在5 ml猎鹰管中，在3 mL BHI培养基中接种粘膜菌BAA-835 ，并在37°C下在厌氧条件下孵育4天。然后 ，将3 ml培养物用于从猪胃（Sigma-aldrich）中接种1 L的BHI培养基，在1 L Pyrex储物瓶中（Sigma-Aldrich） ，在37°°C下在Anaerobic条件下孵育12天。静态生长12天后 ，将细菌培养物离心以分离细胞颗粒和上清液（8,000 r.p.m. 30分钟） 。在室温下搅拌24小时，用氯仿和甲醇（1：1）提取细胞颗粒 。将溶剂混合物通过Whatman定性滤纸（3级 ，圆 ，直径为125 mm）过滤，并在真空下干燥。
为了提取上清液 ，将100 g的疏水树脂混合物（琥珀酸盐XAD4HP和XAD7HP ，20-60网格）直接添加到用过的培养基中，以允许分泌的代谢物进入树脂上 。然后 ，将含有细菌代谢物的树脂混合物用丙酮和甲醇洗涤（1：1） ，并在室温下搅拌24小时 。将带有树脂混合物的溶剂混合物通过Whatman定性滤纸（3级，圆，直径为125 mm）过滤 ，并集中在旋转蒸发器上。重复培养和提取程序八次（总培养物量为128 l） ，从细胞颗粒中产生4 g的干提取物和上清液中的15 g粗提取物 。
使用七个不同的溶剂系统（A，100％己烷； B ，100％氯仿； C ，100％乙酸乙酸乙酯； D，75％乙酸乙酸乙酯/25％甲醇； E ，90％乙酸甲醇/50％50％/50％50％/10％甲基甲醇； F ，将细胞颗粒中的粗提取物（4 g）溶于氯仿（4 g），并通过正常阶段色谱分离并通过正常色谱分离 。二氯甲烷;The pro-inflammatory activity was highly detected in fractions F and G. The mixture of fractions F and G (120 mg and 210 mg, respectively, and 8.3% of total yield) was then subjected to reversed-phase semi-preparative high-performance liquid chromatography (HPLC) (Luna C8 (2), 250 × 10 mm, 5 µm) using the following gradient solvent system: 10%甲醇/90％的水等离子持续10分钟；梯度为30％甲醇/70％的水10分钟；然后30％甲醇/70％的水至90％甲醇/10％水 ，持续20分钟 ，90％甲醇等值持续10分钟，梯度至100％甲醇 ，持续25分钟；流速 ，2 mL min -1）。每1分钟在5分钟至75分钟之间每1分钟收集分数，产生70个分数 。将能够刺激从MBMDC刺激促炎性细胞因子产生的分数合并并用BCFAS鉴定为细菌PE（22 mg，产量= 0.55％） 。在63分钟的保留时间（14毫克 ，产率= 0.35％）的保留时间获得了一种本质上的纯化合物 ，后来被识别为A15：0-I15：0 PE。
将上清液中的粗提取物（15 g）溶解在甲醇中，并通过注射器过滤器（Polytetrafluoroethyene（PTFE） ，0.2 µm）过滤 。The filtered extract was directly injected onto a reversed-phase preparative HPLC column (Luna C18 (2), 250 × 21.2 mm, 5 µm) with a gradient mobile solution (30% methanol/70% water to 100% methanol for 30 min, 100% methanol isocratic for 30 min; flow rate, 10 ml min−1).每2分钟从5分钟到55分钟收集分数 ，产生25个分数 。能够在50分钟（23.5 mg，0.16％）收集能够刺激MBMDC促炎性细胞因子产生的馏分 ，并如上所述进一步纯化 ，从而增加A15：0-I15：0（1.2 mg，1.2 mg ，收益率= 0.008％）。总体而言 ，从19.0 g的粗提取物（0.08％）中分离出15.2 mg的A15：0-I15：0。
通过对1H，13C和二维（2D）NMR光谱数据的综合分析来识别A15：0-I15：0 PE的结构（扩展数据表1） 。
在30°C下以500 MHz获取所有1H NMR光谱 ，并以δ（beta）等级表示化学位移 。NMR溶剂（CDCL3 ，δ7.26）中的残留蛋白质用于参考化学位移。数据表示如下：分配，化学移位，整合 ，多样性（S ，Singlet; d，Doublet; T ，Triplet; Q ，Q，Quartet; M ，Multiplet; Br ，Broad）和Hertz中的耦合常数 。在30°C下以125 MHz的形式获得了所有13C NMR光谱，并以δ尺度表示化学位移 。NMR溶剂的碳共振（CDCL3 ，δ77.17）用于参考化学位移。根据以下2D NMR光谱实验完成质子和碳的全部分配：梯度1H – 1H相关光谱 ，梯度1H – 13C异核单量子相干性，梯度1H – 13C渐变1H – 13C异核多核多重键连接性 。Mnova V.14.2.0用于分析天然和合成化合物的NMR数据 。
使用Agilent MassHunter工作站LC/MS数据采集10.1和配备有1290 UHPLC系统的Agilent LC-QTOF质谱仪6530收集高分辨率质谱数据 ，并从M/z 50到3,200。然后将A15：0-I15：0 PE的5μl等分试样及其家人及其家庭成员被注入反向相分析柱（Luna C8：100×2.1 mm ，5μm，5μm），使用0.1％甲酸的梯度溶剂溶液系统（然后是10％甲醇/水至10％甲醇） ，以10％的水为10％ ，甲醇/甲基水平为10％，甲醇含量为10％ ，甲醇含量为90％ ，甲醇含量为90％，甲醇 ，90％的水10分钟；流速为0.3 mL） 。Agilent Masshunter定性分析B.07.00软件用于分析数据 。
将A15：0-I15：0的0.1 mg样品溶解在200μl甲醇中 ，并添加1.4 mg甲氧基钠，以制备0.5 mol L-1甲氧化物氧化钠溶液。将反应混合物在室温下搅拌3小时 ，然后加入1N HCl 。将甲烷解析产物在真空下干燥 ，并用乙酸乙酯和水（300μL，V/V = 2：1）提取 。除去水层 ，并将含有FA甲基酯（FAME）的每个乙酸乙酸乙酯层注入气体色谱仪（GC ，Agilent Masshunter GC/MS采集B.07.05.2479）与HP-5 MS Ultra惰性柱（0.25 mm×30 m）组合。注射器的温度和GC中的检测器保持在150°C。在分析过程中，控制GC柱的温度（150°C 3分钟，在6°C min -1和250°C下150–250°C ，持续3分钟） 。A15：0-I15：0 PE的名声衍生物分别由I15：0和A15：0（1：1）组成 ，分别在10.2分钟和9.7分钟时保留时间 。AMPE的名声衍生物的气相色谱 - 质谱法（GC – MS）显示I14：0（15.7％），N14：0（2.7％） ，A15：0（51.7％） ，I15：0（I15：0（23.6％），A16：0（0.6％） ，A16：0（0.6％） ，I16：0（I16：1.8％），1.8％（1.8％） ，1.8％和1.8％（1.8％）（2.2％） ，保留时间分别为8.0、8.6、9.7 、10.2 、11.3、11.9 、13.4和15.0分钟（图1D）。Agilent Masshunter定性分析B.07.00软件用于分析GC -MS数据 。
制备了A15：0-I15：0 PE的5 mg样品，并冻干24小时 。制备了1 mg ml -1的Naome溶液 ，并将混合物溶解在室温下的500μlNAOME溶液中。将溶液在氩气下搅拌30分钟 。30分钟后 ，通过添加1N HCL淬灭反应并在真空下干燥 。O-二甲基化的产品A15：0 PE通过相反的相HPLC（Luna C8（2）：250×10 mm，5μm）纯化，带有同位溶剂系统（45％乙腈/30分钟内45％的水 ，Ultraviolet 210 NM检测 ，流量210 NM检测，流量 ，流率2 ml min-1）。在12.5分钟内洗脱了O-二甲基化的产物（1.8 mg） ，其结构由一维和/或2D NMR光谱法（扩展数据表2）和低分辨率电喷雾电离质谱法（ESI-MS）（ESI-MS）（[M+ H]+ M/z处于440; Motecular Formular cyscyso，C20H434） 。
A volume of 5 ml of A. muciniphila BAA-835 grown in BHI was inoculated into three 1 l bottles of M9 medium supplemented with 1.5 g of mucin from porcine stomach (Sigma-Aldric) and either 1 mmol l−1 of -leucine, -isoleucine or -leucine/-isoleucine mixture (1:1 ratio) or nothing as a control.这些培养物在37°C的厌氧条件下生长12天 。将这些培养基的细胞颗粒离心 ，并用40 mL氯仿和甲醇提取（1：1）。将提取物在真空下干燥 ，并以10 mg ML -1浓度溶于二甲基磺氧化二甲基硫氧化氢，并在MBMDC细胞因子测定中测试活性 。使用未配对的两尾学生的t检验确定统计意义 。
A15：0-I15：0 PE生物合成途径的序列比较和分析 ，通往亮氨酸 ，异亮氨酸，瓣膜的BCFA生物合成途径和DE从头生物合成途径 ，使用BLASTP进行BLASTP（NCBI REFSEQASE和GENES ENSED ，KYORE），Kyopiious and kyopiious，Kyopopiious and kycyoto ，v.11.1.4对于先前报道的成对序列比对。此分析中使用的基因的登录号为CP001071.1。
A15：0-I15：0 PE ，I15：0-A15：0 PE，A15：0-A15：0 PE ，I15：0-I15：0 PE和N15：0-N15：0 PE的总合成的总合成 。
小鼠实验程序均符合所有相关的道德法规 ，并根据Massachusetts综合医院的机构动物护理和使用委员会批准的协议2003N000158进行 。根据经典TLR配体刺激的髓样细胞中细胞因子测量的效果大小和方差估算适当的样本量。在所有小鼠实验中，将动物分配给基于基因型和/或年龄和性别匹配的实验组 。雄性或女性野生型TLR2 - / - 或TLR4 - / - C57BL/6小鼠至少使用了3–4周 ，最好使用7-12周龄 。在环境温度在18°C和24°C之间的环境温度下 ，将小鼠的光或黑暗周期饲养，相对湿度在30％至70％之间。
从马萨诸塞州总医院的血液捐献者中心收集的Buffy大衣中分离出人类单核细胞 ，并符合所有相关的伦理法规 ，并根据《 2018P001504协议》获得了大规模普通北方机构审查委员会的批准 。捐助者提供了知情的书面同意 。
这些测定如前所述8。简而言之，从男性或女性野生型 ，TLR2 - / - 或TLR4 - / - C57BL/6小鼠收集股骨和胫骨 ，至少为3-4周，年龄至少为7-12周 。The bone marrow was pushed from the bones using a needle and syringe of complete Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) supplemented with Gibco GlutaMAX Supplement (35050061), Gibco penicillin-streptomycin (15140122) and 10% heat-inactivated foetal bovine serum (FBS), and strained through a 70 µm nylon filter.然后将收集的骨髓离心，并使用Invitrogen Ebioscience 1X RBC裂解缓冲液（00-4333-57）裂解红细胞 。然后再次将细胞离心并通过70 µm尼龙过滤器进行拧紧 ，并重悬于完整的DMEM中。对细胞进行计数 ，然后用大约20-40 ng ml-1重组鼠（RM）GM-CSF（预易the 315-03），每板约500万个细胞镀以约500万个细胞 。他们被允许在第3天增加7天 ，有时会增加20-40 ng ml-1 rmgm-csf 。然后将所得的MBMDC刮擦并再次计数。它们被镀在96孔组织培养物处理的微板（Corning CLS3599）中 ，从每个孔的50,000–90,000个细胞中，并允许粘附至少3小时。然后以色谱级分或纯化化合物的最终浓度为50 µg mL-1 ，最终浓度的LPS（Invivogen TLRL-B5LPS）为3-625 ng mL-1或最终浓度的PAM3CSK4（Invivogen TLR-PMS） ，以0.250 – 1.250 – 1.562 µgMM MM浓度来处理细胞处理细胞 。第二天早晨，除去上清液 ，并根据制造商的指令使用Invitrogen小鼠ELISA试剂盒（88-7324-77）进行酶联免疫吸附测定（ELISA）以测量TNFα 。Gen5 V.3.03或SoftMax Pro V.6.2.1（Spectramax ，Molecular Devices）用于分析ELISA平板。用于使用流式细胞术的细胞因子检测， 我们根据制造商的说明使用了BD Biosciences（552364）的细胞量珠阵列炎症试剂盒（552364） 。使用NovoExpress v.1.4.1收集数据 ，并使用FlowJo v.10.7分析了数据 。
使用Rosettesephuman单核细胞富集鸡尾酒（Stemcell Technologies ，CatalogNo。15028），将外周血单核细胞（PBMC）富含单核细胞富含 。简而言之，在摇摆时 ，在室温下将Buffy Coats与单核细胞富集鸡尾酒一起孵育20分钟 。然后将它们用1倍磷酸盐缓冲盐水（PBS）稀释 ，并在Ficoll-Paque Plus培养基（GE Healthcare，CatalogNo。17-1440-02）上层层 ，并在1,200G处离心20分钟 。在含有10％FBS和1％青霉素 - 链霉素的DMEM培养基中 ，收集富集的单核细胞并用色谱级分或纯化化合物培养 。最终浓度为100 ng ml -1的LPS和PAM3CSK4用作对照。过夜孵化后，使用人挠性套件（BD CBA ，Catalog nos 。558276 ，558274，558274 ，558274 ，560154，560154和560112）收集和分析IL-6 ，IL-10 ，IL-10，IL-10/IL-23P40和TNFα细胞因子的上清液 。
如前所述41，从PBMC中分离单核细胞。使用SmartSeq2制备了批量RNA测序库。库是在NextSeq（Illumina）上测序的 。FastQC V.0.11.5和MultiQC V.1.8用于确认测序库的质量42,43 。接下来 ，使用GRCH38参考使用Kallisto V.0.46.1来生成映射到每个基因44,45的读数。计数的矩阵用于计算每百万（CPM）值的计数 ，并使用Log2（CPM+1）处理生成的CPM矩阵以获得log表达矩阵 。CPM值大于1的基因被认为是表达的 。然后使用上述步骤后获得的样品通过EDGER v.3.35.1（参考文献44）检测差异表达的基因。鉴定基因的列表是根据生成线性模型框架从似然比测试生成的，该框架遵循软件的先决基因过滤 ，归一化和分散估计步骤 。
遵循制造商的规程 ，使用隔离管（Stemcell Technologies）和氯化铵 - 氯化铵裂解缓冲液从Buffy Coats中分离PBMC 。根据制造商的协议，使用Rosettesep人类单核细胞富含鸡尾酒（Stemcell Technologies）从PBMC中从PBMC中收获人类单核细胞。从IDT购买Alt-R SGRNA ，并用无核酸酶的双链缓冲液（IDT）重构为100 µmol L-1 。在无菌聚合酶链反应条中 ，将SGRNA与Cas9（IDT，Alt-R S.P. Cas9核酸酶V3）混合 ，摩尔比为2：1（2 µl SGRNA在100 µmol L-1 + 2 µl Cas9下在5 mg ml-1下在5 mg ml-1下） ，在室温下以20分钟的温度孵育 。用5 ml PBS洗涤单核细胞两次并计数。然后将每个反应的2×106细胞重悬于16 µL的P3主要核反登溶液（LONZA）中 。将P3缓冲液中的16 µL细胞添加到每个CAS9- ri核蛋白复合物中 。然后将细胞 - 核糖核蛋白混合物立即加载到提供的核对象盒带（LONZA）中，并使用与CM-137程序的4D-核对象进行了核法。然后 ，立即将180 µL预热的培养基添加到每个盒式中。A volume of 1 × 105 cells was seeded into a 96-well plate with medium (RPMI-1640 with 10% FBS, 2 mmol l−1 Glutamax, 55 µmol l−1 beta-mercaptoethanol, 100 U ml−1 penicillin, 100 µg ml−1 streptomycin, GM-CSF 800 U ml−1 and IL-4 500 U ml−1).培养基每2-3天更换一次 。在第5天 ，用10 µg ml-1的Akkermansia脂质，100 ng ml-1的PAM3CSK4，100 ng ml-1的FSL-1或100 ng ml-1的LPS刺激MDDC ，持续18 h或如图所示 。根据制造商的方案 ，通过ELISA（Invitrogen）收集了细胞上清液进行人类TNFα测量。SoftMax Pro V.6.2.1（Spectramax，分子设备）用于分析ELISA板 。所使用的SGRNA序列如下：
人类TLR1：GGTCTTAGGAGAGACTTATG
人类TLR2：GACCGCAATGGTATCTCCAA
人类TLR6：attcatttccgtcggagaac
A15：0-I15：0 PE配体配合物的建模基于蛋白质数据库（PDB ID 2Z7X）28的TLR2-TLR1-TLR1-PAM3CSK4复合物的晶体结构 。从晶体结构坐标中除去PAM3CSK4配体 ，并在COOT v.0.9中使用Lidia和AcedRG制备A15：0-I15：0 PE配体（参考文献46,47）。A15：0-I15：0 PE配体在TLR2和TLR1的配体结合口袋中的位置由晶体结构中PAM3CSK4配体的酰基链的电子密度引导 。使用Chimerax V.1.0（参考文献48）生成结构图和视频 。结构生物学软件由SBGRID财团编译和配置。49 。
有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然研究报告摘要中获得 。
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本文概览： 在5 ml猎鹰管中，在3 mL BHI培养基中接种粘膜菌BAA-835，并在37°C下在厌氧条件下孵育4天。然后，将3 ml培养物用于从猪胃（Sigma-aldrich）中...
文章不错《akkermansia粘液磷脂诱导稳态免疫反应》内容很有帮助