来自致命COVID-19的个体的所有组织标本（通过逆转录聚合酶链反应（RT – PCR）证实了SARS-COV-2感染）并在IRB批准的IRB批准的方案（AAAB2667，AAAT0785 ，AAASASASASASASASASASSAS7370）的纽约长老会医院或哥伦比亚大学医学中心收集了对照组 。从患者或他们的近亲获得了适当的同意。对患者样品进行的所有程序均符合IRB和Helsinki声明的道德标准及其后来的修正案
。根据对相应的山马久毒素和曙红（H＆E）染色的FFPE组织载玻片的病理综述选择样品，显示出供体的供体的病理学参与
，尸体后切口时间小于10小时。捐助者年龄为59至89岁以上 。将〜1 cm3的组织样品嵌入在组织技术最佳切割温度（OCT）化合物（Sakura Finetek USA Inc.，Torrance ，CA）中
，并存储在-80°C直至加工
。对于本研究中包括的所有死者，去除受影响的肺组织 ，此外
，对于一部分个体，收集了肾脏和心脏的匹配组织32。从没有COVID-19的患者中收集了七个对照肺样本 。在此进行了分析和介绍的数据集 ，重点介绍了19名死于COVID-19的人（在20个实验中进行了剖析）和7个对照（非covid-19）个体的肺标本
。 　　所有样品均在配备符合哥伦比亚大学安全措施的生物安全柜中处理
，该安全措施与Covid-19标本合作。如先前所述处理样品17，并具有以下规格和修改 。对于组织解离 ，我们与盐和Tris（TST）缓冲液一起使用了补间
。对于所有洗涤步骤
，我们使用了盐和Tris（ST）缓冲液，所有缓冲液均补充了40 U/ml RNase抑制剂（Thermo Fisher Scientific ，MA）。所有缓冲液都预先冷冻在冰上，并在整个过程中将样品保存在冰上
，以进一步防止RNA降解 。简而言之，将一小部分的OCT插入式快速冻结的组织分解在大量冰冷的磷酸盐缓冲盐水（PBS）中 ，并将其放入预冷的50毫升管（纽约州康宁）中
，并倒入OCT完全溶解
。然后通过在4°C下以300克离心2分钟来收集组织。将PBS倒倒，并将组织重悬于2 ml冷的TST缓冲液中 ，并使用孔口尺寸降低的细剪子和移液器机械解离
，并在冰上孵育5-10分钟 。将TST用8 mL ST缓冲液淬灭，并通过70μm的细胞过滤器过滤悬浮液。通过在4°C下以500克离心5分钟 ，将组织/核悬浮液固定
。将上清液倒入
，并将细胞核重悬于200-1,000μLST缓冲液中，并通过连接到荧光激活的细胞排序（FACS）管（Corning ，NY）的40μm细胞过滤器过滤
，并立即对单核RNA序列进行处理。 　　使用不参与组织加工的第二个研究人员在Leica DMI 1显微镜上使用一次性计数室（Bulldog Bio，NH）对单核悬浮液进行计数 。A total of 15,000–20,000 nuclei were loaded per channel on a Chromium controller using Chromium Next GEM Single Cell 3ʹ v3.1 reagents (10X Genomics, Pleasanton, CA) placed inside the bio-safety cabinet, and single-nucleus RNA-seq libraries were prepared per the manufacturer’s instructions (increasing the recommended initial cDNA amplification cycles by one to account for lower amounts of RNA from nuclei compared to全细胞）
。使用TapSestation D1000筛选磁带（Agilent ，Santa Clara，CA）和Qubit HS DNA定量试剂盒（Thermo Fisher Scientific）分析并对单核RNA库进行分析和定量。将库汇总等式合并
，并使用定量PCR进行定量 。使用成对的末端，单个索引测序与28个循环进行读取1 、8个周期的i7指数和91个循环 ，对库进行了库6000库（Illumina
，San Diego，CA Illumina ，CA Illumina
，CA）的测序，对2进行了测序
。 　　使用Cell Ranger（v5.0）“ MKFASTQ”将RAW 3'SNRNA-SEQ数据删除 ，然后是“计数 ”以对齐测序读取并生成计数矩阵。将转录物与人类GRCH38参考基因组对齐
，该基因组与整个SARS-COV-2基因组（严重的急性呼吸综合症冠状病毒2孤立的Wuhan-Hu-1，完整的基因组 ，GenBank MN908947.3）作为人类参考基因组的附加染色体 。随后
，使用“ CellRanger_Mkref”索引自定义的“ GRCH38_SARSCOV2
”参考基因组
。 　　我们使用了Cellbender（V.0.2.0）的“删除背景”功能来删除从基因表达矩阵中的技术环境RNA计数和空液滴34。Cell Ranger生成的“ RAW_FEATURE_BC_MATRIX.H5 ”文件用作Cellbender的输入 。参数“预期细胞
”是从单元格兰特度量的“估计的单元格数”中获得的，而包括18,000至24,000的参数“总数 ”的参数为18,000至24,000 ，代表所有样品中条形码等级图中的一个点
。 　　使用seurat（v.3.2.3）35在R（v.4.0.2）中单独处理所得的表达矩阵。将过滤器应用于将核保持200-7,500基因，400-40,000个唯一分子标识符（UMIS）和小于10％的线粒体读数 。此外
，根据加载速率，SCRUBLET被应用于识别和删除预期双重速率4％至9.6％的双重速率。滤波后含有少于1,000个核的样品被排除在进一步的分析之外
。使用“ logNormize
”将过滤的基因– Barscode矩阵通过“归一化”函数进行标准化 ，并使用“ Findvariable Features ”中的“ VST
”方法鉴定了前2,000个可变基因。使用“鳞片”函数将基因表达矩阵缩放并居中 。接下来
，我们使用前30个主要组件进行了主成分分析（PCA）以及UMAP
。在整合之前检查了单个样品的UMAP。 　　使用相互PCA（RPCA）管道将单个样品集成在Seurat中，以删除大数据集中的批处理效应 。应用了“ SelectIntegrationFeatures ”功能来选择按照它们被检测到的数据集排名的功能
。接下来 ，使用RPCA的前50个维度在不同样本之间选择了一组锚点
，以指定邻居搜索空间。指定了六个样本作为参考，包括三个对照（C51CTR ，C52CTR
，C53CTR）和三个COVID-19（L01COV，L12COV ，L16COV）样本 。然后应用“ IntegratedAta
”使用预计的锚来集成数据集
，并使用“ Scaledata”缩放集成数据集
。根据前30个主组件进行了PCA和UMAP尺寸降低。计算了使用PCA还原的前30个维度的最接近的纽布图，并以0.8的分辨率应用聚类 。Harmony37使用带有患者ID作为批次键和10个迭代的默认参数在上面的PCA矩阵上运行
。 　　主要细胞类型是通过簇之间的差分基因表达（DGE）的手动注释来鉴定的。“ Findallmarkers ”功能确定了每个群集的正标 ，最小分数为25％，对数转换的折叠变化阈值为0.25 。该初始标记导致鉴定上皮
，内皮，成纤维细胞 ，神经元
，髓样，APC ，桅杆
，T/NK和B/浆细胞群以及一个低质量簇，我们已将其删除。接下来 ，我们将Seurat对象分为主标签和RERAN缩放
，PCA，UMAP尺寸降低 ，聚类和DGE分析的子集
。通过手动或使用来自各个细胞地图的细胞类型的单细胞特异性单细胞签名
，将所得的簇注释，并将标签添加到主要对象中。此外 ，使用“细胞测定”功能在子集中对细胞周期阶段进行了对单个截止的调整并添加到主对象中的子集中 。在髓样亚群中，观察并去除了两个低质量簇（以线粒体读数的表达更高的特征）
，总共有116,314个细胞进行下游分析（QC之后119,535个初始细胞）
。从Travaglini等人获得的，标志和规范标记（补充表4）以鉴定基部 ，俱乐部
，纤毛，杯状 ，粘液
，粘液，粘液 ，AT1和AT2细胞的标记。使用基于从Travaglini等人获得的DGE进行签名对肺泡巨噬细胞进行评分
，并确定为AMS39，模块得分> 0.15 。从Deprez等人40获得了簇细胞的特征
。为了进一步表征成纤维细胞群体 ，使用Seurat的“子集
”功能选择了成纤维细胞
，并重新分析以识别不同的成纤维细胞亚型。重新分析包括“ Runpca”，“ Findneighbours ” ，“ Findclusters
”和“ Runumap”的标准Seurat工作流程 。所使用的PCA尺寸的数量为15， 分辨率参数为0.5
。在获得成纤维细胞簇后
，每个群集中的DGE都用“ RNA ”测定法上的“ Findallmarkers
”计算（补充表9）。通过用报道的文献手动策划簇DGE来鉴定成纤维细胞亚型，例如单细胞肺Atlas38 ，肺成纤维细胞ATLAS3
，单细胞数据库Panglaodb41和人类蛋白ATLAS42,42,43,44 。但是，这些资源基于SCRNA-SEQ或批量研究
。因此 ，少数报道的成纤维细胞亚型标记通常不是特异性的或在SNRNA-SEQ数据中表达较低。因此
，我们比较了我们的亚集群DGE与文献报道的亚型DGE，并在SNRNA-SEQ或SCRNA-SEQ数据中具有高表达 。这些手动策划的成纤维细胞特异性标记基因的列表用于鉴定数据集中的成纤维细胞亚型（补充表4）。该过程用于识别肺泡成纤维细胞 ，外膜成纤维细胞
，周细胞，气道平滑肌 ，血管平滑肌和间皮成纤维细胞
。具有高表达COL1A1和CTHRC1的细胞簇被注释为“病理成纤维细胞”
，因为据报道它们有助于纤维化的前缘3。与病理成纤维细胞相比，COL1A1和CTHRC1表达较低的簇 ，但在其DGE中没有任何其他成纤维细胞亚型的标记，被注释为“中间病理性成纤维细胞 ” 。一个没有明显DGE的细胞簇被注释为“其他成纤维细胞
”
。出于可视化目的
，将表达得分绘制在UMAP嵌入或小提琴图中，作为对数正态值（自然对数LN（1+X）） ，在DOT图中作为对数差异值（自然对数LN（1+X））的点图
，其依次以1（量表）为中心。 　　除非另有说明，否则我们计算了COVID-19和对照肺中每个样本中细胞类型的频率 ，并比较了两组的中值以识别频率的差异 。使用Wilcoxon级别测试评估了显着性
。 　　应用“ addModulesCore”功能来计算单细胞水平上基因特征的平均表达水平。从Choi等人获得基于小鼠的特征
，以鉴定Datps和Primed和Cycling AT2细胞，并转化为人类同源基因 。三个基因（CLDN4 ，KRT8
，CDKN1A）包括因此得出的初始DATP签名
。AT1和AT2细胞从主要的seurat对象子集中，并使用具有30个维度的Seurat标准积分重新整合 ，并且在“ Find Integrationance ”功能中具有60个k-Neighbours滤波器。首先
，将所有AT1和AT2细胞评分为三基因签名，模块得分> 0.7的细胞被初步标记为Datps 。接下来 ，我们使用DGE识别定义DATP程序的其他标记
。然后，我们将所得的DATP签名（包括163个基因）评分为AT1和AT2单元
，并将模块得分> 0.4的所有细胞标记为Datps。通过使用具有50箱基因组评分的Seurat实现，获得T细胞得分 ，并且对照尺寸等于集合中的基因数量 。上调和下调程序（TRM
，TACT，TMEM TEXH） ，由K. S. P. Devi等定义。（未发表）用于推断T细胞表型
。分别评分上调和下调标志
，并从上调评分中减去细胞的下调评分，以获得复合分数。使用Cohen的D计算效应大小（即 ，平均值差除以汇总的标准偏差） 。 　　我们将扩散图作为非线性维度降低技术应用
，以检查细胞子集的变异的主要组成部分
。我们使用命运R包装（v3.3.0）的“扩散映射
”函数计算了DC，该功能具有K-Neartimest邻居算法（K-NN）45中使用的前30个主组件。由气道基底 ，俱乐部和杯状细胞组成的上皮子集使用具有30个维度的Seurat标准积分重新整合到DC分析
，并在“ FindInTegrationChance”功能中使用30个维度和50个k-Neighbours滤波器 。带有样本 <50 cells were excluded from reintegration, which removed a total of 10 samples (one control sample and nine COVID-19 samples). Tuft-like cells were identified as cells with DC1 values >0.015基于与第一个DC的扩散轨迹中与簇细胞特征的重叠
。 　　通过在归一化计数数据上使用seurat函数“ Findallmarkers ”来识别DGE，以识别每个人群中的阳性（表达）标记。Wilcoxon Rank-SUM检验（双面）用于识别两组细胞之间差异表达的基因 ，并将对数转换的倍数变化设置为0.25 。将参数“ min.pct”设置为0.25，以确保在任何一个人群中以25％的细胞分数检测到基因
。除非另有说明
，否则使用Bonferroni校正调整P值。使用对数差异表达值（天然对数LN（1+X））将差异表达的基因绘制在小提琴图中 。对于热图和点图，表达值被对数均衡（天然对数LN（1+X）） ，然后以1（缩放）为中心以0为中心
。 　　为了测试三个免疫途径特征的差异表达（I型干扰素缩写
，炎症体受体和趋化性，补充表4） ，我们在签名中获得了每个基因的对数非正式表达值（LN（1+X））
，并将其汇总为每个签名。然后，我们使用双面Wilcoxon级别测试来测试每种单元格中签名的差异表达 ，并计算出Log2（折叠更改） 。 　　使用Hyper R-Package46进行了基因组富集分析。将基因的背景群设置为所有检测到的基因
。通过高几何测试确定基因的过度占代表性。 　　为了分析B细胞中重链和光链的分布
，数据集的子集仅包括B细胞 。为了鉴定可变链区域，我们选择了每个细胞的最高表达的重链基因 ，这些基因既表达重量（从IGHV开始）和光（以IGLV或IGKV开头）链编码基因
。接下来
，我们确定了按照“ igh [g，m ，a或e] [number]的模式）中表达基因中最高表达的恒定链区域。使用平均链接以层次聚类分析，将所得的沉重和轻链对可视化为热图
，并与先前描述的经常观察到的组合进行了交叉引用47 。 　　这项研究中的成纤维细胞调节网络使用ARACNE-AP48,49算法对SNRNA-Seq数据进行了反向工程
。我们为每个子集群生成了网络，并通过结合了所有网络的预测来集成了网络。使用Fisher的方法集成了网络预测的主调节器（MR） - 标准相互作用的P值 。最终的成纤维细胞网络包含对通过295,546个相互作用调节9,770个目标基因的1,341个转录因子的预测
。使用viper50,51算法推断出在成纤维细胞网络中表示的每个转录因子的相对活性 ，该算法可通过生物导体作为包装可用。从概念上讲
，毒蛇算法与主调节推理算法（Marina）49,52相似，该算法使用ARACNE48,49算法推断的MR靶标预测细胞表型变化的驱动因素 。除了计算有关感兴趣签名的Aracne预测靶标的富集外 ，Viper还考虑了调节器的作用方式
，调节剂 - 目标基因相互作用置信度以及每个靶基因调节的多效性质
。统计显着性，包括P值和归一化富集评分（NES） ，是通过与通过随机统一的1000次统一将样品置换的无效模型来估计的。具有毒素预测的50,51,53异常增加的可药蛋白通过其-LOG10进行排名（Bonferroni调整后的P值） 。 　　CellphonedB54是配体 - 受体相互作用的策划存储库以及它们的亚基体系结构
，集成在统计框架中，以推断单细胞或单核转录组学数据中细胞类型之间的细胞类型的配体 - 受体 - 受体相互作用。我们使用CellPhonedB识别每个单个对照中的细胞类型（n = 7）和COVID-19（n = 19）SNRNA-SEQ数据集中的细胞类型之间的配体 - 受体相互作用
。在每个患者中分别推断出配体 - 受体相互作用 ，因为根据定义
，细胞对细胞相互作用在生物学上仅在个体内才有意义。此外，单独的推论还可以防止虚假的相互作用在异质疾病或健康状况的患者之间推断出来 。在我们的SNRNA-Seq数据集中识别和注释不同的单元格类型后 ，我们遵循推荐的过程，以准备输入文件以本地实现CellphonedB v.2.0.054
。简而言之
，对于每个样本，将QC滤波的原始计数矩阵标准化为每10,000个计数 ，并从相应的细胞类型注释中获得元数据文件。使用默认参数的“ CellPhonedB方法统计_analysis
”命令进行CellPhonEDB分析 。 　　对每个样品的细胞传导分析鉴定了该样品中所有9个主要细胞类型之间的配体 - 受体相互作用的数量
。我们分析了对照供体（n = 7）和Covid-19（19个个体
，20个样本）之间的这些细胞 - 细胞相互作用计数，以识别Covid-19和对照肺之间细胞串扰的差异。来自所有对照样品的中位细胞 - 细胞相互作用值构成了整体对照肺细胞 - 细胞相互作用计数 。类似地 ，总体covid-19-19肺细胞 - 细胞相互作用计数是所有COVID-19样本的中位数
。使用带有圆形布局的“ Igraph” R封装将整体控制和COVID-19肺相互作用计数可视化为一种相互作用
，其中两种细胞类型之间的边缘宽度与它们之间的相互作用数量和细胞类型圆的大小成正比与SNRNA-SERNNA-Seq中的频率成正比。 　　对每个样品的细胞传导分析，通过计算每个配体 - 受体 - 受体相互作用的配体和受体基因表达的平均值 ，并以相应的p值计算该样品中的配体 - 受体 - 受体相互作用 。为了找到在共同条件和控制条件之间差异调节的配体 - 受体相互作用
，我们首先确定了所有样品之间的共同相互作用
。简而言之，我们通过从7个对照样品或20个Covid-19样品（来自19个捐助者）中的配体 - 受体表达式中位数（来自19个捐助者） ，分别合并了配体 - 受体表达进行对照和COVID-19。在Covid-19和对照样品中合并配体 - 受体表达的最小值设置为0.001
，以防止低表达值中的噪声影响对数（折叠变化）计算 。从log2（covid-19中值表达）中减去log2（对照中值表达），以获得covid-19中配体 - 受体表达的log2（折叠变化）。为了计算每种相互作用的log2（折叠变化）的p值 ，我们为COVID-19和对照样本之间的每种相互作用使用了未配对的双面Wilcoxon Rank-sum测试
。使用Ebenjamini – Hochberg程序获得了调整后的P值。与log2（折叠更改）≥| 2 |的相互作用据报道，FDR P <0.1是Covid-19中的最大差异相互作用 。 　　肺组织（人和小鼠）用4°C的4％多聚甲醛（PFA）固定在旋转中过夜
。对于石蜡切片
，将组织通过70-100％乙醇梯度脱水，然后嵌入石蜡中。对于冷冻切片 ，将组织与20％和30％的蔗糖顺序孵育
，然后嵌入OCT化合物中 。我们使用低温恒温器获得了8–10-μm厚的冷冻切片
。 　　石蜡切片被脱水并补充水化。通过使用商业抗原透明溶液进行高压加热进行抗原检索，然后用5％正常的驴血清阻断 。对于免疫荧光染色 ，然后将切片与4°C的补充表12中列出的原代抗体一起孵育过夜
。用PBS洗涤冷冻切割
，并用5％正常的驴血清封闭，然后与补充表12中在4°C中显示的原代抗体孵育过夜。将共轭的二抗（1：500）添加到该切片中 ，并在室温下孵育2小时 。用DAPI染色细胞核
，并用Zeiss LSM T-PMT共聚焦激光扫描显微镜（Carl Zeiss）和Zen 2012 SP1（黑色版本）软件（Zeiss）捕获图像
。在Leica Bond 3自动染色平台上对C4D进行免疫组织化学。简而言之，将包括健康对照肺和COVID-19肺组织在内的石蜡切片用键表位置检索溶液2（Leica）处理20分钟 ，并将其与C4D抗体孵育30分钟 。用骨聚合物精炼检测试剂盒（Leica）与原代聚合物处理20分钟
，并用DAB成色DAB成色10分钟，开发了免疫组织化学信号。为了进行定量 ，使用盲目的研究员使用瓷砖缝合的20×图像对细胞进行计数，每只小鼠五个部分
，至少包括三个单独的裂片，或者来自至少三个人类对照肺和covid-19肺的代表区域
。使用Zen Blue 2.3（Zeiss）和Adobe Photoshop Creative Suite 6（Adobe）对图像进行处理和分析 以盲目的方式进行软件。用于Pro-SPC和KRT8或HTII-280和CLDN4的共免疫染色检测到DATP 。DatP百分比是通过对Pro-SPC+细胞或HTII-280+细胞上的Pro-SPC+细胞或CLDN4+细胞上的KTR8HI Pro-SPC+细胞来确定的
。通过计算CD45+ CD64+细胞的总数来量化巨噬细胞。通过计算DAPI+气道核（对于气道簇细胞）或每MM2肺实质的聊天+细胞的总数来量化聊天+簇细胞 。 　　使用CD4 ，CD8
，CD19，CD103 ，CD163和GRANZYME B（GZMB）抗体（补充表12）使用CD4
，CD8，CD19 ，CD103
，CD163和GRANZYME B（补充表12），使用Opal 7色IHC Kit（Akoya Biosiention in akoya Bioscient）上的多重肺组织的多重免疫荧光染色 ，并使用CD4
，CD8，CD19 ，CD19，CD103
，CD163，CD19 ，CD103
，CD163和GRANZYME B（GZMB）抗体（补充表12）进行多发性免疫荧光染色
。生物系统）。在60°C下烘烤FFPE组织切片（5μM），然后在60°C下烘烤2小时 ，然后在键表位置检索溶液2
，pH 9（Leica Biosystems）中自动去脱氧剂，再合化和抗原检索30分钟 。在六个周期中进行了用蛋白石和泰米酰胺信号扩增（TSA）进行免疫荧光染色
。In each cycle, the tissue was incubated sequentially with a primary antibody for 30 min at room temperature, the secondary antibody conjugated to polymeric horseradish peroxidase (HRP), an Opal fluorophore in TSA buffer, and BOND Epitope Retrieval Solution 1, pH 6 (Leica Biosystems) for 20 min at 95 °C to strip the tissue-bound primary–secondary antibody complexes在下一个染色周期之前。在与DAPI进行核对抗之后 ，使用Vectrashield硬盘防空培养基（矢量实验室）盖上载玻片
，并使用Vectra 3自动化多光谱显微镜（Akoya/Perkinelmer）使用Vectra 3.0.0.0.5的软件对每台载玻片和12-15个区域进行成像 。病理学家选择了感兴趣的区域，以20倍放大倍率进行多光谱成像（MSI） ，并使用Inform v2.4.6软件（Akoya）选择光谱
。反复的图像被导出为32位TIFF文件以进行进一步分析。 　　使用Qupath55对所有图像进行分析和可视化 。我们在所有描述的步骤中使用了最高分辨率。Qupath项目文件和其他脚本可在https://github.com/izarlab/cuimc-nyp_covid_autopsy_lung/tree/main/main/code/code/vectra_image_analysis中获得
。首先
，使用基于DAPI强度的“ WatershedCellDetection ”加载，重命名和分割图像 ，细胞膨胀为4μM。这些步骤的其他参数设置可以在“ load_and_segentation.groovy
”脚本中找到 。接下来，我们为感兴趣的六个标记创建了类和相应的分类器：CD4
，CD19，GZMB ，CD103
，CD8和CD163
。根据平均标记表达式的目视检查，自动计算并调整了每个患者的单个分类器（“分类为measurementfunction”）的阈值。如果未创建特定于患者的分类器 ，则使用带有“ _04_A6.JSON ”的分类器 。所有分类器都可以在对象分类器文件夹中作为JSON文件找到
。一旦为所有图像执行
，每个单元的各个分配都将导出到CSV文件，以进行下游分析和箱形图像。 　　使用肺部感染和其他健康供体的患者尸体肺组织的成像质量细胞术数据28 。该数据集包含来自23个捐助者的237张图像 ，其中包含664,006个单元格
，这些单元格是从36个标记的强度得出的，这些单元格的强度得出了
。所有分析均在Python v3.8.2中进行以下程序：Numpy V1.18.5 ，Scipy V1.4.1
，Tifffile 2020.6.3，NetworkX v2.5 ，Scikit-Image-Image v0.17.2，Pingouin v0.3.7和Scanpy V1.6.6.0.6.0.6.0.0.6.0。使用基于Davies-Ouldin Index57的模型选择
，使用高斯混合模型（Scikit-Learn56，0.23.0） ，将单细胞根据其强度（Scikit-Learn56
，0.23.0）的强度标记为IL-6或IL-1β的阳性 。每个注入兴趣区域（ROI）中标记阳性的细胞数量通过其面积标准化，并且在所有ROI中 ，每个疾病组和细胞类型的平均值被视为条形图
。为了评估疾病组和细胞类型的变化的重要性
，我们使用Pingouin套件（版本0.3.9）58使用了Benjamini-Hochberg FDR调整的双面Mann-Whitney U检验和调整后的P值。ROI中的代表性区域通过将信号的信号强度归一化为单位尺度，分别在第3个百分位和第98个百分位以上显示为单位尺度 。最后 ，将带有一个像素（一微米）的Sigma的高斯滤波器应用于图像。 　　用Picrosirius红色溶液（1.3％的苦味酸
，1％快速红色和1％快的绿色），将石蜡包裹的肺切片脱水 ，再水化并染色1.5 h
。使用Qcapture Suite Suite Plus（v3.1.3.10）软件上的Olympus IX71S1F-3显微镜上使用偏振光滤光片（v3.1.3.10）上的偏振光滤波器
，以4倍放大倍率进行了四到五个字段。使用Adobe Photoshop（V 11.0）对图像进行定量（Sirius红色面积/总面积的百分比） 。计算了19例Covid-19患者中的16例纤维化评分与从症状发作到死亡的天数之间的相关性，并报告了症状发作到死亡的时间
。 　　用柠檬酸pH 6进行脱瓦和再水化的石蜡包裹的肺切片的抗原检索 ，用3％BSA阻塞，并与抗αSMA-FITC（Sigma
，f37777）在4°C下孵育。与生物素-ANTI-FITC抗体（ABCAM，AB6655）一起孵育后 ，使用Vectastatin Elite ABC-HRP KIT（Vector Laboratories
，SP-2001）进行检测，并使用DAB过氧化物酶底物KIT（Vector Laboratories ，sk-4100）进行了bifciplycompastylin 。补充表12列出了所有试剂和稀释液
。分析中包括所有7张控制载玻片和17张可用的肺部。使用Leica Scanner Console软件（v102.0.7.5）使用Leica SCN400幻灯片扫描仪扫描载玻片
，并在10x倍率上使用Leica Aperio imageCope软件（v12.4.3.5008）进行量化 。 　　小鼠研究得到哥伦比亚大学医学中心（CUMC）机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准
。先前描述了POU2F3 - / - 小鼠应变59。根据机构指南，所有小鼠均在C57BL/6和129SVEV混合背景上保持在哥伦比亚大学的小鼠设施中 。该设施提供12小时的光线周期 ，室温18-23°C和40–60％的湿度
。所有动物研究均使用每组至少三只小鼠
，样本量均基于试验实验和以前的经验。将小鼠随机分配到实验中，两性的8-12周大动物的使用均等 。在实验过程中 ，研究人员并未对分配视而不见。 　　共有260个菌斑形成单位（PFU）的A/PUERTO RICO/8/1934 H1N1（PR8）病毒（PR8）病毒（来自克利夫兰梅奥诊所的Jie Sun博士的礼物）溶于40μLRPMI培养基中
，将其吸引到AnaeStheTiped Miese鼠标上，并将其液化为up鼠 ，以便他们的鼠标正常运行
。对于所有程序，使用相同体积的车辆（RPMI培养基）作为对照。 　　感染十四天后
，将小鼠安乐死并用10 ml冷PBS心铁灌注 。然后将肺与1 mL PBS灌注2 mg/ml配置I和0.5 mg/ml DNase I，并在上述5 ml的缓冲液中孵育 ，以在室温下轻轻摇动60分钟
，以消化60分钟
。去除肺叶并进行物理解离，然后通过40μm细胞滤网过滤。将细胞颗粒并重悬于1 ml叶叶RBC缓冲液中 ，然后在冰上孵育5分钟以去除红细胞 。用FACS缓冲液（5％FBS
，0.2 mM EDTA在PBS中）洗涤后，收集单细胞并用FC阻断抗体（5μg/ml）和在室温下使用活/死细胞染色套件进行免疫染色10分钟
。然后将细胞洗涤并与以下抗体孵育一小时：PE/Cyanine7抗小鼠CD45（1：100） ，FITC抗小鼠CD64（1：100）和APC抗小鼠F4/80（1：100）。在LSR II（BD
，Biosciences）上分析样品，该样品具有四个激光器（405 nm ，488 nm
，561 nm和635 nm） 。使用FlowJo软件（Treestar）分析数据
。 　　为了定量测量所示的细胞因子，使用RNeasy Plus Mini Kit（Qiagen）根据制造商的指示 ，在TRIZOL中单独均质地均质地均质地匀浆了在TRIZOL中分别均质地均质地均质地均质地均质地匀浆。使用Superscript-IV第一链合成系统（Invitrogen）合成cDNA，并将基因特异性引物与cDNA模板和ITAQ通用SYBRR Green Supermix（Bio-Rad）混合 。QPCR在CFX连接实时PCR检测系统（Bio-RAD）上进行
，总体积为20μl
。进行了三个技术和生物学重复。通过标准化小鼠的ACTB mRNA或对人的GAPDH mRNA来确定相对折叠的变化 。QPCR的引物在补充表13中列出。 　　成像和QPCR数据作为s.d的手段显示
。测量值，除非另有说明。除非另有说明 ，否则绘制单个值并代表独立的生物样品 。使用GraphPad Prism 9.0（GraphPad Software Inc.
，San Diego，CA）评估样品之间的统计差异
。低于0.05的P值被认为是显着的。 　　对于多重的免疫荧光图像 ，使用Excel 16.45（Microsoft）分别计算了每个视野的细胞分数（占父母总体总数或父母总数百分比的百分比） 。在按样品计算平均值后
，我们使用GraphPad Prism 9.0（GraphPad Inc.，CA）绘制值 ，并用S.D.将它们作为均值提出
。测量。使用GraphPad Prism 9.0（GraphPad Software Inc.
，San Diego，CA）评估样品之间的统计差异 。低于0.05的P值被认为是显着的
。 　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然研究报告摘要中获得。