。除去少于10个细胞和表达少于100个基因的细胞或高级线粒体基因以滤除低质量数据的基因。将原始计数归一化并用Seurat46（V 4.0.3）缩放 ，而主组件分析和均匀的歧管近似和投影进行群集和可视化 。使用Singler47（V1.6.1）和摩纳哥人免疫数据48鉴定细胞类型。特征条形码读数也由细胞游舱（V6.1.1）计数为抗体捕获库，并且被认为一个细胞结合了显性特征条形码的相应抗原（该单元格中> 25％）
。 　　从10倍基因组学V（D）J测序获得的抗体序列与GRCH38参考对齐
，并通过细胞ranger（V6.1.1）管道组装为免疫球蛋白重叠蛋白。从分析中滤除了具有多个重链或轻链重叠群的非生产性重叠群和B细胞 。V（d）J基因注释是使用IMGT参考的NCBI IGBLAST（V1.17.1）进行的
。通过使用Igpipeline计算V（D）J核苷酸序列的突变，该序列比较了序列与最接近的种系基因 ，并计算了不同核苷酸的数量。对于来自原始测序核苷酸序列的公共源的抗体
，抗体氨基酸序列由IMGT/domaingapalign49（v4.10.2）注释，带有默认参数 。用R封装可视化V – J对（V0.4.10）
。 　　如前所述3构建了DMS库。简而言之 ，由Wuhan-Hu-1 RBD序列（GenBank：MN908947
，残基N331 – T531）构建SARS-COV-2 RBD突变库和Omicron RBD突变库，并以Wuhan-Hu-1 RBD序列的类似方式创建了OMICRON RBD突变库 。S375F ，K417N
，N440K，G446S ，S477N
，T478K，E484A ，Q493R，G496S
，Q498R，N501Y和Y505H突变
。重复的文库是独立生产的 ，理论上包含3,819个可能的氨基酸突变。将每个RBD突变体与独特的26-核苷酸（N26）序列进行条形码
，并使用PACBIO测序来识别RBD突变体和N26条形码的对应关系 。突变库转换后，将ACE2粘合剂富集用于下游突变谱实验
。 　　基于磁性细胞分选的抗体 - 渗透突变分析系统3,17用于表征NAB的突变逃逸曲线。简而言之 ，诱导ACE2结合突变体的RBD表达过夜
，然后洗涤两轮蛋白A的基于抗体的阴性选择和基于MYC TAG的阳性选择，以富集表达RBD的细胞 。按照Dynabeads蛋白A（Thermo Fisher ，10008D）的方案制备蛋白A抗体偶联的产物
，并在室温下与诱导的酵母菌库一起孵育30分钟，并摇动。基于MYC标签的阳性选择是根据制造商的说明进行的（Thermo Fisher ，88843）
。 　　经过三轮顺序分类后
，将获得的细胞回收过夜。通过96孔板酵母质粒准备试剂盒（Coolaber，PE053）从酵母前和后酵母菌种群中提取质粒 。然后 ，将提取的质粒通过PCR扩增N26条形码序列
。最终的PCR产物用1X Ampure XP磁珠（Beckman Coulter，A63882）纯化
，并在Illumina NextSeq 500平台上提交为75BP单端测序。 　　如前所述，对单端照明测序读数进行处理 。简而言之 ，将读取为16或26 bp
，并与DMS_Variants软件包（v0.8.9）对齐与参考条形码变化词典
。将变体的逃生评分计算为f×（nx，ab/nab）/（nx ，ref/nref）
，其中nx，ab和nx ，ref是代表变体x的读取数量
，而nab和nref是抗体选择的（AB）和参考（AB）和参考（参考）库中有效读取的总数。F是定义为逃生分数比例的第99个百分点的比例因子 。删除参考库中少于六个读取的变体以避免采样噪声
。根据先前报道的数据，也删除了含有低于-2.35或RBD表达的ACE2结合的突变的变体。对于基于BA.1基于RBD的库 ，由于缺乏相应的ACE2结合和RBD表达数据
，我们将基于beta rbd的DMS的RBD表达式用作过滤器50，并且没有执行ACE2结合过滤器 。除R493P ，S496P，R498P
，H505P以及F375上的所有突变外，在Beta和BA.1中使用不同氨基酸的残基突变未过滤 ，由于低表达而被排除在分析中
。最后
，使用DMS_Variants软件包构建了全球上毒模型，以估计突变逃逸分数。对于大多数抗体 ，在通过质量控制的所有实验中进行了至少两种独立的测定
，并将单个突变逃生评分平均 。 　　位点总逃生评分定义为RBD特定位点所有突变的逃生评分之和，用于评估每种抗体对每个位点的突变的影响。这些分数中的每一个都被视为某种抗体的特征 ，用于构建特征矩阵A×M进行下游分析
，其中n是抗体的数量，M是特征的数量（有效位点）
。使用sklearn.feature_selection.Scikit-Learn Python软件包（v0.24.2）选择了信息网站 ，其差异为0.1。然后
，使用sklearn.preprocessing.normarize将所选特征跨抗体进行L2归一化 。所得矩阵称为A'N×M'，其中M'是所选特征的数量
。两种抗体i ，j的差异定义为1- corr（a'i，a'j）
，其中corr（x，y）是矢量x和y的皮尔逊相关系数。我们使用sklearn.manifold.mds将特征数量从M'减少到D = 20 ，并在上述度量下进行多维缩放 。使用Sklearn.cluster将抗体聚集成12个表位组
。最后
，使用sklearn.manifold.tsne的scikit-learn的T-SNE将这些抗体的D维表示进一步嵌入二维空间。对于用BA.1基于BA的102 ba.1特异性抗体，基于RBD的酵母显示库 ，使用多维缩放（MDS）生成20维的嵌入
，并独立地进行了所有1,640抗体的DMS剖面，但分类和T-SNE进行了独立进行 。为了将这些抗体投射到基于WT RBD的DMS测定的1,538抗的T-SNE空间 ，我们使用BA.1基于BA.1 RBD的DMS和1
，从在20维MDS空间中使用基于WT RBD的DMS的538抗体
。原始T-SNE空间中每种BA.1特异性抗体的位置定义为使用基于WT RBD的DMS的十种最近抗体的平均位置。所有T-SNE图均通过R软件包GGPLOT2（v3.3.3）生成 。 　　SARS-COV-2 SPIKE（GenBank：MN908947），PANGOLIN-GD SPIKE（GISAID：EPI_ISL_410721） ，RATG13 SPIKE（GISAID：EPI_ISL_402131）
，SARS-COV-1 SPIKE（GENBANK：GENBANK：GENBANK：GENBANK：AY278491），OMICICER BAICKIKE）V70del, T95I, G142D, V143del, Y144del, Y145del, N211del, L212I, ins214EPE, G339D, S371L, S373P, S375F, K417N, N440K, G446S, S477N, T478K, E484A,Q493R ，G496S，Q498R
，N501Y，Y505H ，T547K
，D614G，H655Y ，N679K
，N679K，P681H ，N764K
，D796Y，D796Y ，N856K
，N856K，Q954H ，Q954H，N969K
，N969K，N969K ，L981F）
，BA.2 SPISAID;EPI_ISL_7580387，T19I ，L24S
，DEL25-27，G142D ，V213G
，G339D，S371F ，S373P
，S375F，S375F ，T376A，T376A
，D405N，D405N ，R408
，R408S，R408S ，K417N
，K417N，G4440K ，S4447777777777777777777777777777777777777777777777777777777777777777777777777777777777777777777777.E484A
，Q493R，Q498R ，N501Y
，Y505H，D614G ，H655Y，N679K
，N679K，P681H ，N764K
，N796Y，D796Y ，Q954H
，N969K），BA.1.1 SPIKE（BA.1+R346K） ，BA.1+R346K）T95i
，g142d，v143del ，y144del
，y145del，n211del ，l212i，l212i
，g339d，s373p ，s373p
，s375f，s375f ，d405n
，d405n，k417n ，k417n
，k440k，n440k ，g4446s
，g4446s，s4777777777778.n778.nr ，s4778.nr，q4778.k
，q4778.，q4778.Q498R ，N501Y
，Y505H，D614G ，H655Y
，N679K，P681H ，N764K
，N764K，D796Y ，Q954H
，N969K），BA.2.12.12.12.1 Spike（BA.2+L452Q+S704L） ，BA.2.13 Spike（BA.2.13）spike (T19I, L24S, del25-27, del69-70, G142D, V213G, G339D, S371F, S373P, S375F, T376A, D405N, R408S, K417N, N440K, G446S, L452R, S477N, T478K,E484A，F486V
，Q498R，N501Y ，Y505H
，D614G，H655Y ，N679K
，P681H，N764K ，D796Y
，Q954H，N969K）质粒是使用PCDNA3.1 Vector构建的
。G*ΔG-VSV病毒（VSV G Pseudotyped病毒 ，kerafast）用于感染293T细胞（美国型培养基收集（ATCC）
，CRL-3216），并将表达峰值蛋白质的质粒用于同时转染。培养后 ，收集，过滤
，等分并在-80°C中收集含有假病毒的上清液，以进一步使用 。 　　在过表达人血管紧张素转换酶2（293T-HACE2细胞）的293T细胞中 ，对PANGOLIN-GD和RATG13进行了假病毒检测。使用HUH-7细胞系（日本研究生物库（JCRB）
，0403）进行了其他假病毒中和化测定
。 　　单克隆抗体或血浆在DMEM（Hyclone，SH30243.01）中连续稀释（五倍或三倍） ，并在96孔板中与假病毒混合。在5％CO2和37°C下孵育1小时后
，播种了消化的HuH-7细胞（JCRB，0403）或293T-HACE2细胞（ATCC ，CRL-3216） 。培养24小时后
，将上清液丢弃，并添加 - 酸性蛋白试剂（Perkinelmer ，6066769）以在黑暗中反应
，并使用微孔板分光光度计检测到发光值（Perkinelmer，HH3400）
。IC50由使用Prism（版本9.0.1）的四参数逻辑回归模型确定。 　　为了检测SARBECOVIRUS中抗体的广谱结合 ，我们使用了20个合成的SARBECOVIRUS RBD（SINO生物学技术）的面板（补充表3） 。根据20个RBD的序列，设计了一组嵌套引物
。用6×HIS TAG序列的重叠PCR获得编码序列
，以促进蛋白质纯化。将纯化的PCR产物与CMV启动子连接到分泌的表达载体PCMV3，然后转化为大肠杆菌XL1-Blue竞争细胞 。培养具有正确转化的单轨并扩展 ，并提取质粒
。将健康的HEK293F细胞转移到新的细胞培养物中
，并在37°C，120 rpm ，8％CO2悬浮液中生长至对数生长阶段
，并通过使用脂质体小泡作为DNA载体，用重组构建体转染。转染后 ，遵循细胞培养物来评估7天的细胞生长和生存能力的动力学 。收集细胞表达上清液
，并在离心后通过Ni柱进行亲和力纯化
。通过SDS -PAGE证实了洗脱蛋白的分子大小和纯度。补充表4中显示了20种SARBECOVIRUS蛋白的生产批号和浓度信息 。此处使用的WT RBD是SARS-COV-2（2019-NCOV）SPIKE RBD RBD-HIS-HIS重组蛋白（Sino Biological，40592-V08H）。 　　PBS中的21个SARBECOVIRUS RBD（补充表3）在4°C下预先涂上ELISA板（Nest ，514201）过夜
。洗涤板并阻塞。然后加入1μgml -1纯化的抗体或串行稀释的抗体
，并在室温下孵育20分钟 。接下来，使用过氧化物酶偶联的山羊抗人IgG（H+L）（Jackson ，109-035-003），并在室温下孵育15分钟
。将四甲基苯胺（TMB）（Solarbio
，54827-17-7）添加到板上。10分钟孵育后用2 m H2SO4终止反应 。使用Sensight多模板读取器（Perkinelmer，HH3400）在450 nm处测量吸光度
。使用R包装镶嵌物（v1.8.3） ，在不同抗体 - 抗原对的不同抗体浓度下的ELISA A450测量值适合Y = ACN/（CN+EN）
，其中Y是A450值，C是相应的抗体浓度。A ，E和N是参数
，其中E是特定抗体和抗原的所需EC50值 。 　　Omicron RBD（Sino Biological，40592-V08H121）PBS中的蛋白质固定在4°C的ELISA板上过夜
。除去涂料溶液并用PBST洗涤3次 ，然后将板阻塞2小时。阻塞后
，将板洗涤5次，并在室温下加入30分钟的ACE2-Biotin（Sino Biogical ，10108-H27B-B）和连续稀释的竞争者抗体的混合物 。在室温下将过氧化物酶偶联的链霉亲和链霉素（Jackson Immunoresearch
，016-030-084）添加到每个孔中，并在室温下再孵育20分钟
。洗涤板五次后 ，将TMB（Solarbio，54827-17-7）添加到每个孔中。10分钟后
，用2 m H2SO4终止反应 。使用Sensight多模板读取器（Perkinelmer，HH3400）以450 nm测得的吸收量。ACE2竞争系数计算为（b -a）/b ，其中b是具有0.3μgml -1抗体的A450值
，A为6μgml -1抗体的A450值
。 　　根据制造商的说明，在Octet Red 384蛋白质分析系统（Fortebio）上对Biolayer干涉测定法进行。为了测量结合亲和力 ，将单克隆抗体固定在蛋白A A生物传感器（Fortebio）上
，并将Omicron S-Trimer（BA.1和BA.2）的四倍连续稀释液用于PBS中 。用八位位收集9.0（Fortebio）收集数据，并通过Octet Analysis 9.0（Fortebio）和Octet Analysis Studio 12.2（Fortebio）进行分析
。 　　进行热稳定性测定 ，以用MX3005 QPCR仪器（Agilent）以Sypro Red（Invitrogen）作为荧光探针检测暴露的疏水残基。我们建立了25μl反应系统（pH 8.0）
，其中含有5μg靶蛋白（Omicron谱系的S-Trimer），1000×Sypro Red ，并将温度从25°C提高到99°C 。荧光以1°C的间隔一式三份记录
。 　　使用Biacore 8K（GE Healthcare）将人ACE2固定在CM5传感器芯片上。注入了纯化的S-Trimer或RBD的连续稀释液
，注入了100至6.25 nm的浓度 。使用BIACORE 8K评估软件（v3.0.12.15655; GE Healthcare）在室温下记录响应单元，并使用BIACORE 8K评估软件（v3.0.12.15655; GE Healthcare）将所得数据拟合到1：1结合模型中
。 　　S6P表达构造编码SARS-COV-2尖峰外生域（残基1-1208） ，具有六个稳定的Pro取代（F817P，A892P
，A892P，A899P ，A942P
，A942P，K986P和V987P） ，并以Furin Cleaeavage（furin cleaeavage cleaeavage cleaeavage cleaeavage cleaeavage cleaeavage cleaeavage cleaeavage）（以前描述了682-682-682-682–682–682-682-682-682–682）。使用位于定位的mutagenesosen
，将增量特异性突变（T19R，G142D ，156DEL
，R158G，R158G ，R158G
，L452R，T478K ，D614G，P681R
，D950N引入） 。The S6P expression construct containing the Omicron BA.1 mutations (A67V, H69del, V70del, T95I, G142D, V143del, Y144del, Y145del, N211del, L212I, ins214EPE, G339D, S371L, S373P, S375F, K417N,N440K, G446S, S477N, T478K, E484A, Q493R, G496S, Q498R, N501Y, Y505H, T547K, D614G, H655Y, N679K, P681H, N764K, D796Y, N856K, Q954H, N969K,从三个合成的DNA片段组装L981F）
。S6P表达构建体，其中包含Omicron BA.2突变（T19I ，L24S
，DEL25-27，G142D ，V213G
，G339D，S371F ，S373P
，S373P，S375F ，S375F
，T376A，T376A ，D405N，D405N
，D405N，R408S ，R408S
，R408S，K417N ，G444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444440年
，， ，
，， ，
，， ，，
，， ，
，， ，s4440kT478K
，E484A，Q493R ，Q498R
，N501Y，Y505H ，D614G
，H655Y，N679K ，P681H，N764K
，D796Y，Q954H ，N969K）来自三个合成的DNA片段。The S6P expression construct containing the Omicron BA.4/BA.5 mutations (T19I, L24S, del25-27, del69-70, G142D, V213G, G339D, S371F, S373P, S375F, T376A, D405N, R408S, K417N, N440K,G446S
，L452R，S477N ，T478K
，E484A，F486V ，Q498R
，N501Y，N501Y ，Y505H
，D614G，H655Y ，N655Y，N658S
，N679K，N679K ，P681H
，P681H，N764K ，N764K
，N796Y，N796Y ，N96Y
，Q954H，Q954H ，Q96999
，片段51 。对于蛋白质的产生，使用聚乙胺（polysciences）将这些表达质粒以及编码此处描述的抗体抗原结合片段（FAB）的质粒被转染到HEK293F细胞中。收集条件培养基并使用Hydrosart Ultrafter（Sartorius）浓缩 ，并交换为结合缓冲液（25 mM Tris，pH 8.0和200 mM NaCl）
。使用Ni-NTA亲和力方法进行蛋白质净化
，然后使用Superose 6增加柱（用于峰值蛋白）或Superose 200增加柱（对于Fabs）进行凝胶过滤色谱法。用于所有蛋白质的最终缓冲液为20 mM HEPES，pH 7.2和150毫米NaCl 。 　　基本上按照15,52（补充表4）制备了用于冷冻EM研究的样品
。将所有EM网格撤离2分钟 ，并使用等离子体清洁剂（Harrick PDC-32G-2）将发光递减30 s。将四个微晶蛋白（0.8 mg ml-1）与相同体积的晶圆厂（每个1 mg ml-1）混合
，并立即将混合物用于Fei Vitrobot IV（4°C和100％湿度）中，将混合物立即用于发光含量的圣碳金网格（量子 ，R1.2/1.3） 。使用配备K3直接检测摄像头的Titan Krios G3或带有K2摄像头的Titan Krios G2进行数据收集
，均以300 kV的速度运行
。使用CryoSparc（v3.2.1）53进行数据处理。2D分类后，选择具有良好质量的颗粒进行全局3D重建 ，然后进行均匀改进 。为了提高RBD -FAB区域周围的密度
，使用UCSF嵌合体（v1.16）54和Relion（v3.1）55用于生成面具，然后使用CryoSparc（v3.2.1）进行局部细化
。COOT（V0.8.9.2）56和Phenix（V1.20）57用于结构建模和改进。使用USCF Chimerax（V1.3）58和Pymol（v2.4.0 ，Schrödinger
，LLC 。）制备数字
。 　　首先将BA.1，BA.2 ，BA.3，BA.2.13
，BA.2.12.1和BA.4与ACE2进行复杂的RBD模型与BA.1 – HACE2（PDB代码：7WGB）的冷冻EM结构进行了转移，然后与Web inface Feble（PDB代码：7WGB）进行检查（然后与Web intface rever eferface emect Febs e emect emect emect.if。原子冲突 。之后 ，使用gromacs-202159模拟结构。简而言之
，选择了带有TIP3P水模型的OPLS力场来准备动态系统
。之后，将Na+和Cl-离子添加到系统中以使系统进行电中性。然后 ，使用陡峭的下降算法进行能量最小化
，直到达到1,000 kJ mol -1的最大力 。NVT通过300 K处的鼻子 - 霍维方法和1 bar的NPT集合与Parinello-Rahman算法持续使用nvt-emb1e，分别用来使温度和压力平衡
。最后 ，以随机初始速度和周期性边界条件进行了1​​0 ns的分子动力学生产。使用Verlet截止方案处理了非键相互作用
，而远程静电相互作用则使用粒子网埃瓦尔德方法59处理 。用12Å的临界值计算出短距离静电和范德华相互作用
。所有六个模型均在同一协议中模拟。 　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然研究报告摘要中获得 。