对编码全长DTISRB的基因（残基1-353）进行了优化，合成（Twist Bioscience）并将其克隆到修饰的PC013矢量（addgene质粒编号90097）中。DTISRB编码区域由HIS6-TWINSTREP-TAG ，SUMO-TAG ，DTISRB和GFP-TAG组成 。野生型DTISRB在大肠杆菌（De3）plyss细胞（Novagen）中以18°C的形式表达 。在Luria-Bertani培养基（含100 mg l-1氨苄青霉素）中，在37°C培养大肠杆菌 ，直到OD600达到0.5 ，然后通过在18°C下添加0.1 mM Isropopyl-β-thiogalactopypypylanoside诱导蛋白质表达。将大肠杆菌细胞重悬于缓冲液A（50 mM Tris-HCl，pH 8.0 、20 mM咪唑和1 M NaCl）中，通过超声处理裂解 ，然后离心 。将上清液与Ni-NTA琼脂糖（Qiagen）混合 。用缓冲液A ，缓冲液B（50 mM Tris-HCl，pH 8.0 、20 mM咪唑和0.3 m NaCl）和缓冲液C（50 mM Tris-HCl ，pH 8.0 ，0.3 M咪唑和0.3 m NaCl洗涤蛋白质柱）。用缓冲液D（50 mM Tris-HCl，pH 8.0、0.3 M咪唑和1 M NaCl）洗脱蛋白质。使用PCR放大的DNA模板在体外用T7 RNA聚合酶在体外转录DTISRB的同源ωRNA ，并使用Hiscribe T7快速高产量RNA合成试剂盒（NEB） 。该模板由T7启动子（Taatacgactcactatagg） ，指南（GCCTTATTAAATGACTTCTC）（残基1-20）和ωRNA支架（残基21-282）组成 。根据制造商的说明，使用RNeasy套件（Qiagen）纯化了转录的RNA。靶标和非目标DNA链（分别为GatcagctCaagagaAgtCatttaAggc和Ttgagctgat）购自Genewiz 。为了重新建立复合物A ，将纯化的DTISRB蛋白与ωRNA ，靶DNA链和非目标DNA链（TTGA TAM）（TTGA TAM）（摩尔比，2.3：1：7：7）在缓冲液中（10 mm Tris-Hcl ，pH 8.0和50 mm Nacl ，Nacl，5 mmmmmmmmmgcl2） 并在37°C下孵育15分钟 。通过用缓冲液F（20 mM HEPES-NAOH，pH 7.0和50 mM NaCl ，5 mM MGCL2）平衡的超糖6增加10/300柱（Cytiva） ，通过凝胶过滤色谱纯化了复合物A。复合物A（最终浓度：0.1 mg mL -1）与BS3（最终浓度：0.5 mm）在4°C下孵育2小时 。对于复杂B的重建，将Lambda N蛋白（MDAQTRRRRERRAEKQAQWKAAN）插入了DTISRB和GFP-TAG之间 。ωRNA支架的残基34–67（残基21-282）被GAAA接头代替。将GAAA链接器融合的盒子RNA（Gaaagcccugaagaagggc）（残基283–302）附加到ωRNA支架的3'端 。使用相同的靶DNA链来进行重构 。5'扩展非目标DNA链（Tackgaagagttgagctgat）购自Genewiz。The purified DtIsrB protein was mixed with the ωRNA, the target DNA strand, and the non-target DNA strand (the TTGA TAM) (molar ratio, 2.3:1:1.5:1.5) in buffer G (10 mM Tris-HCl, pH 8.0 and 50 mM NaCl) and incubated at 37 °C for 15 min.通过与缓冲液平衡的相同大小排斥柱纯化复合物B 。对于网格制备 ，将纯化的复合物A和B溶液（0.1 mg ml-1 ，3 µl）应用于新鲜发光的Ultraufoil 300 MESH R1.2/1.3 GRIDS（QUANIFOILS（QUANSIFOILS）（QUANIFOILS）在VitroBot Mark and AT 4 IV（Quii）的新鲜发光的超固定量 。在95％的湿度下，将2和4 s的斑点时间分别为2和4 s。
使用Titan Krios G2显微镜（Thermo）在HHMI Janelia Research校园收集了复合物A的冷冻EM数据 ，该数据以300 kV运行 ，并配备了Gatan Bioquantum Energy Fileer（Gatan）和后滤波器的K3 Direct Direct Electron Detector（Gatan）在电子计数模式下。每个视频的标称放大倍数为×105,000，对应于每个物理像素（0.4195Å每个超级分辨率像素）的0.839Å ，电子暴露于每秒12.075电子的每秒12.075电子 ，总暴露时间为5.0 s，累积暴露于60 E-/Å2 。然后 ，每帧以1.2 e-/Å2剂量收集每个视频的50帧 ，每次视频总计60 e-/Å2剂量 。名义散焦范围设置为-0.8至-2.2 µm。使用Serialem中的脚本进行自动数据收集 。对于每个阶段位置，图像转移都用于收集来自九个孔的数据，每个孔有两个视频采集 。校准图像移位诱导的光束倾斜 ，并在数据收集期间应用梁倾斜校正。使用Talos Arctica G2显微镜（FEI）在MIT.NANO上收集复合B的冷冻EM数据 ，该数据以200 kV运行，并在线性模式下配备了Falcon 3EC直接电子检测器（Thermo） 。每个视频的标称放大倍数为×120,000 ，对应于24.54 E-/PIX S -1的校准像素大小为1.2550Å ，3.99 s，导致62.53 E-/Å2的累积暴露 。接下来 ，每帧以3.1265 E剂量收集20帧 ，总计62.53 e-/Å2剂量。标称的散焦范围降低在-2.6至-1.0 µm 。使用EPU软件（Thermo）进行自动数据收集 。对于每个阶段位置，图像移动都用于收集九个孔的数据。为了获得复合物A的3D重建 ，使用RISION-4.0（参考文献26）处理数据 。将视频帧在5×5斑块中对齐 ，并在MotionCor2中加权剂量（参考文献27） 。通过CTFFIND-4.1估算了散焦参数（参考文献28）。从4,142个预处理显微照片中，基于黄玉的自动挑选29拾取了1,626,574个颗粒 ，并以3.146Å像素-1提取。然后在1.144Å像素-1中重新提取所选的107,066个颗粒 ，并进行一轮3D细化和3D分类而无需对齐 。所选的58,188个颗粒受到每粒子散焦估计和贝叶斯抛光的约束 。对于横梁倾斜的细化，每个显微照片的光学组是根据舞台的孔位置设置的。根据傅立叶壳相关性0.143标准，对抛光颗粒进行了3D细化 ，并产生的图为3.10Å 。为了获得复杂B的3D重建 ，使用相同的程序处理数据 。从2,542个运动校正和剂量加权显微照片中，基于TOPAZ的自动采摘 ，将1,595,800个颗粒捡起 ，并在3.138Å像素-1中提取。这些粒子进行了几轮2D和3D分类 。然后将所选的50,661个颗粒在1.255Å像素-1中重新提取，并使用CryoSparc30进行均匀的细化 ，并根据傅立叶壳相关性0.143标准产生6.85Å的地图 。
The initial protein model was generated using AlphaFold2 (ref. 31) under the ColabFold framework using default parameters and MMseqs2 to search for homologues into the ColabFold database32, and manually modified using COOT33 and ISOLDE7 against the density map of complex A. The initial nucleic acid model was built with auto-DRRAFTER using the density map of complex A and the covariance-based secondary structure modelωRNA8。使用具有–Max选项的CMSEarch34预测ωRNA（查询）二级结构 ，以识别先前研究中最高评分的ISCB/ISRBωRNA协方差模型4 。对于最佳模型，与模型对齐的查询区域是从模型预测中分配的二级结构 。茎环二级结构被发现错误地分配给基本对 ，具有等于间隙字符的基本身份之一被重新分配到没有二级结构。然后使用MFOLD35预测了无覆盖率的查询区域的二级结构（≥8bp与最佳协方差模型匹配） ，除非在3'端以外的3'末端进行低保护区域，否则使用MFOLD35预测 。通过识别给定ωRNA类型预期的伪单位位置处的匹配底座 ，手动分配伪诺 。从基于协方差的二级结构模型开始 ，用自动绘制器对ωRNA坐标进行建模，在该版本中，所有非基本基碱对对 ，大多数仅由单个碱基对组成的螺旋。下面提供了该二级结构的点式符号符号：
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所有DNA核苷酸均被建模为RNA ，因为自动drrafter无法对DNA核苷酸进行建模 。指南/ωRNA支架/靶DNA/非目标DNA分别分配给残基1-20/21–282/283–313/314–323 。下面提供了用于建模的完整RNA序列：
ggccuuauuaaaugacuucucgucaaccaccccugacugaagucagaggcuugcuucuggccugaguugggggcccgguuuggcggggccgggggcaacuggcugaccaggcggcccgguucgccgggcagggguccgcggggcuaccaaggacuuccggguguuucgccagcccggacuaucuccggcagaaccgcucaaugccgcggccggccaagaccggccuaagcccugcggacagcgccgaggcgacaaucacuccgaaaggaggccguguaucggcgaucagcucaagagaagucauuuaauaaggcuugagcugau
在没有蛋白质坐标的情况下 ，使用与已去除蛋白质密度相对应的区域进行自动建模。所有初始建模的回合均在初步的4.3-Å分辨率密度图中进行 。通过拟合与残基W：1-14 W：41–48 W：53-60 W：258–269 W：271–281 X：271–281 X：2–11 x：2–11 x：18-31 y：1-10在密度映射中 。在第二轮自动建模中，允许与残基W：41-48和W：53-60相对应的螺旋 ，从其初始位置移动。进行了五轮建模 ，然后进行了最后一轮建模 。对于每一轮，建立了2,000至6,000款 。Isolde和Phenix6与蛋白质模型一起选择了十大评分模型之一 ，以进一步完善 ，以优化几何形状并改善对低温EM密度的拟合。在检查了优化的模型和基于协方差的二级结构之后，进行了另外两轮自动建模 ，包括一轮 ，其中进行了一轮，其中对适配器伪诺特的基础配对进行了稍微修饰，以使残基81-84和194-197与194-197进行了配对 ，而不是配对 ，而不是残基81-84和193-119-19-19-19-19-19-19-19-19-19-19-196-196 。对于这种额外的建模，仅重建残留物W：73-99和W：186–206；所有其他残留物保持固定 。使用3.1Å分辨率密度映射的低通滤波到4Å ，进行了最后一轮建模。这些模型的最终收敛性（模型之间的成对根均方根偏差）为4.1Å。先前已证明自动收敛值可以预测模型的准确性 。使用收敛和模型精度（0.61×收敛+2.4Å的精度）之间的线性关系 ，这些初始计算产生的模型的估计准确性为4.9 。为了进一步提高准确性，这些模型之一是用COOT完善的 ， Isolde和Phenix与蛋白质一起产生最终的ISRB –ωRNA-TARGET DNA复合模型。最终模型（缺少蛋白质残基1-5/211–224/348–353 ，RNA残基1–2/37–64/119–122/212-219/263-265和目标DNA残基1/30–31，这些残基1/30-31被摩尔布（Molproby36）评估 ，这些模型差异很差 ，并从最终模型中评估了最终模型） 。用Cuemol（http://www.cuemol.org），Pymol（https://pymol.org/2/） ，ucsf chimera（https://wwwww.cgl.ucsf.edu/chimera or chimera or chimera or chimera or chimera or chimera or Chimera X制备了分子图形和EM密度图（https://www.cgl.ucsf.edu/chimerax/） 。
为体外转录/翻译表达系统制备ISRB蛋白和ωRNA模板。The IsrB protein template consists of the T7 promoter and translation initiationsequences (GCGAATTAATACGACTCACTATAGGGCTTAAGTATAAGGAGGAAAAAATATG), IsrB ORF sequence and T7 terminator sequence (CTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTG).ωRNA模板由T7启动子序列（GGAATATAATACGACTCACTATAGG）和ωRNA序列组成 。将ISRB蛋白和ωRNA模板嵌入在改良的PC013载体中（Addgene质粒编号90097）和PCOLADUET-1矢量中 。通过基于PCR的方法引入ISRB蛋白和ωRNA中的突变 ，并通过DNA测序确认序列。320 bp PCR-Amplicon（30 ng）包含20-nt靶序列和TAM，并用5'IRDYE 700（IDT）荧光标记，ISRB蛋白质素模板（50 ng）和ωRNA模板（125 ng）在12.5 ng中均与12.5μl的5μl ，含有5μl的iSRB蛋白质模板（50 ng）和5μl ，含有5μL的求解 。Pure Xpress在体外蛋白质合成试剂盒（NEB） 。反应条件被优化如下。图2d，3 h：2 h在37°C时 ，在60°C下1小时；图3C ，2.1 h：2 h在37°C时，在60°C下5分钟；图3H ，3 h：2 h在37°C时 ，在60°C下1小时；图4C（CWISRB，DSISRB和BBISRB）在37°C时为6 h；图4C（CSISRB） ，37°C时6 h：2 h ，在60°C下4小时；图4C（K2ISRB）和37°C的2小时 。DTISRB源自嗜热有机体D. Thermocuniculi，其生长在60-80°C（参考文献38） 。通过添加3 µg RNase A（QIAGEN）和0.24单位的蛋白酶K（NEB）来停止反应。使用向导SV凝胶和PCR清理系统（Promega）纯化反应产物 ，在Novex 10％TBE-TEREA凝胶（Invitrogen）上解析 ，然后使用Chemidoc成像系统（Bio-Rad）进行可视化。为了检查缺失突变体的蛋白质稳定性， 在冷冻EM样品制备中使用的细菌表达系统中产生ISRB蛋白 。将大肠杆菌细胞重悬于缓冲液A（50 mM Tris-HCl，pH 8.0 、20 mM咪唑和1 M NaCl）中 ，通过超声处理裂解 ，然后离心 。上清液与magnehis珠（Promega）混合。用缓冲液A洗涤蛋白质结合的柱 。蛋白质用缓冲液B（50 mM Tris-HCl，pH 8.0 ，0.3 M咪唑和1 M NaCl）洗脱 ，并通过SDS-PAGE进行分析（扩展数据图5B） 。为了确定ISRB DNA裂解位点，包含20-NT靶序列（GCCTTATTAACCTCAGCCTC）的816 bp PCR-Amplicon（400 ng） ，并将TAM与ISRB蛋白模板（100 ng）和7.ωRNA模板（125 ng）在255 ng中孵育255 ng fuff fufffaff 255 ng fuff fuffectpurexpress的溶液B在体外蛋白质合成试剂盒中。纯化反应产物后 ，使用NB.BBVCI（NEB）裂解了划痕的产物 。通过DNA测序（Genewiz）对裂解的产物进行凝胶提取，纯化和分析 。
具有完整RUVC活性催化位点残基的代表性ISRB ，在以前的研究4中确定的ISRB的三个主要进化枝中未选择截断迹象 ，与具有G1B型，G1C和G1H的ISRB相对应。从先前的研究4中的预测中获取了与每个ISRB相对应的ωRNA ，并修改了ωRNA的末端发生在ISRB的开始时 。如果由MFOLD确定的相应的ωRNA的二级结构不包含在基于协方差的ωRNA二级结构中 ，则将ISRB丢弃 。该分析提名了CWISRB，CSISRB，DSISRB ，BBISRB ，K2ISRB序列和相应的ωRNA。基于协方差的二级结构和伪诺预测是针对DTRNA所述的相应ωRNA的 。然后使用FORNA39对所有ωRNA进行可视化 。
为了分析PLMP域，在HHPRED中搜索了DTISRB PLMP域中的远程同源物 ，将IF-3识别为推定的远程同源物。来自ISCB/ISRB家族的IF-3-N-末端区域和PLMP域的代表性序列是从Uniprot和国家生物技术信息中心获得的 ，并使用MAFFT-EINSI对齐。使用Pymol超级功能对结构代表进行排列和叠加 。
使用TAM库进行TAM识别测定法，如先前所述4 。Single-stranded DNA oligonucleotides (IDT), containing eight randomized nucleotides downstream of a 20-nt target sequence (GCCTTATTAACCTCAGCCTC), were converted to dsDNA by fill-in with PrimeSTAR Max DNA Polymerase (Takara) and cloned into pUC19 by Gibson cloning (NEB) to generate a TAM library.如体外切割实验部分所述 ，使用包含ISRB蛋白（50 ng）和ωRNA（125 ng）模板的体外转录/翻译表达系统消化库（25 ng）。将CWISRB ，DSISRB，CSISRB ，BBISRB和K2ISRB的反应在37°C下在50°C时在50°C下孵育4 h：2 h ，在60°C下1 h 。将DTISRB的反应在37°C下在37°C下孵育3 h：2 h，在60°C下孵育1小时 。然后 ，通过添加3 µg RNase A（QIAGEN）和0.24单位的蛋白酶K（NEB）来阻止它。使用向导SV凝胶和PCR清理系统（Promega）纯化反应产物 ，并使用NB.BBVCI（NEB）消化 。使用NEBNEXT ULTRA II末端修复/DA-Tailing模块（NEB），NEBNEXT ULTRA II DNA库Prep套件（NEB）（NEB）和Illumina（NEB）的Nebnext适配器，使用Nebnext Ultra II末端修复/DA-Tailing模块（NEB）进行纯化的反应产物进行终端标记和适配器连接 。使用一种特定于TAM库主链特有的引物和一个针对NEBNEXT适配器特异的引物 ，并随后的18个周期PCR添加Illumina imrumina i5适配器。为了使8N退化侧翼序列的分布归一化 ，使用特定于库主链的引物和随后的18个周期PCR添加Illumina I5适配器，用12周期PCR进行库质粒进行扩增 。在2％琼脂糖E-醇（Invitrogen）上分离放大的文库 ，并在Miseq Sequencer（Illumina）上进行测序 。通过提取六个核苷酸TAM区域分析所得序列数据 ， 计算单个TAM并将TAM标准化为每个样品的总读数。使用选定的TAM在最高得分分数中使用我们上一个Report4中使用的自定义Python脚本生成序列图案4 。
有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然研究报告摘要中获得 。
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本文概览： 对编码全长DTISRB的基因（残基1-353）进行了优化，合成（Twist Bioscience）并将其克隆到修饰的PC013矢量（addgene质粒编号90097）中。D...
文章不错《与ωRNA和靶DNA复合物的欧米茄nickase ISRB的结构》内容很有帮助