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没有使用统计方法来预先确定样本量。实验不是随机的。除非另有提到,否则研究人员在实验和结果评估过程中并未对分配视而不见。
人类卵巢癌组织是根据在达特茅斯 - 希奇科克医学中心(第17702号)委员会批准的人类受试者批准的方案中采购的;并根据H. Lee Moffitt癌症中心批准的协议(MCCNo。19767和MCCNo。18974)。一部分肿瘤组织要么是冻结的,要么是用于提取蛋白质,要么是新鲜分离并冷冻保存。使用生存染料(Biolegend),将解冻样品中的活细胞门控进行FACS分析。我们已经分析了从莫菲特癌症中心组织核心采购的组织微阵列(TMA),其中包括93 HGSOC和一些对照组织(MCC队列)(批准MCCNo。50264)。使用来自261个前瞻性队列研究(NHS)和NHSII22的261个HGSOC的肿瘤组织,以及来自基于人群的病例对照研究(New England Case-Control研究(NECC COHORT))的180 HGSOC的肿瘤组织。简而言之,NHS招收了121,700名女性注册护士,年龄30-55岁,居住在1976年美国11个州中的1个州中的1个。同样,NHSII招募了116,429名女性注册护士25-42岁的女性注册护士,居住在1989年的14个州中的14个州中的14个州。此后每两年邮寄收集更新信息的问卷。从问卷调查,家庭报告或与国家死亡指数联系的报告中确定了事件上皮卵巢癌病例,并通过病历审查或癌症注册中心确认。该研究方案获得了杨百翰和妇女医院的机构审查委员会和哈佛T. Chan公共卫生学院的批准,以及根据需要的参与注册机构的批准。问卷的退还被认为暗示了知情同意。
NECC使用全州范围内的癌症注册表和医院肿瘤板来识别1992年至200823年从马萨诸塞州东部和新罕布什尔州的2,040例上皮卵巢癌病例,如果没有年轻的电话,没有说话,就没有说话,死了,死了,他的bilorector conternication ersication ersector persector persector persectic erication ersication ersection,女性是不合格的。Brigham,妇女医院和达特茅斯医学院的机构审查委员会批准了研究方案,每个参与者均提供了书面知情同意。
NHS和NHSII要求使用病理学报告中上皮卵巢癌病例的石蜡包裹的组织块,其中包含上皮卵巢癌病例的代表性肿瘤样品。NECC从患者那里获得了肿瘤块,其中大多数被诊断出在Brigham和妇女医院被诊断出。在NECC中,仅在一部分病例中获得组织块的资金,从而过采样了高度的浆液肿瘤。审查组织块以验证组织学和成绩并制作TMA。TMA在DANA-FARBER/HARVARD癌症中心专业组织病理学核心中排列,从至少三个,多达六个,最多六个,具有1.0 mm(NECC)或0.6 mm或0.6 mm(NECC,NHS和NHS和NHSII)直径的核心活检中,从卵巢癌组织块中直径并重新插入了单个块。补充表10中描述了本研究中使用和分析的所有HGSOC标本。
OVCAR3,A549,NIH-H23,HEK-293T,K562和THP1细胞购自ATCC;OVCAR4,OVCAR5和OVACR8细胞是从国家癌症研究所采购的;Kuramochi细胞系是从JCRB细胞库采购的。人类OSE细胞购自Sciencell研究实验室(第7310号)。我们用表达荧光素酶的载体(OVCAR3LUCI)转导卵Car3肿瘤细胞。为了使OVCAR3细胞成为NY-ESO-1特异性T细胞的靶标,将OVCAR3LUCI细胞转导至表达NY-ESO-1(OVCAR3LUCI-NY-ESO-1)。在R10培养基(RPMI-1640,10%FBS,Penicillin(100 IU ML-1),链霉素(100μgml-1),-glutamine(2 mM)(2 mM)(2 mM)(2 mM),钠含量(0.5 mmmmmientiac)(0.5 mmmmmmientiac)(0.5 mmmmmmienticiac)(辅助)(辅助)(辅助)(辅助性)(辅助性)(辅助)(辅助),将肿瘤和原发性HGSOC细胞连续持续培养。除OSE以外的所有细胞系通常在R10培养基中培养。定期在建议的完整培养基中培养OSE细胞,该培养基购自Sciencell Research Laboratories。细胞系通常测试了负支原体污染。
将靶向PIGR 5'-CUUCACAACAGAGCGACGAGUUUUUUUAGCUAGAAA-3'(IDT)靶向PIGR RNA(CRRNA)(IDT),以在无核酸酶的无核心双振动缓冲液(IDT)中制成100μM无菌PCR管。通过在PCR热环生中在95°C下加热5分钟,通过在95°C加热5分钟,通过将CRRNA和TRACRRNA双链体进行退火而制备RNA,然后将其逐渐缓慢冷却至室温。将9μlCRRNA -TRACRRNA双链体与6μl(180 pmol)的Truecut Cas9蛋白V.2(Invitrogen)混合,然后在室温下孵育10分钟,形成Cas9核糖核蛋白(RNP)。将OVACR3或原发性HGSOC细胞悬浮为每毫升5×106细胞的终浓度。将15个CAS9 RNP的15微透明添加到100μl的细胞悬浮液中,并使用霓虹灯转染系统(Thermofisher)进行电穿孔,以1170 V进行,30 ms,用于2个脉冲。然后将细胞培养在R10培养基中。第二天通过流式细胞仪分析ATTO500(TRACRRNA)信号证实了电穿孔,并在五天后通过Western Blot证实了来自OVACR3细胞或原代HGSOC细胞的PIGR丧失。
雌性分别是从Charles River Laboratories和Jackson Laboratory购买的,为4-6周龄的RAG1缺陷(RAG1 - / - )小鼠和同年龄组的NSG小鼠;并由H. Lee Moffitt癌症中心的动物设施维持,其12浅/12个暗周期,约为18-23°C,湿度为40–60%。小鼠实验得到了南佛罗里达大学机构动物护理和使用委员会的批准。
侧面肿瘤是通过注射1×107 ovCAR3或自体的原代人HGSOC细胞(野生型或pigr驱动)细胞来开始的。肿瘤体积计算为:0.5×(L×W2),其中L为长度,W为宽度。将肿瘤组织机械剖分为单细胞悬浮液进行流式细胞仪,或保留以进行RNA和蛋白质分离。
从肿瘤挑战后的第7天开始,在几天内进行了肿瘤内或周围的抗体注射,每20克体重为100μg。
天然杀伤细胞通过腹膜内注射200μgNK1.1中和抗体(抗NK1.1,抗NK1.1,bioxcell,pk136,be0036,be0036)在TUMOR挑战前3天耗尽了NK1.1中和抗体(抗NK1.1,Bioxcell,PK136,BE0036)。
使用笼子和耳罩上的代码名称测量小鼠的肿瘤量,而不是有关小鼠接受的治疗的具体信息。除此之外,没有使用盲方法进行小鼠研究。
在37°C的水浴中解冻冷冻保存的单细胞悬浮液,然后通过离心清除冷冻保护剂培养基。根据制造商的建议,在执行膜联蛋白V+死细胞去除后,用人CD19微粒(Miltenyi Biotec,130-050-301)将可行的单细胞样品串制。根据制造商的建议,使用人B细胞膨胀试剂(R&D Systems,CDK005)对分离的CD19+ B细胞进行计数,并将2×105 B细胞扩展5天。然后,用Epstein-Barr病毒(ATCC-VR-1492)添加1:10的比例,将扩展的B细胞挑战,并保持在R10中,而无需扩张补充剂。在2到3周内,大多数爱泼斯坦 - 巴尔 - 巴尔病毒感染的B细胞都死亡。很少有人承受挑战并变得永生。永生的B细胞生长至汇合。收集条件培养基并使用过滤器(Millipore Amicon,UFC900325)浓缩。使用蛋白质组阵列分析了一部分浓缩上清液对人蛋白抗原的反应性,该蛋白质组阵列包括大约81%的所有被发现成载玻片的人蛋白(CDI Lab)。
使用四聚体对特异性抗原反应性B细胞进行FACS分级,该四聚体由生物素化肽(Genscript)和PE标记的链霉亲和素(Biolegend,405203)制备,并生长。将肽从5.0 mg mL -1储备中添加到B细胞中,在200μl培养基中以每107 B细胞的最终浓度为1.0μg,并在4°C下孵育30分钟,然后用PBS洗涤并在1:20稀释下与链霉亲素– PE一起孵育。我们使用肽HGIPPSCCMNETDCNP和TQSyvralTmDSKKRI分别从永生B细胞的池中分别对TSPAN7-和BDNF特异性B细胞进行分类。
在新鲜培养基中稀释分类的细胞,并以圆底96孔板分布,以使每个板都接收到一个细胞。将另外10,000个用100 Gy X射线和30分钟紫外线照射的B细胞添加到每个孔中的饲料细胞中。然后在1个月内生长了B细胞的单个克隆。根据建议的方案,使用纯化试剂盒(Ligatrap,lt-146kit和LT-095KIT)纯化了条件培养基,并使用Amicon过滤器浓缩,并从浓缩培养基中纯化人IgA或IgG。
为了制备F(AB')2个片段,根据制造商的建议,使用胃蛋白酶消化试剂盒(Thermoscigentific,44988)对人IgA或IgG抗体的FC区域进行了消化。
将CD3 T细胞从外周血淋巴细胞中珠子串制,并用NY-ESO-1 TCR或人FSH – CER14的逆转录病毒构建体转导。使用对应于识别SllMWITQC的HLA-A2限制的TCR的序列进行NY-ESO-1 TCR,该序列对应于NY-ESO-113的残基157至165(公开可用的http://wwwwwww.google.com/patentents/patents/patents/patents/patents/patents/patents/patents/us8143376),并从ID pbfp和ligs中购买。在与荧光素酶兼容的96孔板中,放置了10,000个OVCAR3LUCI-NY-ESO-1或OVCAR3LUCI细胞。洗涤4小时后,添加新鲜培养基,并用非特异性的本地人IgA(ABCAM,AB91025)或IgG(ABCAM,ABCAM,AB98981)以0.5μgml-1的最终浓度处理细胞。在37°C下2 h孵育后,我们在最终体积的200μl中添加了适当的T细胞数量。将细胞在37°C孵化器中孵育4小时或16小时,并使用荧光素酶测定法(Promega)检查细胞毒性。
对于自体细胞毒性测定,将总CD3+ T细胞,CD19+ B细胞和CD45- EPCAM+肿瘤上皮细胞在去除死细胞后进行排序。将B细胞永生,并如“卵巢癌和卵巢培养物的B细胞永生,抗体纯化,蛋白质组阵列和胃蛋白酶消化”中所述分离出生长的B细胞培养条件培养基的浓缩上清液的IgA或IgG抗体。肿瘤细胞在R10培养基中生长以进行连续培养。将一千个肿瘤细胞放在96孔板中。洗涤4小时后,添加新鲜培养基,并用自体B细胞衍生的整体或脱蛋白的IgA,自体IgG或以0.5μgml-1的最终浓度为0.5μgML-1的整体或腹膜化的人IgA。在37°C下2 h孵育后,我们在最终体积的200μl中添加了10,000个T细胞。将细胞在37-°C孵化器中孵育16小时。通过流式细胞仪分析总凋亡细胞(膜联蛋白V+)和活细胞(膜联蛋白V-碘化物)。
Wild-type or PIGR-ablated OVACR3 cells were incubated with irrelevant IgA or IgG for 2 h, FSH–CER T cells were added (1:1) and after 16 h incubation in a 37-°C incubator, total apoptotic cells (annexin V+) and viable cells (annexin V−propidium iodide−) were analysed by flow cytometry.
将一千个OVCAR3LUCI细胞放在96孔板中,并在4小时清洗4小时后,然后在37°C下与抗TSPAN7-IGA(0.5μgml-1)抗体一起孵育2 h,在37°C下孵育2 h,然后在肿瘤中添加301型胶质胶质细胞,然后将其固定在301型中,均为i型或usiby typy in Ispody typy typy in Ispody 11,是Antipy typy in Ispody typy typy tym iCoty typy typrode typrody in Ispody typy typy typrody in Isate tym typy typrody in Isaty型。以1:1的比例进入OVACR3细胞并孵育12小时,并使用荧光素酶测定法(Promega)检查了细胞毒性。
细胞毒性计算为(最大生态控制 - 个体井)/(最大生态控制 - 最大死亡控制)×100,为百分比。
使用Perkinelmer蛋白石7彩色自动化IHC试剂盒对FFPE TMA进行免疫染色,并在债券Rx自动固定器(Leica Biosystems)和以下抗人类抗体:CD3(Dako,A0452,1:100),CD4,CD4(cell Marque,Ep204,104,104,104r-25,1 100)(dako,a0452,1:100)(dako)(a0452,1:100M7103,1:800),CD19(Dako,Le-CD19,M7296,1:50),CD20(Dako,L26,M0755,1:800),CD138(Dako,Dako,Mi15,M7228,1:500)EPR5367-76,AB124716,1:1000),IgG(ABCAM,EPR4421,AB109489,1:500)和Pan-Cytokeratin(PCK,Dako,Dako,ae1/ae1/ae3,m3515,1:200)。用DAPI染色核。确切地说,将组织在65°C下烘烤2小时,然后转移到键Rx(Leica Biosystems),然后自动脱氧蛋白脱氧水液和使用Opal IHC程序(Perkinelmer)自动取回抗原检索。包括自动荧光载玻片(阴性对照),这些载玻片使用忽略蛋白石荧光团的一抗和二抗。扫描载玻片并使用Perkinelmer Vectra3自动定量病理成像系统成像。多层TIFF图像从Inform V.2.4.8(Perkinelmer)导出,并加载到Halo v.3.0.311.328(Indica Labs)中,以进行定量图像分析。将每个荧光团均分配给染料颜色,并根据已发表的核或细胞质染色模式确定每个标记的阳性阈值。肿瘤胰岛和基质中的定量通过PCK染色区分。从样品集的每个荧光标记物中用细胞质,核和总细胞计数导出数据集。通过信息生成细胞分割文件,并通过FCS Image V.7.0生成并分析点图。在扩展的数据图中总结了具有适当的阳性和阴性对照组织(包括同种型对照抗体)(包括同种型对照抗体)的多重免疫组织化学染色实验。7,8。确切地说,人类扁桃体切片被用作CD3,CD4,CD8,CD19,CD20,CD138,IGA,IgG,IgG和PCK的阳性对照 作为对PIGR的负面对照。健康的肾脏组织切片被用作PIGR的阳性对照。胶质母细胞瘤切片用作CD3,CD4,CD8,CD19,CD20,CD138,IGA,IGG和PCK的阴性对照。用同种型对照抗体染色各个阳性组织相邻切片,以排除假阳性染色。
与APC结合试剂盒(ABCAM)偶联,将整体或杂化,非抗原特异性或特异性IgA或IgG抗体偶联。将五万个OVACR3细胞(野生型或pigrated)放在6孔板内的盖玻片上,并在用抗体处理12小时后。孵育不同小时后,用含DAPI的安装试剂(CST)洗涤细胞,固定和安装。使用LAS X(v.3.5.5.19976)软件在共聚焦显微镜(Leica SP8)中捕获图像。使用Zeiss Imager Z2直立显微镜使用ZEN 2.3(蓝色版)软件进行定量采集。CZI图像文件被导入定义组织工作室v.4.7(定义),以量化细胞Cy5强度。该软件用于运行核和细胞检测算法,以分割每个细胞,核和细胞质,并计算这些隔室中的平均CY5强度。设置强度和大小阈值以最大程度地减少由人工制品和背景荧光引起的假阳性检测。
根据制造商的建议,使用TUNEL ALEXA FLUROR 647成像测定试剂盒(Thermo)对TUNEL+细胞进行异种移植肿瘤FFPE切片染色。用Orca-Flash 4.00 V3 CMOS摄像机(Hamamatsu Photonics K.K.)和Zen 2蓝色软件(Carl Zeiss)捕获瓷砖图像,并以CZI文件格式存储。该软件还用于将图像瓷砖缝合到全扫描图像中。代表性图像被导出至8位TIFF格式。CZI图像文件被导入定义组织工作室v.4.7,以量化TUNEL+细胞的数量。该软件用于在整个扫描图像的CY5通道上运行核检测算法。设置了强度和大小阈值,以最大程度地减少假阳性检测导致伪影和背景荧光。用自动滑动扫描仪(Aperio-Leica扫描仪控制台(v.102.0.7.5))对每个肿瘤的相邻截面染色,并用自动幻灯片扫描仪(V.102.0.7.5)进行扫描,并检查图像在组织内的坏死孔。手动注释每个组织截面以确定整个组织截面和大坏死孔的面积。TUNEL+细胞的数量通过总组织面积减去出现在许多肿瘤切片中的大坏死孔区域。
将异种移植物tumour ffpe切片重新水化,抗原,阻塞并用抗人IGA抗体孵育过夜,然后与Alexa Fluor 647偶联的二级抗体(CST,4414)孵育并安装。将CZI图像文件进口到定性组织工作室v.4.7,以量化组织中阳性焦点的数量。该软件用于在DAPI通道上运行核检测算法和CY5通道上的点检测算法。设置强度和大小阈值以最大程度地减少由人工制品和背景荧光引起的假阳性检测。通过核的总数将每个组织的阳性焦点数归一化。
通过用僵尸NIR(Biolegend)或僵尸黄色(Biolegend)或DAPI(热科学)生存力染色进行染色,用抗CD16/32(Biolegend)(Biolepoygend)染色,并在4°C下用抗CD16/32(Biolepoilgend)染色30分钟,以接下以下抗CD3的30分钟:Biosc cd35(Bd 330)(bd cd45)(bd cd45)(bd cd45(bd cd45),Biosciences,SK7,1:200),CD19(BD Biosciences,Hib19,1:200),CD20(Biolegend,2H7,1:200),CD38(BD Biosciences,HIT2,1:200),CD138(CD138Biosciences,35-8016-M001,1:20),IgG(Biolegend,M1310G05,1:200),IGM(Biolegend,MHM-88,1:200),IGD(BD Biosciences,IA6-2,1:100),1:100),IGE(BD BIOSCIENCES,bd BIOSCIENCE,bd BISCIENCE,bd bd bdec,1:100)KS1/4,1:200),PIGR(热科学,PA5-35340,1:50)或针对TSPAN7或BDNF的四聚体。对于免疫球蛋白同种型的细胞内染色,首先将细胞与表面染色抗体(30分钟的冰)孵育,然后固定(在室温下为30分钟)(EBIOSCIENCE)(EBISOSCIENCE),最后与固定在玻璃液化液(ebioscienciencience)中的细胞内标记的抗体(45分钟)(45分钟)(45分钟)。
用FC阻滞剂(Biolegend)阻断小鼠异种移植单细胞悬浮液或脾细胞,并通过流式细胞仪在4°C下孵育30分钟,然后通过抗小鼠抗体进行30分钟进行分析:CD45:CD45(Biolegegend,30-F11),CD11b(Biolegend,Biolegend,M1/70),M1/70,CD351(CD351),CD351(TH3551)APC偶联的人IgA。机械地分解了来自RAG1缺乏小鼠的脾细胞并去除红细胞,然后通过与CD351中性化抗体(Biolegend,biolegend,TX61,137303)孵育,然后以23333的浓度(abiolegend)(abiolegends)(abiotrations a a imolegents a a imolegents,400123),通过与CD351中性化抗体进行中和Fcα/μ受体(FCα/μR)进行中和化。在冰中以100μl体积的106个细胞持续30分钟。洗涤后,将脾细胞与APC偶联的人IgA孵育30分钟,并通过流式细胞仪进行分析。运行适当的同种型对照和荧光减去。随后使用BD FACS LSRII或使用BD FACS ARIA进行样品。使用BD FACS Diva v.8.0.1收集数据,并使用FlowJo V.10.7.1进行分析。用于流式细胞仪分析的门控策略总结在扩展数据2中。9,10。
在2%含FBS的RPMI培养基中培养的OVCAR3细胞用或不含0.5μgml-1的天然人IgA或IgG处理24小时。使用RNA分离试剂盒(Qiagen)从培养细胞中分离总RNA,并分析RINE。使用Illumina NextSeq 550仪器来生成75-Basepair配对的RNA测序(RNA-Seq)读取。使用BCF2FASTQ(v.2.20)将基本调用转换为FASTQ文件。配对 - 末端RNA-seq读数在通过Casadapt25(V.1.8.1)修剪的适配器修剪后,使用Star24(V.2.5.3a)对准GRCH37人参考基因组。对于OVCAR3细胞,使用Gencode V30转录本的注释,通过FeAutRecounts26(V.1.5.3)计数唯一映射的读数。使用DESEQ2(V.1.30.0)27进行差异表达分析。使用Z得分转化的Log2(1 +归一化计数)生成热图。
对于每个差异表达分析,将经过抗体处理组与未处理组的抗体分析进行了比较,基于基因基于-LOG10(p值)×(log2的符号(折叠变化))对基因进行排名。预先的基因列表用于执行预先的GSEA28(v.4.0.2),以评估MSIGDB28中的标志,策划基因集和基因Ontology29术语的富集。所得的归一化富集评分和错误的估计控制P值用于评估IgA诱导的转录组变化。
将十万ovcar3,ovcar4,ovcar5或原发性HGSOC-tumour细胞放入6孔板中,并在12小时后用PBS洗涤,然后在无用的Brefeldin A(1μgml-1)或worntmannin(1μm)中处理血清无需RPMI RPMI培养基。4小时后,以或没有天然人IgA(ABCAM,AB91025)或IgG(ABCAM,AB98981)为0.5μgml -1终浓度后处理4小时。12小时后,收集条件培养基并过滤以去除污染物碎片。从条件培养基中提取蛋白质,通过DTT还原,被胰蛋白酶消化,并通过Moffitt Cancer Centar Center蛋白质组学设施进行LC -MS/MS分析。使用MAXQUANT(V.1.5.2.8)来分析数据,识别和量化蛋白质30。
用蛋白酶 - 磷酸酶抑制剂鸡尾酒(Sigmaaldrich)将细胞和机械分解的肿瘤样品在RIPA缓冲液(热科学)中裂解,并通过离心清除。通过BCA分析(热科学)对蛋白质进行定量。Membranes were blotted with anti-pIgR (Abcam, ab96196, 1:500), anti-IgA (Abcam, EPR5367-76, ab124716, 1:2,500), anti-phospho-ERK1/2 (CST, D1H6G, 5726, 1:1,000), anti-ERK1/2 (CST, L34F12,4696,1:2,000),抗DUSP5(ABCAM,EPR19684,AB200708,1:1,000)和抗β-肌动蛋白(CST,13E5,5125或4970,1:5,000)抗体。对于TSPAN7和BDNF,使用了来自TSPAN7-和BDNF反应性B细胞的浓缩条件培养基中分离的IgA抗体。使用马萝卜过氧化物酶偶联的二抗(CST,7074,1:5,000; CST,7076,1:5,000; ABCAM,ABCAM,ABCAM,AB97215,1:5,000)和增强的化学发光底物(GE医疗保健)开发免疫反应性带(CST,7074,1:5,000; CST,7076,1:5,000; ABCAM,ABCAM,AB97215,1:5,000)。
使用未还原的非解剖裂解试剂(Pierce)中提供的非还原非裂解试剂(Pierce)中提供的非还原裂解试剂,将HGSOC肿瘤组织块粉碎并裂解。卵子细胞,CD45+和CD45-人类卵巢癌腹水的颗粒也用相同的非定性裂解试剂裂解。将无细胞的人卵巢癌症液体过滤,浓缩并用非定性裂解试剂稀释。使用抗人IGA抗体(ABCAM,EPR5367-76,AB124716,1:20)对蛋白质进行免疫沉淀,并按照制造商的说明进行了洗脱。对PIGR和IGA进行了洗脱液和输入的免疫印迹。通过抗抗人类IGA抗体(野生型或PIGRAPAR的)细胞中的跨经细胞增多实验的条件培养基浓缩并通过抗人IGA抗体进行免疫沉淀,并且部分衰老被西部用于PIGR(ABCAM,SC-05,SC-05,AB3924,1:500)或通过lc-smss/smsms/smass/MSS/MSMS,将其用于PIGR(ABCAM,SC-05,SC-05,ABCAM,SC-05,ABCAM)。
来自TCGA的分子和临床数据用于卵巢浆液性囊肿旁癌(指定OV)从CBIO癌症基因组学门户(http://www.cbioportal.org/)下载,广泛的Firehose网站(https://gdac.broadinstitute and Genomic and Genomic and Genomic Data Portal and Genomic Data Portal)(https://portal.gdc.cancer.gov/)。在本研究中,共有428名具有匹配临床信息和肿瘤RNA-seq数据的患者。使用Star24(v.2.5.3a)将原始RNA-Seq读数与GRCH37人类转录组对齐。使用htseq-count31(v.0.6.1)对Gencode V.19进行独特对齐的读数,然后使用DESEQ227考虑到批次批次和RNA组成偏置进行标准化。所有统计分析和可视化均使用log2转化的归一化计数进行。进行了Kaplan-Meier生存分析和对数秩检验,以比较组之间的总体存活率。
使用10xgenomics铬系统进行单细胞V(D)J(BCR)测序。分析了使用Nexcelom细胞计K2分析源自HGSOC分级B细胞的单细胞悬浮液,以使其生存力,然后以每μL的浓度为1,000个细胞,将其加载到10倍基因组铬单细胞控制器上,以封装大约5,000个细胞。简而言之,将单个细胞,试剂和10倍基因组学凝胶珠封装到乳液中的单个纳米尺寸凝胶珠中,然后在每个液滴中进行多腺苷酸化mRNA的逆转录。然后,使用10x基因组铬单细胞V(d)J试剂盒以单个大量反应完成cDNA文库,并使用VDJ引物在试剂盒中提供的B细胞受体序列富集。PCR纯化后,根据10倍基因组学方案制备片段DNA文库。V(d)J富集的库在Illumina NextSeq 500仪器上进行了至少5,000个读取。使用10倍基因组CellRanger V(d)J(v.3.1.0)软件进行反复插图,条形码处理,对齐和基因计数。
通过使用细胞Ranger VDJ(V.3.1.0,10x Genomics)将通过V(d)J分析测序的BCR读取与GRCH38参考转录组对齐。使用CellRanger VDJ组装并注释BCR和轻链,并带有-Reference = Refdata-CellRanger-VDJ-Grch38-Alts-Alts-remembl-3.1.0来确定克隆型。重组二聚体IgA抗体是通过Genscript产生的。简而言之,合成了免疫球蛋白重链,轻链和J链的相应DNA序列,并将完整序列亚克隆到PCDNA3.4载体中,并在HD 293F细胞中表达。从细胞培养上清液中洗脱二聚体IgA1抗体。通过SDS-PAGE和高性能液相色谱分析分子量和纯度。
除非另有说明,否则所有数据均以S.E.M.两组之间进行了两尾t检验(不成对和配对),除非另有说明,否则进行了单向方差分析以进行两组以上的比较。进行了皮尔逊相关分析以进行相关分析。To compare IgA+ and IgG+ or IgM+ cell percentage in B cells, plasmablasts and plasma cells, two-way ANOVA followed by Dunnett’s ad hoc tests for multiple comparison was performed on arcsine-transformed percentage data (IgA versus IgG or IgM, P value = 1 × 10−10).分析是在Graph Pad Prism(V.7.0)或R(V.3.6.1)软件中进行的。使用P值的显着性阈值0.05。使用r(3.6.1)中的gglot2生成框图,其中包括以下参数:水平黑线,每个盒子都有中位数值;盒子从价值的25%延长到第75个百分点;晶须延伸至盒子以外的1.5×四分位间距(第75%-25%);最低点是最小值,最高点是每个框的最大值。除非另有提到,否则所有实验均由几个生物学重复或独立实验表示。图例中指示了每个实验的重复数量。条形图是平均±S.E.M.带有代表独立实验或重复的覆盖数据点。在人体衍生的标本中,所有蛋白质印迹分析均可独立复制两次,而在体外实验的情况下进行了三次,结果相似。共免疫沉淀实验是独立复制的,最少两次,结果相似。对于所有TMA的多重免疫组织化学,单个肿瘤在TMA上复制了核心(2-6个,来自肿瘤的不同区域),并使用了复制核心的平均定量值。对TMA载玻片进行了两次扫描,分析, 并与<1%的数据变化一起使用。CRSIPR介导的敲低实验独立重复了三次。图传奇和补充表1-12提供了统计分析的其他信息和测试结果。在研究人类标本之前,未进行样本量计算。对于大多数功能性的体外分析,根据靶细胞的可用性选择样本量。小鼠实验每个实验至少使用五只小鼠。由于这项研究的重点是卵巢癌,因此在实验设计中仅包括雌性小鼠。实验不是随机的。HGSOC肿瘤和腹水标本是从去识别的患者中获得的,但未随机。获取并分析了未鉴定的没有癌症的供体的外周血单核细胞。小鼠不是故意随机的。使用笼子和耳罩上的代码名称测量小鼠的肿瘤量,而不是有关小鼠接受的治疗的具体信息。除此之外,没有使用盲方法进行小鼠研究。RNA-SEQ,BCR测序,多重免疫组织化学定量,荧光显微镜定量或LC – MS/MS进行了无法识别的分离。在体外实验的情况下,通常将样品分配给代码编号,以促进盲流细胞仪,显微镜和荧光素酶测定法。收集所有数据后,对结果进行了分析和解码。为了分析人类标本,由于未测试干预措施,因此不适用盲目。
有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然研究报告摘要中获得。
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本文概览: 没有使用统计方法来预先确定样本量。实验不是随机的。除非另有提到,否则研究人员在实验和结果评估过程中并未对分配视而不见。 人类卵巢癌组织是根据在达特茅斯 - 希奇科...
文章不错《IGA转介症和抗原识别控制卵巢癌免疫》内容很有帮助