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根据波士顿儿童医院机构审查委员会批准的样品银行协议,将健康的年轻捐助者的新鲜骨髓样品吸入了知情同意书。根据大众米尔里格姆(Brigham)机构审查委员会批准的样品银行审查方案,在胸骨手术后接受胸骨手术后,从老年供体的胸骨骨髓骨髓收集。单个捐助者信息在补充表1中显示。
骨髓是从健康的年轻捐助者和老年捐助者那里收集的。用等量的洗涤缓冲液(PBS,2%胎牛血清(FBS),1 mM EDTA)将骨髓抽吸物稀释。将ficoll培养基添加到隔离管(Stemcell Technologies,目录编号85460)中,然后将稀释的骨髓样品分层放在顶部,然后在室温下以1,200g的速度离心20分钟。将包含单核细胞的顶层转移到新的管子上,然后通过洗涤缓冲液填充。将单核细胞以300克离心8分钟。将上清液丢弃,细胞洗涤两次,并在洗涤缓冲液中重悬于以进行富集或冷冻缓冲液(FBS中为10%DMSO)。
从从上一步分离出来的BMMC开始,我们用EasySep人脐带血CD34阳性选择试剂盒II(Stemcell Technologies,Catalog No.17896)富含CD34+细胞。简而言之,将EasySep人CD34阳性选择鸡尾酒(Stemcell Technologies,目录编号18096 C)添加到BMMC悬浮液中,在室温下在室温下孵育10分钟,最高100 µL mL -1。将EasySep Dextran Rapidspheres(Stemcell Technologies,目录编号为50100)涡旋,并将每个样品添加到最高50 µl ML -1的样品中,并在室温下孵育3分钟。接下来,将洗涤缓冲液(7毫升)添加到管中,并将细胞在大容易的磁铁中洗涤四次(Stemcell Technologies,CatalogNo。18001)。最后,将细胞重悬于洗涤缓冲液中,并以300克离心10分钟。然后将CD34+细胞沉淀重悬于冷冻缓冲液中(FBS中的10%DMSO)。
为了进一步富集HSC,通过以下抗体面板之一染色了富集的CD34+细胞的等分试样:(1)CD34 PERCP-CY5.5(BD Biosciences CatalogNO。3472222),CD45RA ALEXA ALEXA ALEXA FLUOR 488(BIOLEGEND CATALOG NO.304114)和CD990 PECLE7(BIOLEGEND CATALOG NO。561558)带有DAPI(Thermo Fisher Scientific CatalogNo。D1306)作为生存染料;或(2)CD34 BV421(BD Biosciences Etatalog NO.562577),CD45RA-APC-H7(BD Biosciences CatalogNO。560674)和CD90 PE-CY7和CD90 PE-CY7(BD Bioscience catalogno。561558)具有7- a-aad a via Biocce catal 55 catal 55 catal(Bd.561558)(BD 55)。随后,每种抗体的3 µL用于在100 µL中重悬于细胞的染色。将细胞用CD34+ CD45RA -CD90+的BD FACSARIA进一步分类,以富集HSC。登陆策略在补充信息中显示。
BMMC以及富集的CD34+和CD34+ CD45RA -CD90+细胞在冷冻缓冲液(FBS中为10%DMSO)中都冷冻保存。解冻后,立即处理细胞以尽快进行实验用途,而无需培养。
在这里,我们开发了赎回,这是一种经过修改的大规模平行单细胞协议,同时基于10倍基因组平台的深mtDNA测序介绍了多组学。该系统的关键特征是:(1)最大化mtDNA产量的优化协议;(2)可能受到非常高的测序覆盖范围的mtDNA文库的特定富集;(3)标记单个mtDNA分子的唯一分子标识符,允许使用误差校正来实现mtDNA突变的高精度调用66,67,67,68,69,70;(4)一种强大的推理算法,该算法使用更深入和改进的MTDNA突变检测进行系统发育重建;(5)将系统发育关系与细胞态读数联系起来的伴随的scrna-seq和scatac-seq。在兑换赎回的情况下,生成了三个单独的文库,包括用于深度测序和突变分析的丰富mtDNA库,用于基因表达的RNA库以及用于染色质访问性概况的ATAC库,所有这些库都通过可匹配的单细胞条形码链接,
遵循我们以前的工作28,29的原理,我们首先通过处理整个细胞而不是核,并用固定和轻度的透化来修改基于液滴的10X基因组学多组学方案(目录编号100283),以最大程度地保留mtDNA。接下来,我们设计了mtDNA特异性探针集,以使用DNA杂交富集线粒体片段。RNA和ATAC库制备遵循标准的10X基因组学方案,并进行了一些修改。
进一步的方法详细信息在补充方法和赎回协议中描述。共识变体管道赎回以及用于下游突变质量控制和单细胞系统发育和综合分析的R套件递设,进一步计算兑换。
详细的协议可作为补充协议获得。
小鼠实验已获得马萨诸塞州技术机构动物护理和使用委员会(机构动物福利保证,第A-3125-01号)的批准。带有条件等位基因Kraslsl-G12D/+和TRP53FL/FL的雄性鼠标ESC系列使用谱系跟踪盒进行设计。如参考文献中所述,制备了详细的工程过程,包括矢量信息,肿瘤收获和单细胞悬架。36。批次1和批次2实验使用了两个独立的鼠标ESC线。
批次1(六个肿瘤)和批次2(四个肿瘤)的单个细胞用细胞哈希标记,并使用兑换进行归类,但需要进行以下修改:需要其他目标位点文库。用含有照明兼容的适配器和样品指标的目标特异性引物进一步扩增cDNA图书馆(odyt023-odyt0385′-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACNNNNNNNNTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT; N denotes sample indices) using Kapa HiFi ReadyMix (Roche), as previously described36.
为了测序SCRNA,SCATAC和MTDNA文库,使用了赎回的策略,只是设计了四组小鼠特异性探针以丰富线粒体片段(补充方法和补充数据1)。对于目标位点文库的测序,预期每个单元格15,000个总读取,并使用以下读取长度:read1,26个周期;i7,八个周期;read2,290个周期)。
补充方法中详细介绍了基于CRISPR和基于赎回的谱系跟踪的集成分析。
我们使用定量方法估计mtDNA突变负担。每个细胞检测到的突变的数量是生物突变负担和技术可检测性的函数,这受mtDNA捕获率的影响。我们通过针对mtDNA覆盖范围(每个细胞位置的mtDNA拷贝数)和EUMI滤波速率来计算mtDNA突变负担,这用于纠正由测序深度变化,测序质量等不同实验引起的不同实验的技术批处理效应。给定样品J中的单个单元I,将突变负担计算为
在使用R Package edeem-r(https://github.com/sankaranlab/redeemr)的所有过滤步骤之后,包括变体和单元格(扩展数据图1I;包含的所有参数都可以调整到控制声音),我们生成了稀疏的矩阵C,包含所有变体等位基因计数(Cell versus mtdna Mutation)。等位基因计数矩阵进一步除以每个细胞每个位置的mtDNA拷贝数的矩阵,该基质产生了异质矩阵H用于可视化。由于突变计数数据很少,因此定量异质质水平易于mtDNA覆盖率变化。为了最大程度地减少下游分析中的覆盖范围和异质动力学的偏差,我们将基质C进行了二进制为基质CBIN。我们发现,鉴于每个单个单元鉴定的变体数量,二进制化更为可靠,并提供了足够的分辨率。尽管如此,还提供了定量矩阵C和二进制矩阵CBIN,用于赎回R的下游分析。
根据矩阵CBIN,我们计算了单元格加权Jaccard距离。跨多个供体的mtDNA突变频率的先验用于加权jaccard距离,以解释潜在的同质性。凭直觉的加权jaccard距离测量任何两个细胞共享突变的水平(即,在适当的归一化之后,共享mtDNA突变就越接近两个细胞的关系。我们首先定义了每个突变的先验概率,该突变优先考虑供体的突变率较低的突变(也就是说,独立发生的突变的可能性较小)。对于X和Y,加权Jaccard距离(DW_JACCARD)定义为
接下来,使用包装ape和ggtree(在整个手稿中使用包装胶合图用于可视化,重点关注树结构的拓扑结构),将加权的Jaccard距离馈入邻居加入算法进行系统发育的重建和可视化(用于可视化)。
最初,我们通过对所有细胞类型的突变分布进行建模,选择了“谱系信息” MTDNA突变。我们删除了随机分布的突变,这可能是在某些无偏的干细胞克隆中产生的,因此在研究细胞类型的亚克隆起源方面的信息不足。具体而言,我们首先将所有细胞类型分为四个主要的分化轨迹:髓样(GMP,MDP,单核细胞),淋巴样(CLP,Prob,CD4,CD4,CD8,B,NK),MKS(MK祖细胞)和红细胞(MEP,MEP,红细胞,红细胞,红细胞,胚芽祖细胞)。使用二项式测试在任何两个分化轨迹之间测试了每个mtDNA突变的频率。当所有比较的P值大于0.05时,mtDNA突变被定义为随机分布。我们滤除了所有随机分布的突变,并生成了谱系信息mtDNA突变列表(在图2G中使用了631个谱系信息突变)。使用这些突变,我们生成了矩阵CBIN并计算出加权Jaccard距离。然后,我们生成的KNN图G描述了基于共享突变的细胞到细胞谱系关系。然后,我们将多组学分析的细胞类型注释与图G。对于任何给定的单元格(查询单元),计算了图G图G上KNN中每种细胞类型(目标细胞类型)的比例。然后将每个查询细胞类型的靶细胞类型比例汇总和缩放,如图2G和补充图5所示。最后,基于邻里的目标细胞型比例,通过层次聚类分组查询细胞类型。
对于HSC的特定研究,我们在实验中富集了CD34+ CD45RA -CD90+种群,如前所述。我们使用半无监督的方法进一步完善了HSC种群。首先,我们使用SEURAT71对WNN上的所有细胞进行了基于社区检测的聚类。其次,我们平均每个集群的HLF基因表达水平,并定义了HLFHI和HLFLOW簇。第三,我们同时检查了每个单元45,72的HLF和CRHBP基因表达水平。我们要求任何HSC细胞高度表达HLF和CRHBP,并且也分组在HLFHI簇中。使用其他HSC特征进一步检查了定义的HSC,包括MECOM,HOPX,AVP,MLLT3,RBPMS和其他45,73,74。为了提高弱表达基因的鲁棒性,使用RMAGIC包装来增强表达数据75。
对于上面的精制HSC,我们在WNN上进行了辅助聚类来定义亚群。使用Seurat以0.6的分辨率鉴定了这些。在基于RNA,ATAC和WNN的UMAP上可视化亚群。使用Seurat使用FindMarker函数鉴定出差异表达的基因和可访问的染色质。通过hocomocov11_full_full_human_mono人类转染因子基序数据库来分析差异峰的DNA结合基序,然后进行HSC亚种群特异性开放式染色质峰(与补充图6)。使用Chromvar76,77对单细胞水平的差分基序的可视化。
为了最好地捕获主HSC克隆结构,我们使用二元化mtDNA变体矩阵上的术语频率 - 内频频率和单数值分解进行了归一化和尺寸降低。前30个潜在的语义索引用于测量欧几里得距离,该距离进一步传递给了邻居加入算法以构建系统发育树。接下来,如前所述,使用最大可能的方法将mtDNA突变分配给树枝,该方法已纳入yreemr(add_assignvariant函数)26。我们将HSC克隆基团定义为包含至少50个单元的最小进化枝单位,基于至少一个自信分配的突变的基于基的边缘(“边缘”是指连接系统发育树中两个节点的线;使用了来自edeem-r的add_tree_cut函数)。
接下来,我们检查了每个HSC克隆组在所有HSC亚群中的分布,这些分布由RNA和基于ATAC的细胞状态定义。与背景相比,计算了每个细胞态亚群中给定克隆组的倍数富集,并通过超几何测试估算了P值。从两个采样时间点比较了跨HSC的倍数富集和P值。使用Fisher的方法合并了两个时间点的P值,并使用QVALUE R软件包计算FDR。用于定义HSC克隆到细胞状态偏好的截止截止值如下:合并P< 0.01 and FDR < 0.05 and log2fold change(time point 1) > 0.25 and log2fold change(time point 2) >0.25。完整的统计数据在补充数据4中显示。
将HSC的采样与同一捐赠者中的致力和分化后代相结合,我们旨在使用mtDNA突变谱的相似性将后代分配为HSC克隆基团之一。简而言之,我们首先使用共享的MTDNA突变为来自同一供体的所有细胞建立了一个包容性克隆网络。接下来,来自每个HSC克隆组的HSC细胞用作种子,通过克隆网络传播克隆信息,直到达到固定状态。每个克隆组用于迭代网络传播。在网络传播之后,每个单元携带的信息表示给定HSC克隆组的分配概率,并比较所有克隆组的归一化概率以确定最终分配。
由于mtDNA逐个矩阵的变体非常稀疏,因此自信的单细胞分配的任务具有挑战性。我们先前的研究表明,尽管固有的高维度和单细胞基因组数据的固有性质和广泛的稀疏性质,但单个细胞的表型相关性可以忠实地在细胞对细胞相似性图中进行忠实建模,并通过网络传播算法有效鉴定。在这里,使用类似的原理,我们开发了Scavenge -L,该an使用网络传播策略,该策略利用克隆邻里信息并有效地分配了具有概率指标的细胞。我们认为,可以将单个细胞的克隆结构忠实地蒸馏到一个网络中,在该网络中,每个节点代表一个细胞,每个边缘代表细胞之间的mtDNA突变曲线相似性。通过定义感兴趣的细胞(即HSC克隆组),我们可以利用该网络使用网络拓扑结构和细胞对细胞距离搜索高度相关的细胞(即后代)。
我们首先生成了一个完全二元的mtDNA变体,其中包括所有茎,祖细胞和分化细胞与给定供体的细胞。我们执行了术语频率 - 内部文档频率,然后进行了单数值分解,以降低标准化和尺寸。前30个潜在的语义索引用于构建相互KNN图(MKNN)。Next, we highlighted each HSC clonal group on the mKNN graph then used a random walk-with-restart method to discover the progeny for cells of each HSC clonal group, which we termed seed cells.有关此MKNN图的信息可以分布在固定状态下的网络中保留的信息,以测量属于HSC克隆组(种子细胞)的任何给定电池的概率。我们对每个HSC克隆组(种子)迭代进行了阻尼因子0.05进行了网络传播分析。最后,这产生了一个测量分配置信度的单元格组概率矩阵。我们以高于0.7的最大概率为截止,以滤除模棱两可的后代(补充图7a – e)。
由于HSC也包含在MKNN网络中并通过网络传播处理,因此可以通过网络传播使用算法将它们分配给克隆组;同时,实际的HSC克隆组被用作地面真理。通过比较预测的HSC克隆组与地面真理,我们在将其应用于HSC克隆人群中分配后代之前设法基准了清除– L的鲁棒性(补充图7)。
在研究HSC克隆输出活性的研究中,我们在两个采样时间点上收集了来自同一供体的HSC和所有分化的后代。基于mtDNA突变,我们应用清除– L将分化的后代分配给每个HSC克隆。接下来,我们通过计算每个HSC克隆组的后代数来测量克隆输出水平,然后使用HSC克隆大小(每个克隆组的HSC数量)进行标准化。我们比较了两个采样时间点的克隆输出水平,并计算出Pearson的相关性。为了评估造血界在不同HSC克隆上的贡献,我们将它们从最高到最低排名,并计算了这些克隆贡献的分化后代的累积比例。
接下来,对于每个HSC克隆,我们计算了由细胞态定义的四个主要谱系的比例:髓样(单核细胞,GMP,MDP,CDC),红细胞(MEP,ERYP),MEG(MKP),MEG(MKP)和淋巴样(CD4,CD4,CD8,CD8,NK,B,Pib,clp)。在两个采样时间点,所有细胞通过二项式分布对背景进行二项式分布对谱系偏差进行建模。在两个时间点,具有一致富集倍数变化的HSC克隆被归类为有偏的克隆。使用Fisher的方法将两个时间点的富集p值组合在一起,并使用R包QVALUE作为FDR调整了组合的P值。为每个采样时间点计算了富集折叠的变化。最后,将HSC克隆输出水平和谱系偏差缩放,并计算出Pearson的相关性以评估输出活动与谱系偏见之间的关系。
首先,我们从两个年轻的捐助者(分别为31岁的女性和26岁的男性,Young-1和Young-2)和两个老年捐助者(分别为76岁的男性和78岁的男性,分别为1岁的1岁和2岁的男性,分别为1岁和年龄-2),从两个年轻的捐赠者(分别为31岁的男性和26岁的男性,Young-1和Young-2)那里收集了BMMC和CD34+ HSPC。使用上述相同的共识变异管道和邻居加入算法,我们为所有四个捐赠者重建了系统发育树。克隆膨胀通过两种方法估算:基于克隆和基础。对于前者,我们首先如上所述确定克隆组。简而言之,将变体分配给分支概率,然后我们将树切下至少N自信变体和克隆组大小至少m的分支上。所涉及的参数为M(克隆中的最小单元格数,默认为50),n(默认分支上的累积变体数量最小数量,默认为1),p(默认分配的变体的概率为0.6)和d(倒数为d(转储为小克隆,小于少于d单元))。我们通过累积比例比较了年轻捐赠者和老年捐助者之间的克隆大小的分布。为了排除定义克隆组的参数的潜在偏差,我们调整了参数组合(M,N,P,D),并比较了年轻捐赠者和老年供体之间的克隆大小分布(扩展数据图9C)。接下来,还为每个捐赠者计算了香农多样性指数S,以测量年轻捐赠者和老年人之间的克隆多样性。给定克隆I组I,sizei是该克隆的单元格数。香农多样性指数计算为
对于基于进化枝的方法,我们如前所述确定了扩展进化枝,并使用cassiopeia软件包的函数cassiopeia.tl.compute_expansion_pvalues(可在https://github.com/yoseflab/yoseflab/cassiopeia可用)。简而言之,我们将亚克隆中包含的细胞数量与其直接的“姐妹”进行了比较,并通过合并模型计算了在中性选择下进行观察的概率。P <0.01和至少5%细胞的进化枝被注释为扩展的进化枝(扩展数据图9a)。最后,总结了每个供体的扩展进化枝贡献的细胞比例(扩展数据图9b)。
系统发育结构可用于推断细胞健身36,80,81。我们从丛林软件包(可在https://github.com/felixhorns/jungle上使用)应用函数推理函数,该功能实现了先前描述的概率方法,用于推断克隆人群中样品之间的相对适应性系数。
使用SCATAC读取在单细胞水平上推断染色体Y的损失。从使用CellRanger-ARC(BAM文件)的独特映射读取中,我们首先删除了PCR重复项,并计算每个单元每个染色体的独特片段数量。每个细胞的染色体Y片段的数量是使用总片段数量的二项式分布来建模的。我们将Loy的细胞定义为染色体碎片计数的细胞比预期的十倍(p <0.001)。将局部Loy密度计算为LOY/进化枝大小的单元格数。富集评分计算为通过总密度归一化的LOY密度的Z得分。使用一尾二项式测试进一步分析富集。
有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得。
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本文概览: 根据波士顿儿童医院机构审查委员会批准的样品银行协议,将健康的年轻捐助者的新鲜骨髓样品吸入了知情同意书。根据大众米尔里格姆(Brigham)机构审查委员会批准的样品银行审查方...
文章不错《人造血的解密细胞态和家谱》内容很有帮助