根据制造商的建议 ，将FLP-IN T-REX HEK293（Thermo Fisher Scientific
，CatalogNo 。R78007）保持
。在有10％胎儿牛血清（FBS; Thermo Fisher Scientific，CatalogNo。10270106）和Themopyscimcin（Therpypomilcin）（Thermepssicitic2）中 ，将细胞用Na-丙烷和高葡萄糖和高葡萄糖和高葡萄糖（Thermo Fisher Scientific
，Scientific，EctalogNo 。31966-021）培养在DMEM中培养细胞培养细胞在DMEM中培养细胞 ，将细胞培养在10％（fisher）（fisher）（Thermo））在引入之前，将转基因细胞以100 µg mL-1 Zeocin（Thermo Fisher Scientific
，CatalogNO
。R250-01）和15 µg ML-1 blasticidin（Thermo Fisher Scientific，目录编号A1113903）培养。对于稳定的细胞系的产生 ，POG44（Thermo Fisher Scientific
，目录No 。V600520）与PCDNA5/FRT/TO（Thermo Fisher Scientific，CatalogNo。V652020）共转染 ，其中包含感兴趣基因的9：1比例
。根据制造协议
，用Lipofectamine 2000（Thermo Fisher Scientific，CatalogNo。11668019）以1 µg DNA的形式转染细胞（即六孔板格式（即900 ng的POG44和100 ng的PCDNA5/FRT/TO+GOI） 。将所有转基因用N端His6-二氨基化序列His6串联（HBH）标签克隆 ，该标签允许无需使用抗体即可快速和超清洁纯化
。我们还在HBH标签之前立即添加了一个3×标记标签
，以增加构造的多功能性，我们称之为3FHBH标签。转染后二十四小时 ，在稀释比为1：6 、2：6和3：6的三个六孔板的三个井之间进行了细胞
，以有效选择潮霉素B（Thermo Fisher Scientific，CatalogNo 。10687010）
。转染时间点后48小时开始选择湿霉素 ，最终浓度为150 µg mL -1，每3-4天进行一次刷新一次
，直到对照，直到对照为止 ， 单独板上的未转染细胞完全死亡。转基因的诱导在终浓度为0.1 µg ml -1强力霉素（DOX）的终止诱导 。通过全细胞裂解物的免疫印迹来验证细胞
。 　　使用Crispaint将内源性生物素受体肽亲和力标签和标记标签插入小鼠和飞行细胞系的SAFB基因基因座中。小鼠FLP-IN 3T3细胞系购自Thermo Fisher Scientific（CatalogNo 。R76107）
，并根据制造商的说明进行培养
。在存在10％FBS（Thermo Fisher Scientific，CatalogNo。10270106）和青霉素/链霉菌素（Thermo Fisher Scientific ，CatalogNo 。15140-122）的情况下
，在DMEM（Thermo Fisher Scientific，Catalog No.31966-021）中培养VELL。果蝇S2R+-MT :: Cas9细胞系购自DGRC（DGRC股票No.268） ，并在S2 Medium（Thermo Fisher Scientific
，CatalogNo
。21720024）中培养，在10％FBS（Thermo Fisher Scientific ，CatalogNo。10270106）的存在下 。对于Crispaint56构建体（有关单个指定RNA的列表
，请参见补充表2），根据Crispaint协议 ，使用Fogeene HD（Promega，Promega
，Catalogno
。E2311），根据六孔板格式的Crispaint协议将细胞与三种质粒共转染。转染后24小时 ，将细胞扩展在10 cm培养板上
，以促进有效选择嘌呤霉素（Thermo Fisher Scientific，CatalogNo 。A1113803）
。紫霉素的选择是在TAG构建体中提供的 ，并由基因基因座的表达驱动（在这种情况下
，无论是小鼠还是蝇safb1基因基因座）。转染后48小时开始选择呼毒素，以1 µg ml -1的终浓度开始 ，并每2天刷新一次
，并总共保持，直到所有未转染的3T3或S2细胞都死亡 。通过全细胞裂解物的免疫印迹来验证细胞
。 　　HELA细胞系（ACC57）购自Deutsche Sammlung Von Mikroegranismen和Zellkulturen ，并与FLP-IN 3T3细胞系保持在相同的培养基中
，但添加了非必需的氨基酸（Thermo Fisher Scientific，Catalogno。11140050） 。 　　将小鼠N2A细胞保持在DMEM中 ，并且稳定表达3×FLAG-CAS9或3×FLAG-SAFB1（扩展数据图10G）是通过在EF1Alpha启动子中表达Piggy Backed poggy repers的质子的质粒（cas9，safb1或对照）的质粒（cas9
，safb1或对照）的质粒共转染而产生的
。在此设计中，由于新霉素的耐药性通过IRES元素耦合到转基因表达 ，因此选择用1 mg ML -1遗传蛋白选择细胞
，直到对照转染的细胞中均保持不保留为止。 　　细胞系（人类FLP-IN T-REX HEK293，Human HELA ，Human HCT116
，Mouse FLP-In 3T3，Mouse N2A和Fly S2R+）均来自供应商或存储库或同事提供（如上所述） ，并且购买后未对细胞系进行进一步的认证 。使用Jena Biosciences支原体（基于PCR）检测试剂盒（Jena Biosciences
，no。PP-401），在所有细胞系上对所有细胞系进行了常规的支原体污染测试
。 　　用6毫升冰冷的PBS洗涤15厘米菜肴的细胞 ，并用0.199 MJ cm-2 UV-C-c旋转紫外线链接
，然后将它们颗粒，然后将其固定在液氮中 ，并在-80°C下储存，直到使用。将沉淀重悬于600 µL的1倍天然裂解缓冲液（NLB）中
，并用蛋白酶抑制剂重悬于Biouptor水浴超声仪（30 s ON，30 s of ，30 s off
，在4°C下五个循环）中短暂超声 。然后将裂解物在20,000相对离心力（RCF）下在4°C下离心10分钟，以去除不溶性材料
。将上清液转移到带有25 µL Myone C1链霉亲和蛋白珠（Thermo）的新鲜管中 ，并在寒冷的房间中孵育1小时。用高盐缓冲液（HSB）洗涤珠一次
，一次用非换性缓冲液（NDB）洗涤，在100 µL NDB中用0.02 U µl-1 RNase I（Thermo）在37°C中用0.02 U µL-1 RNase I（Thermo）处理 ，并立即将其放在冰上以停止反应 。然后将珠子用HSB和NDB洗涤一次
。用T4多核苷酸激酶修复RNA末端
，然后将条形码的S-Oligos用T4 RNA连接酶1在25°C下连接90分钟。用重组虾碱性磷酸酶（NEB，M0371）除去每个S-Oligo的3'末端的3'磷酸盐 ，并将珠子用硫酸锂硫酸锂缓冲液
，蛋白质液压缓冲液和HSB洗涤一次 。通过用蛋白酶K处理RNA，并使用寡核圆柱（Zymo）纯化RNA
。用上标III进行逆转录 ，然后用RNase H（NEB）处理样品，以磷酸化cDNA分子的5'-末端。在用寡核和浓缩柱（Zymo）进行最后一轮纯化后
，用圆形（Lucigen）将cDNA循环，并用Q5聚合酶（NEB）放大 。用固相可逆固定珠纯化PCR产物 ，并通过生物分析仪控制质量并进行高通量测序
。 　　配对末端读取与bbmerge.shv。38.72使用以下命令：bbmerge.sh in1 = {r1.fastq.gz} in2 = {r2.fastq.gz} out = {merged.fastq.gz.gz} outu1 = {ihist = {pastagram.txt} adapter1 = agatcggaagcaccacgtctgacccagtcaccaCaacaAcaAtctc adapter2 = agatcggaagagcgtcgtcgtgtgtgtggtgggagggaagggaagggaggtgtgtgtagatcggtcggtggtggtggtggtggtgg -mininsert -minininsert = 1 。用bbduk.shv。38.72bbduk.sh删除唯一分子标识符（UMI）和内部索引后
，简短插入（低于20 nt）
。The UMI was removed from reads and written to the header with UMI_tools v.1.0.0: umi_tools extract --bc-pattern=NNNXXXXXXNNNNN -I {IN.fastq.gz} -−3prime --stdout = {OUT.fastq.gz}, followed by separation of replicates with flexbar v.3.5.0: flexbar -rinput.fastq.gz -b barcodes.fa - -barcode-trim-end rtail -barcode-error-rate 0.2 - zip-output gz。首先将读取与丰富的RNA（例如转移RNA，小核RNA ，小核仁RNA和核糖核RNA）对齐
，然后与Bowtie2 v.2.3.5：Bowtie2 -No -unal -unal -un -gz -l 16 - every -sensensensival -sensentive -sositival -x bt2_index -u fastq_in.gs_gz.gam -obam -obam -o 。使用BBMAP.SH v.38.72将未对齐的读取重新映射到基因组，以捕获剪接的读取：bbmap.sh -xmx50g in = {fastq_in} out = {bam_out} out = {bam_out} outu = {umpapped_out_out} ref_out} ref = {refers.fa} ref {complity.fa} sam = 1.3 maped = t treck = t t rip = t t treck = t t trimect
。最后 ，使用umi-tools删除PCR重复：umi_tools dedup -i in_bam -s out_bam -spliced-spliced-is-iNique -soft-clip-threshord 3-output-stupt-stats = {stats}。BamCoverage v.3.3.1生成覆盖范围文件：Bamcoverage -b Bam -filterrnastrand [forward |反向] -binsize 1 -bormalize cpm -excalscaling -o out_file 。 　　对于UMAP的构建
，使用Homer在所有配置文件上进行了峰值调用：FindPeaks {tag_directory} - style factor -strand -strand -o {peachs.txt} -i {baccked_tag_directory}
。然后将所有配置文件的峰与：MergePeaks -strand -d给定-Matrix {peacss1.txt peacs2.txt…}> merged.peaks.txt。使用所有配置文件与合并峰的所有对齐方式的计数矩阵，然后由farmaturecounts v.2.0.1：farmiturecounts -f saf -q q 10 -primary -q 10 -primary -s 1 -t 12 -a {merged_peaks} -o {merged_peaks.counts.counts.counts.counts.counts.txt} {all_bam_files} {merged_peaks.counts.counts.counts.counts.txt} {The count matrix was imported into a Jupyter notebook with pandas: peaks = pd.read_csv("merged_peaks.counts.txt", sep = " ", index_col = "Geneid"), scaled with sklearn.preprocessing.StardardScaler: peaks_scaled = StandardScaler().fit_transform(peaks), which was then used to createumap：peacs_scaled_mapper = umap.umap（n_neighbors = 15 ，andural_state = 42）.fit（peaks_scaled）
，并使用umap.plot.point.point.point.point.point.point.point.point.point.point.point.point.points函数 。将簇调用HDBSCAN：clusterable_embedding = umap.umap（n_neighbors = 30，min_dist = 0.0 ，n_components = 14，Random_state = 42）.fit_transform（pefips_scaled）
，然后hdbscan_labels = hdbscan._labels = hdbscan.hdbscan.hdbscus = 600 = 600 = 600 = 600 = 600 = 600 = 600 = 600 = 600 = 600 = 600 = 600 = 600 = 600 = 600 = 600 = 600 nimeminclustecore_dist_n_jobs = 1）.fit_predict（compusterable_embedding）
。 　　Flp-In T-REx HEK293 and HeLa ACC57 cells were transfected at a final concentration of 5 nM each (in the case of triple knockdown, total siRNA concentration became 15 nM and hence single-knockdown transfections were increased to 15 nM with the addition of 10 nM negative control siRNA) using Silencer Select siRNAs (Thermo Fisher Scientific, catalogue no. 4427037 for 1 nM scale) andRnaimax（Thermo Fisher Scientific，CatalogNo。13778030）在六孔板上（每次重复使用约200,000） 。消音器精选的siRNA长21 nt ，化学修饰（精确的修饰是专有的； Thermo Fisher）
，并在不损害效力的情况下将总体脱离靶向效应降低多达90％
。这种修饰还夸大了链偏置，这与更好的敲低相关 ，因此它们比其他siRNA高5至100倍。人类SAFB1的siRNA ID为S12452
，SAFB2的siRNA ID为S18599，SLTM为S36384 。在敲低的第二天收获细胞。 　　用于MPP8的消音器精选SIRNA为S29362为TASOR的S23449
。 　　首先 ，用5 nm siRNA对FLP-IN 3T3细胞进行反向转染（大约100,000个复制）
，在敲低后24小时以相同的量增强（正向转染），并在初次转染后的第三天收获。小鼠SAFB1的siRNA ID为S104978 ，SAFB2的siRNA ID为S104977
，由于人SLTM siRNA也靶向小鼠mRNA，因此使用了相同的siRNA 。 　　使用Fugene HD（Promega）用对照dsRNA对照DSRNA转染果蝇S2R+细胞（DGRCNo
。150）3天 ，然后收集细胞进行RNA分离。 　　用Quick-RNA MicroPREP试剂盒（Zymo）提取来自人，小鼠或果蝇细胞的总RNA 。用Dynabeads mRNA纯化试剂盒（Thermo）从总RNA中分离出聚腺苷酸化RNA
。进行纯化两次以富集poly（a）+RNA。使用KAPA滞留的RNA-Seq库制备套件（Roche）生成测序库 。 　　Forty-eight hours following siRNA transfection (control or SAFB1 + SAFB2 + SLTM, 5 nM each), approximately 1 million Flp-ln T-REx HEK293 cells per replicate were trypsinized and either used directly for RNA isolation (total sample) or resuspended with a buffer containing 0.5% Igepal CA-630 to separate nuclear and cytoplasmic fractions, as described in ref.57
。用Quick-RNA MicroPREP试剂盒（Zymo）分离核和细胞质RNA。使用带有核糖酶（HMR）的KAPA RNA HyperPrep试剂盒（NO 。KK8560
，Roche）制备核糖消耗的RNA-Seq样品
。 　　如上所述，在FLP-IN T-REX HEK293细胞上进行SAFB三重敲低 ，然后用WT或截断突变体转染了Fugene HD正向转染
，如图7F所示，同时在SirNAS转染后6 h介质6 h ，同时刷新介质6 h。在敲低的第1天用0.1 µg ml -1 dox诱导转基因24小时 。在敲低的第2天
，使用Zymo Quick-RNA试剂盒制备总RNA提取物，并使用PrimerScript RT Master Mix（Takara ，No。Rr036a）进行第一链cDNA合成
。使用蓝色S’green QPCR试剂盒（Biozym
，第331416号）中列出的补充表1中列出的寡核体进行定量实时PCR。 　　使用对照siRNA或siRNA对SAFB1，SAFB2和SLTM（每个5 nm）（每个5 nm）处理的FLP-LN T-REX HEK293细胞分离出多素化的mRNA ，使用了Dynabeads mRNA MRNA MRNA Direct Purification Kit（Thermo Fisher Sciention）
，遵循制造商的指导，并使用MINCH MADIFICATIONS 。简而言之 ，对大约4×106个细胞进行标准方案，并在迷你旋转器（Grant-Bio）上进行珠子/mRNA络合物的杂交10分钟
。除去含有上清液的DNA
，并用2×2 ml的缓冲液重悬于第二个洗涤步骤，并用2×1 ml的缓冲液B重新悬浮。纯化的RNA在80°C下用10 µL预热洗脱缓冲液（10 mm Tris-HCl pH 7.5）洗脱5分钟 。使用量子荧光计以及RNA HS分析试剂盒（Thermo Fisher Scientific）对分离的mRNA进行定量
。对于直接RNA-seq ，根据制造商的协议（编号SQK-RNA002）处理了700 ng新鲜分离的多A富集的mRNA。然后将最终测序文库加载在R9.4流动池上
，并在小兵和promethion序列中进行测序 。 　　如参考文献中所述，遵循逆转录分析的转染和实验时间表
。18。最初 ，转染了大约200,000个HeLa细胞
，具有相同的siRNA，在上面列出的条件下 ，在六孔板上具有5 nm终浓度的终浓度为5 nm 。第二天
，用200 ng的质粒PYX015（基于JM111，在ORF1P中具有点突变）转染敲低HELA细胞 ，用于背景控制
，PYX017（PCAG-PCAG驱动的L1RP）在L1中使用Lipofectamine 2000在48-Well Plate in 48-Well Plate in Trablelicate in Trablelication in Bliblicatamine in trablelication
。记者构建转染后二十四小时，启动2.5 µg ml-1呼毒素的选择并维持了3天（即敲低的第5天）。从双酸酶报告基督测定系统（Promega ，CatalogNo 。E1960）用40 µL的无源裂解缓冲液裂解之前，用PBS洗涤细胞。将一半的裂解物转移到96孔
，读取的板上，并使用欧米茄Lumistar机器测量
。 　　FISH was carried out in HCT116 cells transfected with control versus siRNAs against SAFB1 and SLTM (no SAFB2 expression was detected in HCT116 cells) for 48 h using the Stellaris RNA–FISH kit (https://www.biosearchtech.com/assets/bti_stellaris_protocol_adherent_cell.pdf).通过LGC BioSearch Technologies合成了针对L1HS的探针（有关序列 ，请参见补充表2）。针对GAPDH的探针来自M. Bote提供的LGC BioSearch Technologies（SMF-2026-1） 。探针以125 nm的浓度使用
，并在37°C下杂交16小时
。使用Leica Stellaris 8共聚焦显微镜成像样品。 　　Tra2b的RNA结合域（残基111：201）和SAFB1（残基386：485）被克隆到编码10×His-Tev-Halo的质粒中 。然后，使用BL21-Codonplus（De3）-RIL细菌表达三个构建体（仅晕Halo-TRA2BRRM和HALO-SAFB1RRM） ，当达到0.6的光密度达到0.6时
，用0.2 mM israpopyl-uspopyl-uspyl-β-倍 - thiogalactopypyranoside for 4 h at cinterrif in Clastrif in 37°c cillrif in Courcerife诱导
。将细菌用裂解缓冲液（50 mM HEPES pH 8.0
、300 mM NaCl，5 mM咪唑和0.05％的igepal Ca-630）重悬于 ，并用Branson Sonifier中断
，通过离心液澄清，并通过0.45 µm膜过滤。将清除的裂解物与完整的HIS标签纯化树脂（Roche）一起孵育 ，用裂解缓冲液广泛洗涤
，并在室温下在隔离缓冲液中的珠子上与0.5 µm俄勒冈州（Promega）一起孵育30分钟的珠子上，以供蛋白质荧光标记 。首先用裂解缓冲液广泛洗涤珠 ，然后用高盐洗涤缓冲液（50 mm Tris.cl pH 8.0，1 m NaCl
，5 mm咪唑）和最后的裂解缓冲液
。用洗脱缓冲液（50 mM Tris.CL pH 8.0，100 mm KCl ，200 mM咪唑）洗脱蛋白质。添加了含硫酸脂蛋白（DTT
，1毫米最终浓度）和TEV蛋白酶（自制的，6×His tagged ，约1：100）
，并添加了25 mm Tris.CL pH 7.4、50毫米KCl的25 mm tris.cl pH 7.4 、5％glycerol和1 mm Dtt的样品透射透析（约8°C） 。然后将透析的洗脱液与完整的HIS标签纯化树脂（Roche）一起孵育，以去除TEV蛋白酶和未消化的蛋白质 ，然后以23,000 RCF离心30分钟
，并通过0.22 µM膜过滤，以去除颗粒物
。紫外线光谱在260 nm处没有明显的吸收 ，并用于量化纯化的蛋白质
，然后对其进行标准化，并通过Page和coomassie染色检查其质量（图4A）。EMSA中使用的浓度为：Halo-TRA2BRRM（车道2-6：3.6 ，7.2，14.4
， 分别为57.6和102.4 µm）;Halo-SafbrRM（分别为7–​​11：3.6
、7.2、14.4 、57.6和102.4 µm）；和光晕（泳道12：102.4 µm） 。泳道1仅包含那些没有添加蛋白质的探针。 　　通过体外转录制备RNA探针
。简而言之，包含相关序列的taatacgactcactatagaagaagaagaagaagaagaagaagaagaagaagaagaagat ^atc ，其中T7启动子序列被强调
，并用Ecorv消化（消化位点）（消化部位，表明最终的rna的最后一个核苷是由 ^shim -Internife forne fornififififififififieje ，并在 ^中得到了 ^）
，并在 ^中属于 ^）。具有1 mm（最终）CTP/UTP/GTP/ATP或1 mM CTP/UTP/GTP和1 mM N6-甲基-ATP（Jena Biosciences，no 。RNT-112-S）的试剂盒（Jena Biosciences ，No
。Rnt-101）
，CTP/UTP/GTP/ATP或1 mM CTP/GTP/ATP或1 mM CTP/UTP/GTP/ATP或1 mm ctp/utp/gtp/atp，no。rnt-112-s ，完全替换了ATP 。使用Spri珠清除RNA
，以去除质粒和其他潜在的高分子重量产物，然后使用Occ-5套件（Zymo）
。然后 ，使用新鲜制备的钠周期（250 mm的水，最终浓度为10 mm； Sigma
，第311448号）在60 mm Naoac pH 5.5上氧化1小时，将管子保持在黑暗中 ，将RNA氧化1小时。在使用OCC-5进行进一步清理后
，然后将RNA用CF 647夹e标记（Sigma，No 。SCJ4600046；在水中10 mm ，在室温下约120 mm NAOAC
，pH 5.5）中的0.8 mm最终浓度过夜
。用OCC-5纯化RNA，在水中洗脱并标准化为5 µm。EMSA在25 mM Tris.CL pH 7.4、50 mM KCl ，5％甘油和1 mM DTT中进行
，RNA探针约为100 nm，并指定的感兴趣蛋白质浓度 。在将RNA和蛋白质在冰上孵育30分钟后 ，将混合物直接加载到具有0.5×Tris-Borate-EDTA（Final）的8％聚丙烯酰胺凝胶上
，并在0.5×Tris-Borate-eDTA中运行45分钟，在100 V时在100 V时在100 v处进行100 v（凝胶）
。使用适当的激发激光和发射过滤器的台风扫描仪在同一凝胶上依次可视化蛋白质和RNA。 　　使用含有0.5％igepal Ca-630的缓冲液（在Lubelsky和Ulitsky57之后）从WT-HCT116细胞中分离出核 ，并在液氮中捕获液体，直至使用 。将细胞核与500 µL的25 mm Tris.cl pH 7.4
、150 mM KCl
，2 mM MGCL2、0.5％igepal CA-630 、5％甘油，5mmβ-氯匹配乙醇 ，1×蛋白酶抑制剂和1×phosstop and Sonicated与Bransoned。接下来
，添加15 µL的涡轮-DN酶，然后在25°C下孵育20分钟 ，然后缓慢添加1.5 m的碱基缓冲液（25 mm Tris.cl pH 7.4
，50 mm kcl，5％甘油） ，以使KCl浓度达到75 mm和Igepal Ca-630浓度为0.05 mm和0.1125％（最终）
。将裂解液与50 µL的Pierce Control琼脂糖树脂（第26150号）一起孵育20分钟
，在冷房间中旋转，并在4°C下全速旋转10分钟 ，以除去不溶性材料。A 949 bp fragment of L1 ORF2 was amplified from pYX017 using primers AATAATACGACTCACTATAGCGTATCACCACCGATCCCACAG (T7 promoter underlined) and GGCTGAGACGATGGGGTTTT and in vitro transcribed using a HighYield T7 RNA Synthesis Kit (Jena Biosciences, no. RNT-101) with either1 mm（最终）CTP/UTP/GTP/ATP或1 mM CTP/UTP/GTP和1 mM N6-甲基-ATP（Jena Biosciences
，no 。Rnt-1112-S），完全取代ATP
。将RQ1 DNase（promega）添加到每个反应中在37°C下孵育20分钟 ，然后使用RCC-25（Zymo）清理RNA，并用新鲜准备的钠含量（250 mm的水中氧化（最终浓度为250 mm
，最终浓度10 mm； Sigma； Sigma； sigma，no。311448）在60 mmmmmmmmnoac in cood cood cood in cood 5.5中 ，将其固定在5.5上 。用RCC-25进行进一步清理后
，然后将RNA用hidyaimsy（Sigma，第87639号 ，第87639号；在DMSO中为50 mm
，在室温约为120 mm的NAOAC，pH 5.5 ，pH 5.5）的最终浓度为2 mm
，在室温下过夜
。用RCC-25纯化RNA，在水中洗脱并用纳米旋风定量 ， 然后将5 µg的每种RNA或缓冲液与25 µL的米诺C1链霉亲和蛋白珠在室温下在基础缓冲液中+0.1％igepal Ca-630中孵育1小时
，并用基础缓冲液+0.1％igepal ca-630洗涤两次。将核裂解物与这些珠在16°C下孵育1小时，并以1,100 rpm的速度摇动 。将珠洗涤并从具有基本缓冲液+0.1％Igepal CA-630的新鲜管中转移
。用基本缓冲液+0.1％IGEPAL CA-630+2 µL RNASEA+T1（NO。EN0551 ，Thermo Fisher Scientific）在30°C下洗脱与珠子结合的蛋白质，并通过免疫印迹证明 。 　　用5 nm siRNA转染HCT116细胞（如图2H所示）
，然后48小时后，用编码L1HS的质粒转染 ，并由最小的EF1Alpha（没有内含子）启动子或模拟转染的最小EF1alpha驱动
。二十四小时后（siRNA转染后72小时）
，将细胞胰蛋白酶素化，并用含有0.5％igepal Ca-630的缓冲液重悬于基本上 ，如参考文献中所述。57 。用RNA清洁和浓缩柱（Zymo）纯化细胞质馏分
，其中2 µg将其加载到1.2％琼脂糖凝胶上，并将电脑电脑电视到尼龙膜上。用体外转录制备了针对ORF2的挖掘标记的探针（有关引物的补充表2） ，并如在DIG Northern Starter套件手册（Roche
，No
。12039 672 910）中所述进行探针杂交，洗涤和iMumunodeTection。 　　转染后 ，用对照siRNA或siRNA对照SARNA
，SAFB2和SLTM 48 h转染FLP-IN T-REX HEK293细胞，然后用PBS洗涤 ，然后用0.2 MJ CM-2 UV-2 UV-C-C-CROSSLIND在ICE上的uv-2 UV-C光 。如参考文献中所述分离核
。57，用蛋白酶和磷酸酶抑制剂重悬于1×NLB+5 mM MGCL2中
，并使用Branson Sonifier进行超声处理。离心后，为去除不溶物材料 ，将上清液与琼脂糖树脂（Pierce
，No 。26150号）在寒冷室中孵育20分钟，然后再与Dynabeads蛋白G珠子进一步孵育P-SR抗体（10 µL每IP; 1H4 ，Santa Crub cruz
，no
。SC-13509），以供90分钟固定。1H4 IP的上清液用于DHX9 IP（每个IP 2.5 µL； ABCAM ，no 。AB26271）
。闪存方案与上述相同
，除了将所有HSB洗涤剂替换为NLB和S-Oligos，并预先脱磷酸化以跳过重组虾碱性磷酸酶处理 ，该处理可能会脱磷酸化的SR蛋白在珠子上脱磷酸化
，从而可能导致其洗脱。 　　在室温下将FLP-IN T-REX HEK293细胞与0.2％Formaldeyhde交联10分钟，用PBS广泛洗涤 ，用1×NLB重悬于1×NLB，并使用Branson超声词进行超声处理 。将裂解液以23,000 RCF离心10分钟
，以去除不溶性材料，然后将上清液与琼脂糖树脂（Pierce ，No
。26150）在寒冷室中孵育30分钟。在短暂离心之后
，将上清液用于IP，dynabeads蛋白G珠子与针对SAFB1的抗体（每IP 10 µl； Santa Cruz 10 µL；No 。SC-393403）或对照IgG（Santa Cruz ，Santa Cruz
，no。SC-2025）耦合
。用1×NLB洗涤珠，并用蛋白酶K洗脱珠连接的RNA ，如上所述
，使用RCC-5（Zymo）纯化，并用于RT-QPCR。 　　如参考文献中所述 ，生成DNMT3C敲除动物 。58
。对于特异性废除酶促活性
，我们设计了针对靶向外显子15的甲基转移酶结构域的SGRNA，其序列序列是以下原始序列：5'-gggacatctcacgattcacgattcctgg-3'。使用引物5'-CTGGCCGCTCTTTTGAG-3'和5'-GGAAATCATTCATCCCCCCTGTGTCAGC-3'使用PCR之后 ，使用Sanger测序对P0动物进行基因分型 。基于31 bp的缺失选择了创始动物，这不仅导致了从密码子598开始的翻新突变
，而且同时取消了PFOI限制酶消化位点，以直接基因分型
。随后将创始人突变回到C57BL/6 J背景中。纯合子基因敲除雄性被验证为不育 ，如先前报道的51所报道
，p42的睾丸明显较小且无序的睾丸 。耶鲁大学机构动物护理和使用委员会（第2020-20357号协议）在道德审查后，对这些实验动物的产生进行了监管 ，并根据政府和公共卫生服务的要求进行
。未进行样本量选择
，随机化或盲目。 　　Mix-N型CF488 A抗体标记试剂盒（Biotium，No 。92253）和Mix-N型CF555 CF555抗体标记试剂盒（Biotium ，No
。92254）用于标记Rabbit Rabbit Antihuman Antihuman Safb1/Safb抗体（LSBIO
，LSBIO，LS-C2866411） ，rabybib antfline
，rabybib tline，rabyby ，rabyby，rabyby
，rabyby（rabyby）'rabyby，rabyfip ，'raby-i。否AB216324） 。遵循了产品网站上列出的标准协议
，包括超滤协议，并进行了较小的修改。简而言之 ，将25-35μg的抗体放在提供的超滤小瓶中
，并以14,000g离心2分钟以去除所有液体
。根据抗体的初始量，将抗体在1×PBS中洗脱为0.75ngμl-1的最终浓度 ，并添加了适当的10 x Mix-N-stain反应缓冲液的体积。将整个溶液转移到包含染料的小瓶中
，并在黑暗中允许在室温（22–23°C）下进行标记反应30分钟 。最后，将150μl的存储缓冲液添加到每个反应中 ，在-20°C下以50μl的等分试样存储直至使用
。 　　剖析了P25 DNMT3C纯合子和杂合突变雄性的睾丸
，并将其嵌入O.C.T.中。化合物（组织软件） 。使用冷冻切割，使用Leica CM3050S获得了8μM的切片 ，并发现在Fisherbrand Superfrost加上显微镜载玻片上（Fisher Scientific，No
。12-550-15）
，并存储在-80°C下，直到使用。对于免疫荧光检测 ，将载玻片在室温下融化超过10分钟
，然后将4％多聚甲醛固定8分钟 。用阻止缓冲液（5％牛血清白蛋白（BSA），0.2％Triton X-100和PBS）在室温下进行通透性和阻塞
。将切片与直接标记的抗体在4°C下孵育过夜 ，然后在1×PBS中洗涤3个5分钟
，然后用Vectashield和vectashield加上反式安装培养基和DAPI（Vector Laboratories，No。H-2000） 。使用Leica Thunder成像系统以×40放大倍率获取图像
。 　　FLP-IN T-REX HEK293细胞稳定地表达SAFB1 ，SAFB2或SLTM（用于闪光灯的相同细胞系）
，用0.1 µg ml-1 dox诱导16小时，一式三份 ，甲醛（甲醛最终0.016％）在室内待命10分钟
，与PBS，RESUSP BULD 25 MM轻度交联 ，将其与pbs buld homm进行了25 MMM。Hepes-KOH pH 7.4
、10 mM MGCL2、10％甘油，0.2％Tween-20）
，并使用水浴超声剂均质 。离心后，将上清液与Myone C1链霉亲和蛋白珠一起孵育 ，以减少感兴趣的蛋白质。用HMGT-K200 、20 mM Tris-Cl pH 7.4和1 M NaCl洗涤珠
，最后用20 mM Tris-Cl pH 7.4和50 mM NaCl洗涤，然后提交给内部MS-aim-ociality进行进一步处理
。使用银quest银色染色套件（Thermo Fisher Scientific ，No。LC6070）对SAFB1进行银凝胶染色
，以确保与GFP下拉相比，条件非常严格（扩展数据图7B） 。 　　将12个样品在95°C和500 rpm煮沸10分钟 ，然后是胰蛋白酶摘要
，包括还原和烷基化半胱氨酸
。通过在37°C的最终浓度（500 rpm）（500 rpm）上加入30分钟，以5.5 mm的终浓度在30分钟内添加Tris（2-羧乙基）膦进行还原。为了进行烷基化 ，在室温下在摇摆平台（500 rpm）的室温下以24 mm的最终浓度添加氯乙酰胺
，持续30分钟 。然后用每样品用200 ng的胰蛋白酶（Roche）消化蛋白质，在800 rpm和37°C下摇动18小时
。通过添加1.3 µL 100％甲酸（最终浓度为2％） ，离心并放置在磁架上，将样品酸化。将含有消化肽的上清液转移到新的低蛋白结合管上 。在尖端中的自包装的C18色谱柱上进行肽脱盐
。在19 µL的5％乙腈和2％的水中
，将洗脱酸冻干并在水浴中短暂涡旋和超声处理30秒钟，然后将其重新结束30 s。 　　如先前报道的 ，通过纳米流相/MS通过纳米反相液相色谱法（Dionex Ultimate 3000
，Thermo Scientific）在线与Q-激活HF Orbitrap质谱仪（Thermo Scientific）耦合，如前所述59 。简而言之 ，使用PICOFRIT分析柱（75μm内径×50厘米长
，15 µm尖端ID；新目标）进行LC分离，并用3 µm C18树脂（Reprosil-Aq PUR ，Maisch Dr Maisch）包装在室内
。使用3.8至38％的溶剂B在溶剂中以266 NL min -1的流速为120分钟
，将肽洗脱。溶剂A为0.1％甲酸，溶剂B包含79.9％的乙腈 ，20％H2O和0.1％甲酸 。纳米电喷雾是通过3.5 kV的应用产生的。一个完整的傅立叶变换扫描质谱的循环（300–1,750 m/z
，分辨率为60,000 m/z 200，自动增益控制目标1×106） ，然后进行12个数据依赖的MS/MS扫描（分辨率为30,000，自动增益控制目标5×105）
，并具有25 ev的归一化碰撞能量
。为了避免对同一肽的重复测序，使用了30 s的动态排除窗口。 　　使用Maxquant软件（V.1.6.17.0）处理原始MS数据 ，并针对人蛋白质组数据库Uniprotkb UP000005640（包含75,074个蛋白质条目
，2020年5月发布）进行了搜索 。最大数据库搜索的参数是蛋白质和肽的错误发现率为0.01，最小肽长度为7个氨基酸 ，对20 ppm的肽的首次搜索质量公差和4.5 ppm的主要搜索公差
。对于胰蛋白酶消化
，最多允许两次漏洞。半胱氨酸氨基甲基化作为固定修饰，而N末端乙酰化和蛋氨酸氧化设置为可变修饰 。最大处理的输出文件可以在补充表3中找到 ，显示肽和蛋白质识别
，登录号，蛋白质的百分比序列覆盖率和Q值
。 　　将使用0.5×NLB制备的天然全细胞提取物与Protg Dynabead（Life Technologies ，No。10004D）一起孵育
，并在11μg的SAFB抗体（“抗体”）或IgG（小鼠； Santa Cruzer，Santa Cruz ，No 。SC-2025）中耦合在冷空间中，可容纳150分钟
。将珠在0.5×NLB中洗涤两次
，持续5分钟，然后用NDB洗涤一次。将经RNase处理的样品重悬于90 µL的NDB中 ，并加入10 µL的RNASEA+T1混合物（Thermo Scientific
，NO EN0551） 。然后将样品在20°C下孵育15分钟，并用0.5×NLB洗涤两次
。通过摇动在95°C下在95°C下孵育5分钟 ，在1×蛋白载染料中进行珠子洗脱。使用针对扩展数据中显示的蛋白质的抗体检测到相互作用伙伴图7（“抗体 ”） 。 　　将细胞与4％无甲醇甲醛在PBS中在室温下持续10分钟
，用0.5％Triton X透明10分钟，然后在PBS中用5％BSA在室温下封闭30分钟。将原代抗体（“抗体
”中的更多细节稀释在具有0.1％Triton X和1％BSA的PBS中 ，并在4°C下与固定细胞孵育约16小时
。具有适当血清型的荧光标记的二级抗体用于证明靶蛋白。Hoechst 33342用于染色DNA 。 　　使用了以下抗体：AFB1（Santa Cruz
，No
。SC-393403），SAFB2（SASTACRUZ ，NO。SC-514963）
，SAFB1/2（HET）（HET）（HUMEN：MERCK/SIGMA-ALDRICH，no 。SC05-588; sC05-588; no.LSBIO：LSBIO ，NO.LS-C28646411，STM）
，STM（no.ls-c288644），STM（SPLM）
。PA5-59154） ，ORF1P（人：abcam
，no。AB230966;鼠标：abcam，no 。AB216324） ，tasor（Sigma-Aldrich
，no
。HPA006735），1H4（p-SR）（p-SR）（p-sr）（默克/sigma-sigma-aldrich ，否。A305-871A-T）
，RBMX（细胞信号技术，第14794 s号） ，NCOA5（贝特基
，第A300-790A-T），ZNF638（Sigma-Aldrich ，no 。Zrb1186），ZNF326（ZNF326）（Santa Cruz
，no
。Sc-3990660606060606060606），TRA2 ，TRA2
，TROANG traan2 tra2，Traan2 tra2。A305-011A-M） ，U2AF2（U2AF65； Santa Cruz
，No 。SC-53942），Tubulin（Santa Cruz ，No。SC-32293）
，SRRM1（ABCAM，否
。HPA023535） ，DHX9（ABCAM
，NO。AB183731），U1-70K（Sysy ，No 。203011），PRP8（Santa Cruz
，no
。SC-555533），rnapii ，rnapii（Creative Biolabs
，no。CBMAB-xb-xb-xb-xb0938-yc crum cur crun cur crun cur crun cur no.crans，scantan curneme sancan curnation ，santan cantan cantancane米 。SRSF1 (Santa Cruz, no. sc-33652), SRSF2 (abcam, no. ab204916), SRSF3 (Elabscience, no. E-AB-32966), SRSF7 (MBL, no. RN079PW), RB1 (Cell Signaling Technology, no. 9309 S), TRA2B (Santa Cruz, no.SC-166829）和YTHDC1（ProteIntech
，编号14392-1-AP）
。 　　使用SnakePipes非编码RNA-RNA-SEQ PIPELELELELELANE 60，来自人类（HEK293 ，HELA
，HCT116），小鼠（3T3）和果蝇（S2）细胞的RNA-Seq数据分别映射到其各自的基因组（HG38 ，MM10和DM6）上。该管道在内部使用Tetranscripts23
，该管道在RNA-Seq数据中估计了基因和TE转录物的丰度，并对结果计数表进行了差异表达分析 ，该表由DESEQ2进行（参考文献61） 。该分析的输出可以在补充表4-11中找到
。 　　Homer在Flash数据上调用的重叠SAFB1，SAFB2和SLTM区域使用函数IRANGES :: delide（）合并
，从而导致一组29,806组SAFB结合的基因组间隔（SAFB峰），其中23,136个位于Gencode-ode-dossanted基因内部（内部gencode-note-Safb peaks）内部。所有位于标准染色体上的Gencode V.29基因均用作对照组（n = 58,721） 。从UCSC基因组浏览器下载了重复验证者注释 ，并计算出不同的转座元素的总长度的比例
，分别以23,136个SAFB峰和58,721个Gencode通道的基因计算，分别用于插入的TES和反义方向
。通过将峰（即观察到的分数）将TE分数除以整个基因（即 ，如果SAFB峰在转录本上随机分布）
，然后将log2-Transantransative计算出浓度的浓度和反义TE的子集（即观察到的TE分数）。 　　RAW RNA-seq读取需要使用Casadapt 4.1进行适配器和质量修剪 。除了-q 16 -trim -n -m 25 -a agatcggaagagc -a agatcggaagagc外，还使用了默认选项。 　　使用Star 2.7.9A Aligner62映射了从人类和小鼠细胞系的修剪读数和小鼠grch38（HEK293 ，HEK293
，HELA和HCT116细胞系）和小鼠GRCM38（3T3细胞系）基因组
。为了提高剪接读取检测和定量的灵敏度，在两次通过中进行了映射。在第一张通过中 ，使用默认选项同时将所有读取均同时映射到使用Gencode基因模型（v.29
，v.19）构建的Star基因组指数（v.29，v.19） ，除了-ounfiltermismathnoverreadlreadlreadlreadlmax 0.05 -Out -Out -Out -Out -outsamType除外 。在第二次通过中，每个测序库被映射到一个基因组指数
，其中Gencode基因模型在第一张通过（-SJDBFILECHRSTARTEND PASS1.SJ.OUT.TAB）中检测到了新的剪接连接
。包括其他非默认星的选项包括 - outfiltermismathnoverreadlmax 0.05 - QuantMode GeneCounts -AlignIntronMax 1000000-AlignMatesGapMax 2000000 -sjdboverhang 100-limitsjdbinsertnsj2000000。 　　使用Star 2.7.4a将Fruitfly S2细胞系的修剪读数映射到DM6基因组组件，并使用featurecounts计数读数（subread软件包v.2.0.0） 。 　　使用deSeq2 package61在反向链基因计数上使用恒星比对步骤进行差异基因表达分析
。丢弃了读数较少的基因；lfcthreshold = 1 ，α= 0.05用于调用差异表达的基因
，并使用lfcshrink缩小了结果（…，type =“ ashr”）。 　　为了避免将外显子读物分配到SAFB峰 ，在外显子使用分析中掩盖了GeneBB峰片段或重叠Gencode V.29宣布的外显子的整个峰 。将剩余的22,129个峰（内含性SAFB峰）分配到其主机基因
，并使用default参数的功能rsubread :: farmiturecounts（）在带注释的外显子和内含子的SAFB峰上计数RNA-Seq读数，除了cuntimultImappapeReads = falsempappings = falseSpecific = falseSpecific = 2 ，strandspecific = 2
，junccific = 2，juncceard = true = trul = trul = trul = trul = trul = true
。使用DexSeq R Package63鉴定了差异表达的SAFB峰 ，对于每个基因
，最低dexSeq p值的峰被用作基因片段化的参考。总共将5394个受影响的基因分成峰前和峰后部分 。外显子读数分别用于峰前和峰后片段，并使用DESEQ测量其差异表达
。带有dexseq padjusted的SAFB峰的基因< 0.05 and log-fold change above 2 were classified as (genes with) upregulated peaks (n = 878) whereas those hosting peaks with DEXSeq Padjusted >0.05和对数折段在-0.5和0.5之间用作对照组（n = 1,457）。 　　在第二星对齐通行证（sj.out.tab文件）中计数支持每个剪接连接的RNA-seq读数的数量 。无法明确指定宿主基因的剪接连接 ，或者在给定细胞系中所有处理和重复的总数读数少于十个读数的支持。使用DexSeq鉴定差异使用的剪接连接，并具有默认设置；接头连接被视为特征ID和宿主基因作为组ID
。 　　对于人类基因组中的每个基因
，使用SpliceAi26估算每个核苷酸作为剪接供体或受体的概率，并具有默认选项。将晶状体分数匹配以通过恒星检测到并定量剪接连接 。 　　计算一个十个重复族的剪接站点与最近的上游或下游TE之间的距离（L1 ，L2
，Alu，SVA ，ERVL
，ERV1，TCMAR-TIGGER ，TCMAR-TIGGER
，MIR，SIMPLE_REPEAT ，HAT_CHARLIE
，HAT_CHARLIE）如下：（1）所有Gencode基因都使用功能iranges fulct iranges :: redy（）ress（）（2）删除了带注释基因之外的星星检测的剪接连接和重复元素；（3）对于每个剩余的剪接供体和受体，分别测量了十个重复的家族中的每个家族中的每个家族的每个距离（在核苷酸中）到同一平坦基因内的距离或反义te的距离
。TES内的捐助者和受体分配了0 nt的距离。 　　使用recount3 r软件包64提取了GTEX联盟组织数据中支撑剪接连接的读数数量 。进一步分析中排除了剪接读数少于10亿的组织
。以内含子的方式量化了替代剪接 ，即为每个剪接供体和受体分别计算剪接指数。我们提取了位于注释的人基因内的所有剪接连接，在Gencode v.29中用剪接供体进行了注释
，并位于完全内含的SAFB峰内（NPEAKS = 16,929） 。另外有21,693个这样的剪接连接被过滤到供体参加多个事件的连接处，在至少一个组织中具有高于1％的剪接指数 ，并在所有27个组织中至少得到500个读数（即无处不在使用）
，导致了1,104个闪烁的夹具连接连接
。 　　使用两个自定义基因注释参考集中的特征读物计数Flash读取到HG38基因组的独特映射。这些中的第一个包含外显子和SAFB峰，在重叠的情况下 ，外显子优先于SAFB峰 。SAFB峰被分配给其宿主基因
，并将其视为外显子进行读取
。第二个参考包含完全碎片成外显子，重复元素和内含子的基因 ，外显子优先于重复和内含子
，重复序列优先于内含子，而内含子的基因组坐标是重叠的。尽管在量化已知SAFB结合区域上的闪光灯信号时 ，首次参考允许提高灵敏度
，但后者牺牲敏感性（因为它包含许多短的基因组片段），以识别识别SAFB峰之外增加结合的区域的能力 ，或者在SAFB峰之外增加结合峰 。在外显子/峰和外显子/重复/内含子计数上分别进行DexSeq分析。调整后P <0.05的区域被认为是差异结合的
。 　　在对照和三重KD样品上进行的对齐的直接RNA-seq的最终坐标筛选，假设它们是从聚腺苷酸化位点的紧密近端得出的。该集合的基因组坐标将近150万个单核苷酸 - 分辨率读取终端位点被扩展到上游和下游的50 nt
，重叠的间隔倒入了274,330个假定的聚苯基化区域 。计数每个区域中的每个区域结束的控制和三重KD读数的数量，对于每个基因 ，分别计算了对照和三重KD库的每个基因读数的次数
。至少20次读取的基因
，其中至少一个polya同工型的贡献通过三重KD和对照之间的至少20个百分点改变被视为差异化聚腺苷酸化。20个或更多的读数支持了14,148个基因（基因组长度超过50 kb）的基因（4,433个基因组长度），而247个（比50 kb长231个）显示出差异polya位点的使用 。 　　使用BWA ALN将HEK293分级RNA-Seq库中的RAW读取与HG38基因组对齐 ，并且与L1EM65进一步处理的对齐都具有默认选项
。总结了“仅 ”类别
，“唯一
”和“ passive_sense”类别的L1EM计数。这些总读数计数与单个基因（Gencode V.29注释）的读数结合，并将DESEQ2差异基因表达分析一起在基因和L1计数上一起进行 ，将L1元素视为独立基因 。 　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得
。